实验二 霉菌产蛋白酶发酵培养基条件的确定
湖北省武汉市2023高三四月调研考试 生物试题含答案
武汉市2023届高中毕业生四月调研考试生物学试卷本试题卷共8页，24题。
全卷满分100分。
考试用时75分钟。
★祝考试顺利★注意事项：1.答题前，先将自己的姓名、准考证号填写在试卷和答题卡上，并将准考证号条形码粘贴在答题卡上的指定位置。
2.选择题的作答：每小题选出答案后，用2B铅笔把答题卡上对应题目的答案标号涂黑。
写在试卷、草稿纸和答题卡上的非答题区域均无效。
3.非选择题的作答：用黑色签字笔直接答在答题卡上对应的答题区域内。
写在试卷、草稿纸和答题卡上的非答题区域均无效。
4.考试结束后，请将本试卷和答题卡一并上交。
一、选择题：本题共20小题，每小题2分，共40分。
每小题只有一项符合题目要求。
1.利用特定的颜色反应可实现生命物质或生化反应的“可视化”。
下列叙述合理的是A.用双缩脲试剂验证蛋白酶的催化作用B.用苏丹Ⅲ染液鉴定植物细胞中的脂肪C.用NaCl溶液鉴定洋葱根尖细胞的DNAD.用斐林试剂探究温度对淀粉酶活性的影响2.外泌体是细胞主动分泌的具有膜结构的囊泡样小体。
在网织红细胞分化为成熟红细胞的过程中，释放的外泌体中含有酶、细胞因子等物质。
下列叙述错误的是A.外泌体可参与细胞间的信息交流B.外泌体的分泌体现了细胞膜的流动性C.外泌体的分泌过程不需要消耗能量D.外泌体的释放可能利于网织红细胞的分化3.孝感米酒是湖北省的传统美食，其制作流程为：糯米清洗蒸煮+酒曲（含霉菌、酵母菌等微生物）→发酵→高温煮制→灌装保存。
下列叙述错误的是A.蒸煮好的糯米需冷却后再加入酒曲，以防影响酒曲中微生物的活性B.制备好的糯米与酒曲充分混合，装满容器后进行密封发酵C.发酵时，霉菌先分泌淀粉酶进行糖化后，酵母菌才能大量繁殖D.高温煮制的目的是使糯米停止发酵并消毒杀菌4.“零落成泥碾作尘，只有香如故”，体现了生态系统中的分解作用。
下列叙述错误的是A.分解作用是通过微生物的代谢将有机物分解为无机物B.若没有细菌、真菌等分解者的分解作用，生态系统就会崩溃C.温带落叶林气温较高，其分解者的分解作用强于北方针叶林D.沼泽淤泥因缺氧导致分解作用弱，可用于开发有机肥料5.长江流域的蔬菜产区时有病虫害发生，病虫害防治效果决定着产业的兴衰。
蛋白酶产生菌的分离、鉴定及发酵条件研究
实验方案设计人：陈龙1．蛋白酶产生菌的分离1. 1 实验材料菌源：酱香型大曲1. 2 培养基的配制细菌培养基（牛肉膏蛋白胨培养基）：牛肉膏3g、蛋白胨10g、NaCl 5g、琼脂15-25g、水1000ml；称量：分别准确称取上述蛋白胨和NaCl量置于烧杯中，然后加入所需水量的2/3左右的蒸馏水；牛肉膏用玻璃棒挑取置于小烧杯或是表面皿中称量，用热水融化后倒入烧杯中。
溶化：在上述烧杯中先加少许所需要的水量，将烧杯置于石棉网上加热，用玻棒搅拌，让药品完全融化，补充水到所需的总体积。
调PH：在未调PH前，先用PH试纸预测培养基原来的PH，若偏酸用1 mol/L NaOH调节边加变搅拌，并随时用PH试纸检测至PH到7.2。
反之，用0.1 mol/LHCL进行调节。
分装、包扎、灭菌。
霉菌培养基（察氏培养基）：蔗糖30g、NaNO3 2g、K2HPO4 1g、KCL 0.5g、MgSO4.7H2O 0.5g、FeSO4 0.01g、琼脂15-25g、蒸馏水1000ml；量取所需水量约2/3左右加到烧杯中，分别称取上述物品依次逐一加入水中溶解，方法同细菌培养基。
分装、包扎、灭菌。
产蛋白酶发酵培养基：葡萄糖20g，酵母粉15g，K2HPO4 1.0g，Na2CO3 0.1g，自来水100ml PH 9.0（灭菌前）。
pH7．0。
配制方法：称取葡萄糖20g，酵母膏15g置于洁净干燥500ml锥形瓶轻轻摇动，使物料混匀，按上述配方用自来水配制无机盐溶液50ml，调节Ph 9.0,倒入装有物料的锥形瓶中混匀，在0.1Mpa压力灭菌30min。
选择培养基：豆粕粉10．0 g，琼脂15．0 g，蒸馏水1000 mL，pH7．2～7．4，112℃，灭菌30 min。
固体斜面培养基：250mL三角瓶装料12.5g麦麸，麦麸：水=1：1.2，pH自然，121℃灭菌30min。
筛选平板：牛肉膏蛋白胨培养基（配法同上）。
1. 3 试剂和溶液1.3.1 配制生理盐水：分装于250ml锥形瓶，每瓶内装99ml，并装10粒玻璃珠。
微生物实验设计-产蛋白酶菌株的筛选
微生物实验设计-产蛋白酶菌株的筛选产蛋白酶菌株的筛选级分离一、实验原理自能够产生胞外蛋白酶的菌株在牛奶平板上生长后，其菌落周围可形成明显的蛋白水解圈，水解圈与菌落直径的比值，常被作为判断该菌株蛋白酶产生能力的初筛依据。
将腐烂的大豆浸泡液中的细菌接种在含有酪素的培养基上进行培养。
由于产蛋白酶菌株能在干酪素的培养基上形成无色透明圈，因此能将产蛋白菌株分离出来，分离出来的菌株经再次培养，就可获得纯种产蛋白酶的菌株。
二、实验器材1.菌种：从大豆浸泡液中获得2.培养基:(1)PDA斜面培养基：马铃薯200g，蔗糖20g,琼脂20g,水1000ml.马铃薯去皮，切成块，煮沸半小时后用纱布过滤，再加糖及琼脂，溶化后补水至1000ml，121℃灭菌30min备用。
（2）干酪素琼脂培养基：干酪素4.0g，用20ml 0.1mol/L NaOH溶液溶解后再加20g琼脂，加蒸馏水煮沸加水至1000ml 121℃灭菌30min备用。
3.试剂：无菌水。
4.仪器：天平，电磁炉，烧杯，无菌试管，无菌培养皿，高压灭菌锅，锥形瓶，接种环，涂布棒，酒精灯，恒温培养箱。
三、实验步骤1.将腐烂的大豆放入无菌水中浸泡，制成细菌悬浮液。
2.用涂布棒蘸取菌液接种于PAD培养基中，26℃培养48h。
3.倒置于酪素琼脂培养基平板上，37℃培养24h。
4.挑取培养好的菌落接种于平板上，28℃培养48h。
5.观察各菌落周围形成的透明圈的情况。
6.选取透明圈较大的三个菌落分别接种在干酪素琼脂培养基上，28℃培养48h。
7.观察受否为单菌落，若为单菌落且有透明圈，则为纯种产蛋白酶菌株。
若有杂菌，则需要重复步骤6，直到培养出纯菌为止。
参考文献[1]代玉梅.蛋白酶高产菌株的筛选鉴定及酶学性质研究[D].青岛:青岛大学,2008.[2]黄志强,林白雪,谢联辉.产碱性蛋白酶海洋细菌的筛选与鉴定[J].福建农林大学学报:自然科学版,2006,35(4):416-420.。
蛋白酶生产菌的产酶条件研究
蛋白酶生产菌的产酶条件研究摘要：本文研究了蛋白酶生产菌的产酶条件，包括培养基、温度、pH值、氮源、碳源、微量元素等因素对蛋白酶产量的影响。
结果表明，较佳的产酶条件为：培养基为牛肉膏蛋白培养基，温度为30℃，pH值为7.0，氮源为酵母粉，碳源为葡萄糖，微量元素为FeSO4·7H2O、ZnSO4·7H2O和MnSO4·4H2O。
关键词：蛋白酶生产菌；产酶条件；培养基；温度；pH值；氮源；碳源；微量元素一、引言蛋白酶是一类水解蛋白质的酶，广泛应用于食品、医药、化妆品等领域。
目前，蛋白酶的生产主要依靠微生物发酵。
因此，研究蛋白酶生产菌的产酶条件对于提高蛋白酶产量具有重要意义。
二、实验材料和方法2.1 实验材料实验菌株为产酶能力较强的芽孢杆菌；培养基为牛肉膏蛋白培养基；氮源包括酵母粉、尿素、胰蛋白胨和硝酸铵；碳源包括葡萄糖、麦芽糖、玉米粉和淀粉；微量元素包括FeSO4·7H2O、ZnSO4·7H2O 和MnSO4·4H2O。
2.2 实验方法2.2.1 培养条件所有菌株均在37℃下保存，实验前取出，接种到液体牛肉膏蛋白培养基中，培养24小时后进行实验。
2.2.2 测定酶活力取培养液进行离心，取上清液作为酶液，用凝胶电泳法测定酶活力。
2.3 实验设计本实验采用单因素试验设计，探讨培养基、温度、pH值、氮源、碳源、微量元素等因素对蛋白酶产量的影响。
三、结果与分析3.1 培养基对蛋白酶产量的影响本实验选用了牛肉膏蛋白培养基、脱脂牛奶、酵母提取物、玉米粉和淀粉等5种培养基进行对比。
结果表明，牛肉膏蛋白培养基的蛋白酶产量最高，为1.63 U/mL，而脱脂牛奶、酵母提取物、玉米粉和淀粉的蛋白酶产量分别为0.84 U/mL、1.22 U/mL、1.09 U/mL和1.05 U/mL。
因此，牛肉膏蛋白培养基是较优的培养基。
3.2 温度对蛋白酶产量的影响本实验选用了25℃、30℃、35℃、40℃和45℃等5种温度进行对比。
2产蛋白酶菌株的筛选
1.牛奶平板培养基的配制及灭菌 牛奶平板：在普通肉汤蛋白胨
固体培养基中添加终质量浓度为 1.5%的牛奶
2.倒平板
四、操作步骤
3.制备土壤悬液 4.涂布 5.培养 6.观察记录
五、注意事项
培养基灭菌条件的控制。
六、实验结果
将菌落计数结果记录于下表中。
七、思考题
1.在选择平板上形成蛋白透明水解圈大小是否能作为 判断菌株产蛋白酶能力的直接证据？为什么？ 2.简单设计一方案，从实验中初筛得到的产蛋白酶菌 落里获得某个碱性蛋白酶的高产菌株。
产蛋白酶菌株的筛选
一、实验目的
学习用选择平板从自然界中分离胞外蛋白酶产生 菌的方法。
二、实验原理
蛋白酶在轻工、食品、医药工业中用途非常广泛。 微生物来源的碱性蛋白酶都是胞外酶，具有产酶量高， 适合大规模工业生产等优点，被认为是最重要的一类营业 性酶类。自然界筛选获取有用的微生物资源一直是微生物 学的一项重要工作。 自能够产生胞外蛋白酶的菌株在牛奶平板上生长后，其 菌落周围可形成明显的蛋白水解圈。水解圈与菌落直径的 比值常被作为判断该菌株蛋白酶产生能力的初筛依据。
三、器材1.菌株 从自然界筛 Nhomakorabea获得的蛋白酶产生菌株 2.溶液和试剂 蛋白胨，酵母粉，脱脂奶粉，琼脂，干酪素，三氯醋酸，NaOH，
Na2CO3,Folin试剂，硼砂，酪氨酸，水等 3.仪器和用品 三角烧瓶，培养皿，吸管，试管，涂布棒，玻璃搅拌棒，培养摇
床，高压灭菌锅，直尺，玻璃小漏斗和滤纸
四、操作步骤
微生物实验设计-产蛋白酶菌株的筛选
产蛋白酶菌株的筛选级分离一、实验原理自能够产生胞外蛋白酶的菌株在牛奶平板上生长后，其菌落周围可形成明显的蛋白水解圈，水解圈与菌落直径的比值，常被作为判断该菌株蛋白酶产生能力的初筛依据。
将腐烂的大豆浸泡液中的细菌接种在含有酪素的培养基上进行培养。
由于产蛋白酶菌株能在干酪素的培养基上形成无色透明圈，因此能将产蛋白菌株分离出来，分离出来的菌株经再次培养，就可获得纯种产蛋白酶的菌株。
二、实验器材1.菌种：从大豆浸泡液中获得2.培养基:(1)PDA斜面培养基：马铃薯200g，蔗糖20g,琼脂20g,水1000ml.马铃薯去皮，切成块，煮沸半小时后用纱布过滤，再加糖及琼脂，溶化后补水至1000ml，121℃灭菌30min备用。
（2）干酪素琼脂培养基：干酪素4.0g，用20ml 0.1mol/L NaOH溶液溶解后再加20g琼脂，加蒸馏水煮沸加水至1000ml 121℃灭菌30min备用。
3.试剂：无菌水。
4.仪器：天平，电磁炉，烧杯，无菌试管，无菌培养皿，高压灭菌锅，锥形瓶，接种环，涂布棒，酒精灯，恒温培养箱。
三、实验步骤1.将腐烂的大豆放入无菌水中浸泡，制成细菌悬浮液。
2.用涂布棒蘸取菌液接种于PAD培养基中，26℃培养48h。
3.倒置于酪素琼脂培养基平板上，37℃培养24h。
4.挑取培养好的菌落接种于平板上，28℃培养48h。
5.观察各菌落周围形成的透明圈的情况。
6.选取透明圈较大的三个菌落分别接种在干酪素琼脂培养基上，28℃培养48h。
7.观察受否为单菌落，若为单菌落且有透明圈，则为纯种产蛋白酶菌株。
若有杂菌，则需要重复步骤6，直到培养出纯菌为止。
参考文献[1]代玉梅.蛋白酶高产菌株的筛选鉴定及酶学性质研究[D].青岛:青岛大学,2008.[2]黄志强,林白雪,谢联辉.产碱性蛋白酶海洋细菌的筛选与鉴定[J].福建农林大学学报:自然科学版,2006,35(4):416-420.。
霉菌的固态培养
实验二霉菌的固态培养一、实验目的霉菌是多细胞真菌的代表，是典型的好氧微生物。
在酶制剂、柠檬酸、调味品等发酵工业中应用极为广泛。
最简便的霉菌培养方法便是固态培养。
本实验的目的是让学生学习米曲霉固态培养的方法，同时掌握蛋白酶测定方法。
二、实验原理1.米曲霉固态培养原理米曲霉是霉菌的一种，能产蛋白酶、淀粉酶、脂酶等多种酶，其广泛用于酱油、酱类产品的制作，形成酱油和酱类物质独特的色、香、味、体。
将纯种的米曲霉接种在麸皮培养基上，在适宜的温度和湿度下，米曲霉利用空气中的氧和麸皮中的营养成分生长繁殖，并分泌各种酶。
2.蛋白酶活力测定原理蛋白质或多肽水解后生成的含苯环氨基酸对275nm波长紫外光具有最大的吸收值。
利用蛋白酶催化酪蛋白的前后在三氯醋酸可溶物中紫外线光密度的变化，可测定酶活力的高低。
三、实验材料及仪器1.材料：麸皮、面粉、豆饼粉；米曲霉菌种；2％酪蛋白；0.4mol/L三氯醋酸；4％氯化钠等。
2.仪器：三角瓶；恒温培养箱；恒温水浴锅；紫外分光光度计；高压灭菌锅等。
四、实验过程1.工艺流程：水米曲霉菌种麸皮、面粉混合润水蒸料冷却接种三角瓶培养蛋白酶的提取米曲霉培养物第2次翻料第1次翻料蛋白酶活力的测定2.操作方法：（1）米曲霉固态培养的操作方法①配料：称取一定量的麸皮和面粉，加入50％的自来水，装入250mL的三角瓶中，用玻璃棒充分混合均匀，并用四层纱布盖在瓶口，上面再用牛皮纸包扎好。
②灭菌：将包扎好的三角瓶放入灭菌锅中，在121℃下灭菌30～40min，然后取出冷却到40℃左右。
在灭菌时注意不要造成假压。
③接种：将3～5mL米曲霉孢子悬浮液接入三角瓶中，并进行摇匀。
④培养：将三角瓶放入恒温培养箱中，控制温度在30℃左右进行培养。
培养72h后结束。
⑤观察并记录不同时期米曲霉生长的现象。
（2）酶活力的测定方法①酶液的制备精确称取米曲霉成曲（5g/L），加入100mL的4% NaCL溶液在40℃中恒温40min提取酶液，用纱布过滤除去固形物，取酶液1mL稀释到一定的浓度，再取稀释的酶液1mL进行酶活力的测定。
产蛋白酶菌的分离鉴定及产酶条件优化
产蛋白酶菌的分离鉴定及产酶条件优化王鼎;余淼;付洋洋;郭春华;彭忠利;高彦华【摘要】This research isolated protease-producing strain from cattle rumen,16 strains were selected by the casein hydrolysis bined HE value and protease activity,a strain(named A18)with the mighest activity of proteinase(415.82 U/mL)as the test strain.And it was identified as Aspergillusoryzae by morphological observation and 18S rDNA sequence analysis.We got the inoculation amount 4%,the optimum temperature 30 ℃,time 60 h through the single factor test.By th e response surface analysis(RSA)methods and repeated experiments,the optimal fermentation conditions were determined as follows:inoculation quantity 4%,temperature 29 ℃, time 55 h.The highest enzyme activity reached 527.57 U/mL,which increased by 22.6% than before optimization.%本试验菌源取自肉牛瘤胃液,首先用酪蛋白水解圈法初选出16株产蛋白酶菌株,综合HE值和蛋白酶活性,选出一株蛋白酶活性最高A18作为后续试验菌株,该菌株蛋白酶活为415.82 U/mL,通过形态和分子鉴定确定此菌株为米曲霉菌.单因素试验确定接种量为4%、培养温度为30℃、培养时间为60 h,通过响应面分析法及多次重复试验,得出接种量4%、温度29℃、时间55 h为其最佳产酶条件,最高酶活达527.57U/mL,比优化之前提高了22.6%.【期刊名称】《中国饲料》【年(卷),期】2018(000)007【总页数】6页(P14-19)【关键词】蛋白酶;米曲霉;优化;响应面法【作者】王鼎;余淼;付洋洋;郭春华;彭忠利;高彦华【作者单位】西南民族大学生命科学与技术学院,四川成都610041;成都大帝汉克生物科技有限公司,四川成都611130;西南民族大学生命科学与技术学院,四川成都610041;西南民族大学生命科学与技术学院,四川成都610041;西南民族大学生命科学与技术学院,四川成都610041;西南民族大学生命科学与技术学院,四川成都610041【正文语种】中文【中图分类】S816.3蛋白酶存在于动物、植物、微生物中，属于水解酶类，约占世界酶制剂销量的60%（马俊阳等，2014）。
一种利用真菌微生物发酵生产蛋白酶k的生产工艺
一种利用真菌微生物发酵生产蛋白酶k的生
产工艺
蛋白酶K是一种广泛应用于医药、食品、化妆品等领域的重要酶类，其生产工艺也越来越受到关注。
近年来，利用真菌微生物发酵生产蛋白酶K的工艺备受青睐，下面就来介绍一下其具体生产工艺。
首先，选用高效产酶菌株。
真菌微生物发酵生产蛋白酶K的关键是选用高效产酶菌株。
目前做得较好的产酶菌株包括曲霉、木霉、产曲霉等。
其次，确定合适的发酵条件。
合理的发酵条件有利于提高蛋白酶K 的生产效率和纯度。
通常采用液态发酵，发酵条件包括温度、pH值、转速、空气流量等，最优发酵条件需根据具体情况确定。
再次，加入适量的培养基。
培养基是微生物发酵生产过程中的营养基础，合适的培养基配方可以提高蛋白酶K的产量和纯度。
培养基的成分包括碳源、氮源、矿物质和微量元素等，其中以大豆粉、麦芽粉和葡萄糖等为碳源，以酵母粉和蛋白质为氮源，再添加一些有机和无机盐类为矿物质和微量元素，能够获得较好的生产效果。
最后，进行后处理。
真菌微生物发酵生产蛋白酶K后，需要进行后处理以提高其纯度。
后处理主要包括离心、超滤、扩散等操作步骤，其目的是去除蛋白酶K中的杂质和不纯物质，同时保留其酶活性，以便应用到不同领域。
总之，利用真菌微生物发酵生产蛋白酶K的生产工艺在实践中已经被证明是一种成功的方法，具有重要的应用价值。
在生产过程中需要遵循合理的选菌、合理的发酵条件、合适的培养基配方和有效的后处理方法，才能取得最佳的生产效果，同时也必须注意工艺安全和环保等问题。
相信随着技术的不断进步和研发的深入，真菌微生物发酵生产蛋白酶K的工艺会更加完善，为各个领域的发展带来更多的机遇。
枯草芽孢杆菌产碱性蛋白酶液体发酵培养基优化及条件的研究
枯草芽孢杆菌产碱性蛋白酶液体发酵培养基优化及条件的研究摘要：通过单因素实验在摇瓶条件下对枯草芽胞杆菌产碱性蛋白酶的液体培养基进行优化，确定了最佳碳源为糊精。
进一步在5L的发酵罐上进行发酵并对发酵过程进行控制得到以下结论：枯草芽孢杆菌产碱性蛋白酶为生长相关型发酵类型，生长周期为38h，发酵到36h时酶活达到最大，酶活最大值为433U/mL，此时pH为8.35，OD600为1.158。
可以用pH是否超过8来当作发酵终点的表观特征。
关键词：枯草芽孢杆菌液体发酵培养基优化发酵条件引言：碱性蛋白酶(Alkaline protease) 广泛存在于微生物中,最早发现在猪的胰脏中[1 ] ，1913 年Rhom 首先将胰蛋白酶作为洗涤浸泡剂使用。
1945 年瑞士的Dr. J agg 等发现了微生物碱性蛋白酶，使其成为洗涤剂的主要添加剂之一。
碱性蛋白酶在丝绸、制革工业、饲料工业、动物食品加工中也有广泛用途，如添加到动物饲料中以提高饲料利用率；用于制作海鲜调味品；用于CGM(玉米渣) 的水解，以制取玉米肽饮料；水解大豆蛋白生产大豆多肽等。
由于市场的需求，高产、高效、耐高温、耐高碱的四高型碱性蛋白酶成为国内外当前研究的热点。
枯草芽孢杆菌是生产碱性蛋白酶的传统菌株，具有产蛋白酶量大，耐高温、高碱等特点，因此对枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶的研究成为蛋白酶研究的热点[5]。
我国研究和生产的碱性蛋白酶的活力水平虽然不断提高，但大多数采用进口的碱性蛋白酶制剂，并且大规模工业生产中用的碱性蛋白酶还是主要依赖进口[6]。
本实验通过对枯草芽孢杆菌发酵培养基进行优化，并对发酵过程进行研究，以期进一步提高枯草芽孢杆菌产粗酶的活力及确定其最佳产粗酶的时间段。
1材料与设备仪器1.1菌株枯草芽孢杆菌(由实验室提供)1.2材料与试剂福林试剂、三氯乙酸（0.4mol/ L）、碳酸钠溶液（0.4mol/L）、干酪素溶液(10g/L)氢氧化钠溶液（0.5mol/L）、蔗糖、乳糖、葡萄糖、糊精、可溶性淀粉、柠檬酸钠、磷酸氢二钾、无水氯化钙。
实验二、细菌蛋白酶的发酵制备
实验二、细菌蛋白酶的发酵制备一、实验目的原理了解气升式发酵罐的结构及特点，学会使用该类型的发酵罐培养微生物。
本实验在5L 发酵罐中进行细菌培养。
通过测定菌体浓度了解细菌的生长规律，通过测定蛋白酶活力了解产物生成，分析菌体生长与产物生成的关系。
同时检测发酵过程中的溶氧、pH等。
二、材料与方法1.实验用培养基LB培养基：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物 5g/L，氯化钠10g/L，卡那霉素5mg/L，pH7.4。
0.5mg/mL抗生素溶液：称取 0.05g 卡那霉素溶于 100ml 无菌水。
小管分装后置-20℃冻存备用。
斜面培养基：配方同 LB 液体培养，调pH至7.4后添加琼脂15g/L。
三、实验过程1.种子制备250mL锥形瓶装培养基50mL，接种斜面菌种一环，于旋转摇床37℃培养12h 转速150-200转/分。
2.发酵前准1).清洗。
发酵罐培养前后进行清洗（空气分布器、管内壁、顶板放零件的小间隙），外壁、底板、顶板擦干净。
2).连接。
进行发酵之前要对发酵系统（蒸汽发生器管路、空气压缩系统、冷却系统、发酵流加系统及在线控制系统）进行调试。
主要工作是检查通气与通水管道的连接正确与否、管道是否破损、空压机能否正常工作、在线控制系统能否正常工作。
发酵罐中配置用于供给冷却水、循环水及排水的管子。
空压机空气供给的配管。
连接发酵罐、PH 控制器、DO 控制器等电源。
注意不漏电和接错线。
3).试剂。
配置培养基、酸碱平衡液、消泡剂等。
3.电极标定3.1 pH 电极标定pH 电极零点和斜率要在进行灭菌以前进行，电极在使用前先用蒸馏水清洗并检查电极信号有无故障，然后再进行标定。
一般而言如果发酵液偏酸性我们用6.86 和4.00 的缓冲液，如果偏碱性则配制6.86 和9.18 的缓冲液。
点击控制器屏幕画面下方的“标定”，弹出标定菜单，选择相应罐（F1-F4）下的“pH 电极”，弹出相应的pH 电极标定界面。
先进行零点标定，以酸性为例，将pH 电极联好电极线用蒸馏水洗净后插入pH6.86 的标准液中，点击“零点值”，输入6.86，然后点击“开始”，待采样值完全稳定后点击“结束”。
发酵工程实验指导书
发酵工程实验指导书————————————————————————————————作者：————————————————————————————————日期：发酵工程实验指导书辽宁石油化工大学环境与生物工程学院主编《发酵工程》实验指导书实验学时：24学时适用专业：生物工程生物技术是当前优先发展的高新技术之一，本课程是为了和生物工程专业理论教学相配合，通过实践教学，培养学生对生物工程专业知识的具体实际应用的能力。
发酵工程实验是以实验操作为主的技能课程，是生物工程专业学生的必修课，是在学生学习了《生物化学及实验》、《微生物学及实验》等专业基础课及专业实验课的基础上开设的，课程目的在于通过本课程的实验训练，使学生对整个微生物生产过程有一个全面的认识和理解，既可培养他们实际操作的技能，又可达到提高他们理论联系实际能力的目的。
通过学习，使学生能掌握发酵工程常用的实验方法和常见的发酵工程设备，为以后的学习和科研工作打下良好的基础。
本实验指导书包括：实验一、细菌增殖曲线的测定（6学时）实验二、土壤中放线菌的分离与纯化（6学时）实验三、发酵菌株的初筛实验四、枯草芽孢杆菌的紫外线诱变选育（6学时）（必做）实验五、淀粉酶的固态发酵（6学时）实验六、发酵过程中糖的利用（6学时）实验七、玉米淀粉液化和糖化（6学时）实验八、淀粉酶的固定化生产（6学时）实验九、摇床培养确定酵母菌体的培养和营养条件（6学时）（必做）实验十、小型连续发酵实验（6学时）实验十一、甜酒酿的制作（6学时）备注：实验一至实验七为基础实验，实验八至实验十一为设计性和综合性实验，除必做实验外，其他可选做。
实验总时间为24学时，包括设计实验、准备实验、进行实验、书写实验预习及最终报告及所需仪器药品清单等。
实验一发酵菌株的初筛一、实验目的与要求目的：1、从已分离到的细菌或真菌中筛选出能产生生理活性物质的菌株。
2、学习淀粉酶、蛋白酶产生菌的筛选方法。
要求：1、复习微生物学及实验过程所学到的微生物培养的方法和过程，了解影响微生物生长各种条件因素。
霉菌发酵产酶流程
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酵母菌表面展示操作步骤中的培养条件设定
酵母菌表面展示操作步骤中的培养条件设定酵母菌表面展示是一种重要的分子生物学技术，用于在酵母菌表面展示外源蛋白质。
这种技术可以用于研究蛋白质的功能、交互作用以及抗原表位的鉴定等。
在进行酵母菌表面展示实验时，设定适当的培养条件非常重要，下面将为您介绍一些常用的培养条件设定步骤。
1. 培养基选择：选择适合酵母菌生长的培养基。
常用的培养基包括YPD培养基（酵母提取物、蛋白胨和葡萄糖的混合物）和SD培养基（缺乏氨基酸和碳源的培养基）。
另外，还可以根据实验需要添加对应的营养物质，如有需要可添加适量的抗生素筛选。
2. 培养温度设定：酵母菌一般在30°C下培养。
如果需要进行过表达蛋白的酵母菌的培养，则可以降低培养温度至20°C。
培养温度的选择应取决于所研究蛋白质的最适生长条件。
3. pH设定：pH值是培养条件的重要参数之一。
酵母菌一般在pH 5-7的条件下生长。
在实验中，可以根据所研究蛋白质的最适生长条件来调整培养基的pH值。
4. 搅拌速度：对于酵母菌表面展示的培养过程，适当的搅拌速度可以提高酵母菌的生长和蛋白表达。
常用的搅拌速度为150-200rpm，但也可以根据实验需要进行调整。
5. 培养时间：培养时间的长短取决于所研究蛋白质的表达情况。
一般来说，培养时间应至少为48小时，以保证酵母菌能够充分生长和表达外源蛋白。
6. 培养体积：培养体积的选择应取决于研究需求。
如果需要大规模表达蛋白，则需要选择大容量的培养体积。
通常，培养液的体积不宜超过容器容积的1/3。
7. 氧气供应：酵母菌是好氧生物，因此充足的氧气供应对于其生长和表达外源蛋白非常重要。
可以通过适当的搅拌和通气来提供足够的氧气。
8. 原代菌种的选择：在进行酵母菌表面展示前，通常需要从冷冻甘油保存的菌种中提取出活菌。
选择适当的培养条件，如培养基和温度等，对于原代菌种的复苏和培养非常重要。
以上是酵母菌表面展示操作步骤中的常见培养条件设定步骤。
蛋白酶的发酵及酶活力测定实验报告
蛋白酶的发酵及酶活力测定实验报告学院：生物科学与工程学院专业：生物技术班级： 1班姓名：学号：摘要：蛋白酶是一类重要的工业用酶，广泛应用于食品、医药、洗涤剂、皮革、酿酒等行业。
当前，食品工业用酶主要来自微生物，尤其是蛋白酶的应用最为广泛。
作为一种生物催化剂,它具有催化反应速度快,无工业污染,催化反应条件适应性宽等的性质和优点。
由于从植物和动物中生产蛋白酶具有的局限性,为了满足当今世界市场的需要,人们越来越多地把目光投到微生物蛋白酶上[2] 。
微生物由于具有生长速度快、所需生长空间小、广泛的生化多样性及其遗传可操作性等特点,因而备受人们青睐。
本文主要进行了菌种的生长曲线的绘制与菌种最佳发酵产酶时间等方面的研究。
关键字：蛋白酶生长曲线酶活力第一章前言1.1研究的目的与意义蛋白酶是工业酶中用得最多的一种酶，是催化蛋白质肽键水解的一类酶,它作用于蛋白质,将其分解为蛋白胨、多肽及游离氨基酸[1] ，约占酶总量的 60%，其中碱性蛋白酶就占25%。
有调查显示，酶制剂市场量最大的是洗涤剂用酶，第二位是淀粉加工用酶，以后依次为乳制品加工业、制酒工业、纺织工业和饮料加工业等用酶[2]。
与动、植物来源的蛋白酶相比，利用微生物产的蛋白酶有易于培养、生长快、产量高、易于提取，适于大规模工业化生产，培养基的成本相对较低等优点，使微生物成为生产蛋白酶的重要来源和首选材料。
1.2 国内外研究概况1.2.1 微生物蛋白酶的分类由于从植物和动物中生产蛋白酶具有的局限性,为了满足当今世界市场的需要,人们越来越多地把目光投到微生物蛋白酶上[3]。
当前工业用酶主要来源于微生物，微生物来源的蛋白酶按其作用的 pH 值的不同可分为三类，即碱性蛋白酶、中性蛋白酶及酸性蛋白酶，它们作用的最适 pH 值分别为碱性、中性及酸性。
1.2.2在食品工业中的应用蛋白酶在食品工业上的应用主要是用在制干酪，蛋白质水解调味液，烤焙食品，肉类嫩化，功能性低聚肽和阿斯巴甜的合成等。
蛋白酶实验
实验（内容）题目：蛋白酶产生菌的筛选及培养的优化院系生命科学技术学院专业生物技术年级2015级生物技术1班专升本蛋白酶产生菌的选育及发酵培养条件的优化一、实验目的1、学习从土壤中分离蛋白酶产生菌。
2、握分离纯化的方法，分离获得并纯化蛋白酶产生菌。
3、握正交优化的方法和步骤。
二、实验原理许多细菌和霉菌产生蛋白酶，细菌中的芽孢杆菌是最常见的蛋白酶产生菌。
本实验将土壤样品悬液加热处理，杀死非芽孢细菌及其他微生物后进行划线分离得到芽孢杆菌，将其接种到奶粉培养平板并进行培养，根据奶粉平板的水解圈做初筛。
将初筛的蛋白酶产生菌接入产酶培养基振荡培养，测定蛋白酶的活力，最终得到产蛋白酶的芽孢杆菌。
也可直接将细菌接种到奶粉培养平板进行培养，分离筛选其他蛋白酶产生菌。
三、实验器材1、材料：土壤样品2、试剂：牛肉膏蛋白胨培养基及平板、奶粉培养基及平板、45mL 无菌水（带玻璃珠）、芽孢染色液、 3、仪器及用具：紫外分光光度计、显微镜、恒温水浴锅、摇床、酒精灯、接种针、游标卡尺、无菌移液管、无菌试管、量筒、容量瓶、漏斗、试剂瓶、漏斗、载玻片、滤纸、擦镜纸。
四、实验步骤（一）配制所需培养基1、牛肉膏蛋白胨固体培养基：牛肉膏 0.5g，蛋白胨 1g，NaCl 0.5g，琼脂 1.5～2.0g，水 100ml，pH 7.22、奶粉培养基：牛肉膏 0.5g，蛋白胨 1g，NaCl 0.5g，琼脂 2.0g，水 100ml，pH 7.0～7.2 脱脂奶粉 3g，3、牛肉膏蛋白胨液体培养基：牛肉膏 0.5g，蛋白胨 1g，NaCl 0.5g，水 100ml，pH 7.24、发酵培养基：葡萄糖6.0g,硝酸钠4.0g，磷酸二氢钾0.03g,碳酸钠0.1g,磷酸二氢钠0.4g加水100ml（二）分离1、采集土壤样品，用无菌制备1:10土壤悬液。
2、取1:10土壤悬液5 mL，注入已灭过菌的试管中，将此试管放入75～80℃水浴中热处理10min以杀死非芽孢细菌。
蛋白酶发酵培养基及发酵条件的研究
图0 接种量对产酶的影响
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（A ） $ % % "= > 6 ? ! %@ > ? * > B 5 6 ; 2
研究报告
进行了 #$ 罐的放大实验， 最终使其发酵单位 达到% ／ & # ’ ( ) * $。该生产水平已达到国际大 型酶制剂公司所报道的水平， 为其工业化生产 奠定了基础。
图* 种龄对产酶的影响
$ , $ , ! 接种量对产酶的影响 分别以1、 $ 1、 ! 1、 + 1的接种量将培养 $ . 的种子培养液转接于 ! %’ / 发酵培养基， ／ ， 摇床振荡培养 + ， 测定粗酶 ! " #， $ % % & ’ ( ) " . 液酶活 力， 结果见图0 。由 图 可 见， 接种量为 菌株酶产量最高。 $ 1时， $ , $ , " 装液量对产酶的影响 在$ + %’ / 三角瓶中分别装入! %’ /、 " % + %’ /、 * %’ /、 0 %’ / 的发酵培养基， ! " #， ’ /、 ／ ， 摇床振荡培养 + 测定发酵液 $ % % & ’ ( ) " . 后， 的酶活力， 结果如图 2 所示。可见， 装液量为
图2 装液量对产酶的影响
图+ 种子生长曲线
! " # 优化条件下的摇瓶发酵及发酵过程曲线 采用最适发酵培养基 （ ／ ： 棉籽饼 % %’ /） 3 粉 （2 ， 酵母浸粉 ， 麦芽糊精 （! % 目） ! , 0 + "! ， 柠檬酸钠 % ， ， ； ! % 1） % , ! 4 5 4 6 , ! 7 8 9 : $% $ "并采用最适发酵条件： 种龄 ， 接种量 $ $ . 1， 装液 量 + ／ 摇床转速 $ ／ ， %’ / $ + %’ /， % % & ’ ( ) 发酵 + ， 碱性蛋白酶的发酵单位可达 ! " #， ". ／ 比优化前的发酵单位$ ／ ! ! ; 2 + < ’ /， $ % % % < ’ / 提高了 + 实验中还对发酵过程 " , " 2 1。另外， 中的菌体核酸量及粗酶液酶活力进行了测定， 并绘制了发酵过程曲线 （图; ） 。
实验报告二 产酶微生物的分离、纯化与选育
产酶微生物的分离、纯化与选育实验目的1、学习从自然界中分离蛋白酶产生菌并纯化；2、通过实验观察紫外线和亚硝基胍等理化因素对微生物的诱变效应，并掌握基本方法；实验原理许多细菌和霉菌产生蛋白酶，细菌中的芽孢杆菌是常见的蛋白酶产生菌。
本实验将土壤样品（或其他样品）悬液加热处理，杀死非芽孢细菌及其他微生物后进行划线分离得到芽孢杆菌，将其接种到酪蛋白平板进行培养，根据酪蛋白平板的水解圈作初筛。
也可直接将细菌或霉菌接种到酪蛋白平板进行培养，分离筛选其他蛋白酶产生菌。
基因突变可分为自发突变和诱发突变。
许多物理因素、化学因素和生物因素对微生物都有诱变作用，这些能使突变率提高到自发突变水平以上的因素称为诱变剂。
紫外线（UV）是一种最常用的物理诱变因素。
它的主要作用是使DNA双链之间或同一条链上两个相邻的胸腺嘧啶间形成二聚体，阻碍双链的分开、复制和碱基的正常配对，从而引起突变。
紫外线照射引起的DNA损伤，可由光复活酶的作用进行修复，使胸腺嘧啶二聚体解开恢复原状。
因此，为了避免光复活，用紫外线照射处理以及处理后的操作应在红光下进行，并且照射处理后的微生物放在暗处培养。
试剂距离地面十公分的土壤、酪素培养基实验器材恒温培养箱、恒温水浴锅、酒精灯、培养皿×8、试管×11、玻璃棒、移液管、量筒、三角瓶、烧杯、滴管、涂布器、血细胞计数板、移液枪、显微镜、紫外线等（15W）、磁力搅拌器、台式离心机、震荡混合器等实验方法与步骤1、酪素培养基的配置：牛肉膏3g、NaCl 5g，酪素 10g，琼脂 20g，水1000mL， pH 7.6-8.0。
配制方法：称取酪素4g，先用少量2%NaOH润湿，玻璃棒搅动，再加适量的蒸馏水，在沸水浴中加热并搅拌，至完全溶解，补足水量至1000mL，加入其他成分，调整pH值，灭菌备用。
2、菌悬液的制备取土壤20g，加水200ml，即梯度为10ˉ1的菌悬液，取1ml10ˉ1的菌悬液，加9ml的蒸馏水，即梯度为10ˉ2的菌悬液，按上述的方法步骤制作梯度为10ˉ3、10ˉ4、10ˉ5的菌悬液。
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实验二雅致放射毛霉产蛋白酶培养基本的确定
1、种子培养基（实验老师准备4个100ml种子）
培养基组成：
100ml：豆粕粉3g，饴糖0.5g，酵母膏0.1g，MgSO40.2g，KH2PO40.2g。
高压灭菌锅，121℃，20min灭菌。
灭菌操作完毕，将上述物品并洗耳球转入超净台，接种前20min进行紫外空气灭菌。
接种前4小时从冰箱取出1支菌种，在25℃条件下活化。
在超净台内，以无菌生理盐水洗涤菌种斜面。
孢子悬浮液以每瓶10ml的接种量，接入种子培养基。
从超净台取出接好的种子三角瓶，转入摇床，在28℃、250rpm的条件下培养14～16小时，至种子瓶内呈粘稠浆糊状为止。
2、产酶培养基确定（学生确定，每组做三瓶，250ml三角瓶中装100ml培养基）
2.1培养基的配制，每班分六组，各组分别选择以下六种培养基配方：
（1）基础培养基：（100ml）豆粕粉3g，蔗糖0.8g，酵母膏0.1g，MgSO4 0.36g，KH2PO4 0.12g，CaCl2 0.1g。
（第一组）
（2）第二组，将基础培养基中蔗糖按成等例葡萄糖；
（3）第三组，将基础培养基中蔗糖按成等例马铃薯淀粉；
（4）第四组，将基础培养基中去掉酵母膏；
（5）第五组，将基础培养基中去掉豆粕粉，并将酵母膏添加量增至0.5％。
（6）第六组，将基础培养基中去掉MgSO4和CaCl2。
2.2培养基灭菌
高压灭菌锅，121℃，20min灭菌。
冷却至室温，将上述物品并洗耳球转入超净台，接种前20min进行紫外空气灭菌。
2.3接种
冷却到室温开始接种，接种量10％，然后在在28℃、250rpm的条件下培养18小时，至发酵液颜色变深、澄清为止。
2.4蛋白酶活力测定
根据各组测定酶活结果，比较确定最适培养基组成。
（1）定义：1 g固体酶粉，在一定温度和pH值条件下，1 min水解酪素产生1 ug酪氨酸为一个酶活单位，以u/g表示。
（2）原理：蛋白酶在一定温度与pH条件下，水解酪素底物，然后加入三氯乙酸终止酶反应，并使未水解的酪素沉淀除去，滤液对紫外光有吸收，可用紫外分光光度法测定。
根据吸光度计算其酶活力。
（3）试剂和溶液
①三氯乙酸c（CCl3.COOH）=0.4 mol/L：称取三氯乙酸32.7 g，用水溶解并定容至500 mL
②磷酸缓冲溶液（pH=7.5）适用于中性蛋白酶：称取磷酸氢二纳（Na2HPO4·12H2O）3.01 g
和磷酸二氢纳（NaH2PO4·2H2O）0.25 g，加水溶解并定容至500 mL。
③ 100 ug/mL L—酪氨酸标准溶液：
a.称取预先于105 ℃干燥至恒重的L-酪氨酸0.100 g，精确至0.001 g，用1 mol/L盐酸
60 mL溶解后定容至100 mL，即为1 mg/mL酪氨酸标准溶液。
b.吸取1 mg/mL酪氨酸标准溶液10.00 mL，用0.1 mol/L盐酸定容至100 mL，即得到
100 ug/mL L—酪氨酸标准溶液。
④ 10 g/L酪素溶液：称取酪素1.000 g，精确至0.001 g，用少量0.5 mol/L氢氧化钠湿润后，
加入适量的缓冲溶液约80 mL，在沸水域中边加热边搅拌，直至完全溶解，冷却后，转入100 mL容量瓶中，用缓冲溶液稀释至刻度。
⑤待测酶液：1ml发酵液稀释5倍。
（1个试管）
（4）分析步骤
①求K值（K取135）
②测定
a. 先将酪素溶液放入（40±0.2）摄氏度恒温水域中，预热5 min；
b. 按下列程序操作：
试管A（空白）（第二试管）试管B（酶试样，作三个平行样）（第三试管）
↓ ↓
加酶液2.00 mL （移液管2ml）加酶液2.00 mL
↓（40±0.2℃），2 min ↓（40±0.2℃），2 min 加三氯乙酸4.00 mL（摇匀）（移液管5ml）加酪素2.00 mL（摇匀）↓（40±0.2℃），10 min ↓（40±0.2℃），10 min 加酪素2.00 mL（摇匀）（移液管2ml）加三氯乙酸4.00 mL（摇匀）↓ ↓
取出静止10 min，过滤（第四试管，小漏斗）取出静止10 min，过滤
↓ ↓
在275 nm波长下，用10 mm 在275 nm波长下，用10 mm
比色皿测其吸光度比色皿测其吸光度
（5）计算（=135）
X=A×K×8/2×1/10×n×E=2/5×A×K×n×E
式中X——样品的酶活力（u/g）A——试样溶液的平均吸光度
K——吸光常数（K=135）8——反应试剂的总体积（mL）
2——吸取酶液2.00 mL，以1 mL计1/10——反应时间10 min，以1 min 计
n——稀释倍数E——紫外法与福林法的换算系数（取0.50）。