crispr-cas9基因敲除
cas9基因敲除原理
cas9基因敲除原理
CRISPR-Cas9是一种基因编辑技术，可以通过切割DNA序列
来实现基因敲除。CRISPR是“Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats”的缩写，是一种天然存在于细菌和
古细菌中的免疫系统。Cas9则是CRISPR-Cas9系统中所使用
的酶。
CRISPR-Cas9系统通过三个主要组件来实现基因敲除：CRISPR RNA（crRNA），tracrRNA和Cas9。首先，crRNA
和tracrRNA结合形成一个复合体，被称为单导螺旋RNA （sgRNA）。sgRNA可以与Cas9酶结合，并引导Cas9 酶与
特定DNA序列中的目标基因相结合。
当Cas9与sgRNA定位到目标基因的特定序列时，它会切割DNA，导致基因序列中的断裂。细胞会试图修复这个断裂，
但通常会导致不完整的修复，从而引起基因缺失或突变。这就实现了基因敲除的目标。
此外，通过供应外源的DNA修复模板，可以利用Cas9的断
裂修复机制来进行目标基因的修复。这种方法被称为基因敲入，可以在目标基因上插入新的基因组成部分。
总而言之，CRISPR-Cas9系统利用Cas9酶和sgRNA的组合，定位和切割特定的DNA序列，实现了基因敲除和敲入的目标。这项技术在基因研究和治疗领域有着广泛的应用前景。
cas9基因敲除位点
cas9基因敲除位点
Cas9基因敲除位点是指在基因组中选择合适的位置，通过使用CRISPR-Cas9系统来实现基因敲除。CRISPR-Cas9是一种基因编辑技术，可以精确地修改基因组中的特定位点。
要选择合适的Cas9基因敲除位点，需要考虑以下几个方面：
1. 目标基因的功能：确定需要敲除的目标基因的功能和作用，确保敲除该基因对研究或应用的影响。
2. 位点选择：选择一个适合的Cas9敲除位点，通常选择位于目标基因编码区域内的外显子区域，以确保有效敲除目标基因。
3. 效率和特异性：选择能够高效且特异性地敲除目标基因的Cas9位点，避免对其他非目标基因的无意义敲除。
4. 引物设计：设计引物用于引导Cas9与目标位点结合，通常需要选择20个核苷酸序列用于引导RNA的合成。
5. 评估和验证：通过实验验证Cas9基因敲除位点的敲除效果，并进行相应的分析和鉴定。
总之，在选择Cas9基因敲除位点时，需要综合考虑目标基因的功能、位点选择、效率和特异性、引物设计以及实验验证等因素，确保高效和准确地实现基因敲除。
cas9 构建基因敲除细胞系 步骤
cas9 构建基因敲除细胞系步骤
1. 设计gRNA序列
需要设计合适的gRNA（guide RNA）序列。gRNA是一种由RNA和DNA组成的分子，在CRISPR-Cas9系统中起到引导Cas9蛋白识别和切割目标DNA的作用。gRNA序列应当与目标基因的特定区域互补，并且要避免与其他基因的序列相互匹配。
2. 合成gRNA和Cas9蛋白
合成设计好的gRNA序列，并将其与Cas9蛋白结合。Cas9蛋白是CRISPR-Cas9系统中的核酸酶，能够与gRNA一起识别目标DNA 序列，并在其靶向区域引发双链断裂。
3. 转染细胞
将gRNA和Cas9蛋白复合物转染到目标细胞中。转染可以使用多种方法，如化学法、电穿孔法或病毒载体介导的转染等。转染后，gRNA和Cas9蛋白会进入细胞质，并寻找目标基因。
4. 筛选敲除细胞系
根据需要敲除的基因，选择适当的筛选方法来鉴定敲除细胞系。常用的筛选方法包括PCR、Western blot和细胞克隆等。通过这些方法，可以检测到目标基因的敲除情况。
5. 确认敲除细胞系
对筛选出的细胞系进行进一步的确认。可以使用DNA测序技术对目标基因的敲除位点进行测序验证。此外，还可以通过功能实验来验证目标基因的敲除效果。
6. 存储和维护敲除细胞系
成功敲除目标基因后，需要对敲除细胞系进行存储和维护。细胞系应当保存在液氮中，以确保其长期保存和使用的稳定性。同时，细胞系也需要定期培养和检测，以确保其生长状态和敲除效果。
以cas9构建基因敲除细胞系的步骤包括设计gRNA序列、合成gRNA和Cas9蛋白、转染细胞、筛选敲除细胞系、确认敲除细胞系以及存储和维护敲除细胞系。这些步骤需要在实验室中进行，确保操作的准确性和稳定性。基因敲除细胞系的建立为研究基因功能和疾病机制提供了有力的工具，对于深入理解生命活动和疾病发生发展具有重要意义。
大肠杆菌CRISPR-Cas9系统基因敲除简介
1CRISPR-Cas系统的研究进展
CRISPR(clustered regularly interspaced short palindromic repeats)，即串联的、间隔的短回文重复序列，最早在1987年研究大肠杆菌的碱性磷酸酶基因时被发现[1]。随后在细菌和古细菌的基因组中也发现大量存在CRISPR，研究证实它能够保护自身抵御外来病毒和质粒的入侵[2]，作用机制是依靠crRNA(CRISPR RNA)和tracrRNA(trans-activating crRNA)结合并引导Cas蛋白对外源DNA进行特异性降解[3]。已发现的CRISPR-Cas系统有三种类型：Ⅰ型，Ⅱ型和Ⅲ型，其中以Ⅱ型最为简单，只需一种Cas蛋白，即通过RNA 介导核心蛋白Cas9识别并切割靶序列，引起DNA双链断裂[2]。
受自然界中CRISPR-Cas系统的启发，主要对来自于化脓性链球菌(Streptococcus pyogenes)的Ⅱ型CRISPR-Cas系统进行人为改造和利用，目前已经将其发展成为一种新型的基因编辑技术，实现基因敲除、插入、定点突变和组合编辑[4]，并成功应用于大肠杆菌、酿酒酵母、家蚕、果蝇和人类细胞等[5]。和传统的基因编辑技术相比，这一新技术具有成本低、操作简便、效率高的优点[6]。
2 CRISPR-Cas系统的组成与机制
典型的Ⅱ型CRISPR-Cas系统基因座包含tracrRNA基因、Cas蛋白编码基因(cas9、cas1、cas2和csn2)、CRISPR基因座（引导序列、间隔序列和重复序列）这三个部分[6]。
细胞敲除基因
细胞敲除基因
细胞敲除基因是指通过基因编辑技术，利用CRISPR/Cas9系统或其他工具将目标基因从细胞中“剪切”掉，从而实现基因敲除。这项技术可用于研究基因功能、疾病治疗等领域。
细胞敲除基因的方法一般分为两种：一是将CRISPR/Cas9系统导入到靶细胞中，通过设计合适的sgRNA靶向目标基因的剪切位点，使Cas9蛋白与sgRNA结合并切割目标基因，从而使其失去功能；二是利用RNA干扰技术，通过引入特定的siRNA或shRNA，干扰目标基因的表达，从而实现基因敲除。
细胞敲除基因技术广泛应用于基因功能研究、疾病模型建立以及基因治疗等领域。例如，在基因功能研究中，通过敲除特定基因观察其对细胞生长、分化、代谢等的影响，可以帮助研究人员深入了解基因功能；在疾病模型建立中，通过敲除与某些疾病相关的基因，可以构建相应的动物模型，为疾病研究提供便利；在基因治疗中，通过敲除某些病因基因，可以有效治疗某些遗传性疾病。
然而，细胞敲除基因技术也存在一些挑战和局限性。例如，在敲除多个基因时，可能会出现副作用或误差；在敲除在多个细胞中共同发挥作用的基因时，可能会导致不可预测的结果。因此，研究人员需要仔细设计实验方案，并结合其他技术手段进行验证，以确保实验结果的准确性和可靠性。
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CRISPRCas9基因敲除细胞株详细构建流程
CRISPRCas9基因敲除细胞株详细构建流程
Puro 抗性浓度摸索实验
将细胞如下图1稀释。给药7天后，弃培养液，用台盼蓝染色2 min，显微镜下观察细胞存活情况。确定细胞多克隆细胞筛选和单克隆细胞筛选浓度。
图1 抗性浓度摸索
单克隆形成验证实验
细胞计数，将细胞悬液稀释混匀后加入96孔板，用封口胶将孔板封好，放于培养箱中培养。静置培养48 h后每日观察并记录单克隆形成情况。
sgRNA 靶标设计
根据基因序列信息，设计 sgRNA。
靶标位点序列信息确认
PCR扩增（图2），测序验证基因序列，以确定sgRNA区域有无SNP。
图2 靶标序列扩增
sgRNA克隆引物合成
根据sgRNA设计sgRNA克隆引物。
lentiCRISPRv2-sgRNA载体构建
退火，连接，转化，涂板（LB/Amp）培养。
lentiCRISPRv2-sgRNA载体验证
每个实验组各挑取6个单克隆菌落，于LB/ Amp培养基中扩增，提取质粒，琼脂糖凝胶电泳检测质粒抽提效果（图3）。
图3 质粒抽提
酶切验证：取3个单克隆进行酶切，琼脂糖凝胶电泳检测酶切效果（图4）。选择2个样品送样测序。
图4 单克隆酶切验证
病毒包装
lentiCRISPRv2-sgRNA无内毒素质粒提取，病毒包装。
细胞转染
配制梯度病毒稀释液，细胞于培养箱中静置培养48h。
阳性单克隆细胞株筛选
细胞转染48h后，更换完全培养基，筛选至对照组大部分细胞死亡，实验组细胞扩大培养，进行单克隆筛选。几天后挑选阳性单克隆进行扩增，并取样验证。
阳性单克隆细胞株验证
测序验证阳性单克隆细胞株的基因序列，以确定是否敲除成功。
Biomics_CRISPR_Cas9_基因敲除技术
CRISPR/Cas9 基因敲除技术
CRISPR （ClusteredRegularlyInterspacedShortPalindromicRepeats）RNA，是最近几年才发现的原核生物中的调控RNA，用以抵御病毒和质粒入侵。在II型CRISPR系统中，CRISPR RNA（crRNA）与转录激活crRNA（Trans-activating crRNA, tracrRNA）退火形成的复合物能特异识别基因组序列，引导Cas9核酸内切酶在目的片段生成DNA双链断裂（double-strand breaks, DSBs）。CRISPR-Cas系统的高效基因组编辑功能已被应用于多种生物，包括人、小鼠、大鼠、斑马鱼、秀丽隐杆线虫、植物及细菌。多个科研小组的研究都显示，与锌指核酸酶（ZFNs）和转录激活样效应核酸酶（Transcription activator-like effector nucleases, TALEN）相比较，CRISPR-Cas系统介导的基因组靶向实验在真核细胞中具有相似甚至更高的效率。
Biomics专注于RNA基因调控多年，最新推出基因组编辑工具CRISPR/Cas9专家系统，该系统灵活简单、可以对特定基因组位点进行切割置换，特异性高、细胞毒性低。CRISPR/Cas9系统可广泛应用于基因组工程，如基因抑制，基因敲除，基因敲入，基因修复等。CRISPR-Cas9体系的RNA-DNA识别机制为基因组工程研究提供了一项简便而强大的工具。其最重要的优势是Cas9蛋白可在多个不同的gRNA的引导
CRISPR Cas9基因敲除技术的原理简介
CRISPR Cas9基因敲除技术的原理简介CRISPR/Cas9 基因敲除原理介绍
CRISPR (clustered, regularly interspaced, short palindromic re peats)是一种来自细菌降解入侵的病毒 DNA 或其他外源 DNA 的免疫机制。在细菌及古细菌中，CRISPR系统共分成3类，其中Ⅰ类和Ⅲ类需要多种CRISPR相关蛋白（Cas蛋白）共同发挥作用，而Ⅱ类系统只需要一种Cas蛋白即可，这为其能够广泛应用提供了便利条件。
目前，来自Streptococcus pyogenes 的CRISPR-Cas9系统应用最为广泛。Cas9 蛋白（含有两个核酸酶结构域，可以分别切割DNA 两条单链。Cas9首先与crRNA及tracrRNA结合成复合物，然后通过PAM序列结合并侵入DNA，形成RNA-DNA复合结构，进而对目的DNA双链进行切割，使DNA双链断裂。
由于PAM序列结构简单（5’-NGG-3’），几乎可以在所有的基因中找到大量靶点，因此得到广泛的应用。CRISPR-Cas9系统已经成功应用于植物、细菌、酵母、鱼类及哺乳动物细胞，是目前最高效的基因组编辑系统。
通过基因工程手段对crRNA和tracrRNA进行改造，将其连接在一起得到sgRNA（single guide RNA）。融合的RNA具有与野生型RNA类似的活力，但因为结构得到了简化更方便研究者使用。通过将表达sgRNA的原件与表达Cas9的原件相连接，得到可以同时表达两者的质粒，将其转染细胞，便能够对目的基因进行操作。
CRISPR-Cas9精细原理：基因敲除、点突变、基因插入
1.3 CRISPR-CAS 系统的作用机理
CRIPSR 基因座的表达 (包括转录和转录后的成熟 加工)
当该噬菌体再次入侵细 菌时，CRISPR 簇首先转录 为长的crRNA前体，然后逐 步被加工成小的成熟的 crRNA。 CRISPR/Cas 系统活性的 发挥或者是对外源遗传物 质的干扰
crRNA 结合相关的Cas 蛋白后，形成crRNA-Cas 蛋白复合体，通过碱基互 补配对精确地与目标DNA相 结合，随后Cas 蛋白对目 标DNA 进行断裂和降解。
CRISPR-Cas9大全：
基因敲除、点突变、基因插入
1. CRISPR-Cas系统简介
1.1 CRISPR-Cas系统的研究历史
1987 年，日本课题组在K12 大肠杆菌的碱性磷酸酶基因附近发现串联间 隔重复序列，随后发现其广泛存在于细菌和古细菌的基因组中，2002 年， 正式将其命名为成簇的规律间隔的短回文重复序列
2013 年初，MIT 的研究组首次利用CRISPR/Cas9 系统对人293T 细胞 EMX1 和PVALB 基因以及小鼠Nero2A 细胞Th 基因实现了定点突变。同 年Mali 利用CRISPR/ Cas9 在人293T 细胞和K652 细胞基因的靶位点形成 双链或单链的切口，从而激活细胞的DNA 修复机制高效介导外源基因定 点插入。
1.2CRISPR-Cas系统的结构 CRISPR-CAS 系统的组成主要包括: 由不连续的重复序列
cas9基因敲除位点
cas9基因敲除位点
Cas9是一种CRISPR-Cas9系统中的关键酶，能够实现基因编辑和基因敲除。
基因敲除是指通过编辑基因组，使得目标基因失去功能或被完全删除。Cas9基因
敲除位点是指通过Cas9酶的作用，准确地找到并编辑基因组中目标基因的特定位点。
在CRISPR-Cas9系统中，Cas9酶与CRISPR RNA（crRNA）和转录单元RNA （tracrRNA）结合，形成一个复合物。该复合物能够识别和结合目标基因的特定位点，通过Cas9酶的剪切作用，实现基因组的编辑和敲除。
Cas9基因敲除位点的确定是基因敲除的关键步骤。一般而言，确定Cas9基因
敲除位点需要进行以下步骤：
1. 目标基因的选择：首先，需要确定需要敲除的目标基因。目标基因的选择通
常基于研究的目的，可以是为了研究基因的功能、验证基因的作用或研究基因在疾病中的作用等。
2. 位点的设计：确定目标基因的敲除位点是关键的一步。位点的设计通常基于
目标基因的编码区域，选择敲除目标基因的关键区域，例如编码区的起始密码子或重要的结构域。
3. 引物的设计：引物的设计是确定Cas9基因敲除位点的重要步骤。引物需要
能够与目标位点的DNA序列特异性地结合，并且能够引导Cas9酶的结合和剪切。引物设计的关键是确保引物与目标位点的DNA序列有高度的互补性。
4. Cas9酶的引入：一旦引物设计完成，需要将Cas9酶引入细胞中。Cas9酶的
引入可以通过转染、病毒介导的转导或基因递送等方法实现。
5. 目标基因的编辑和敲除：引入Cas9酶后，通过引物的引导，Cas9酶能够特异性地结合到目标基因的敲除位点上，并进行DNA的剪切。这会引起DNA双链断裂，进而通过细胞的修复机制，导致目标基因的编辑和敲除。
基因敲除细胞系构建流程
基因敲除细胞系构建流程
基因敲除细胞系构建流程通常包括以下步骤：
1. 确定目标基因：选择需要敲除的目标基因。
2. 基因敲除设计：设计合适的靶向序列，该序列将在基因敲除过程中与目标基因发生特异性的DNA双链断裂。
3. CRISPR-Cas9系统构建：构建CRISPR-Cas9系统，其中包
括Cas9核酸酶和相应的靶向RNA（sgRNA）。
4. 细胞系培养：培养适合的细胞系，如细胞株或原代细胞。
5. 转染：将CRISPR-Cas9系统转染到细胞中，可以使用化学
转染、电转染或病毒载体转染等方法。
6. 筛选敲除细胞：在转染后的细胞中，通过添加选择性抗生素或使用基因标记物等方法，筛选出含有目标基因敲除的细胞。
7. 制备克隆：将筛选出的细胞进行单细胞克隆，并培养扩增。
8. 确定敲除效果：通过PCR、Western blot、流式细胞术或其
他适合的实验方法检测敲除细胞的基因表达水平和蛋白质表达。
9. 验证敲除细胞的功能：通过细胞功能实验，如细胞增殖、凋亡、迁移等实验，验证目标基因敲除对细胞功能的影响。
注意：以上流程是一般化的基因敲除细胞系构建流程，具体步
骤和条件可能因实验目的、细胞类型、基因敲除方法等而有所不同。
cas9基因敲除原理
cas9基因敲除原理
首先，我们需要了解CRISPR/Cas9技术的基本原理。CRISPR是
一种天然存在于细菌和古细菌中的一种免疫系统，能够识别和摧毁
入侵的病毒基因组。而Cas9则是CRISPR系统中的核心蛋白，具有
切割DNA的能力。科学家们发现，通过人为设计引导RNA序列，可
以将Cas9蛋白精确地引导到基因组的特定位置，实现对基因组的编辑。
接下来，我们来详细了解cas9基因敲除的原理。在基因敲除过
程中，首先需要设计引导RNA序列，使其与目标基因的特定区域配对。一旦引导RNA与目标基因结合，Cas9蛋白就会被引导到该位置，并切割DNA链。在细胞修复DNA的过程中，通常会导致插入或缺失
碱基，从而破坏目标基因的功能。这样，就实现了对目标基因的敲除。
在实际的基因编辑中，科学家们可以利用cas9基因敲除原理对
特定基因进行靶向编辑。例如，通过设计特定的引导RNA序列，可
以将Cas9蛋白引导到癌症相关基因上，并实现对这些基因的敲除。
这种精准的基因编辑技术为疾病治疗和生物学研究提供了强大的工具。
除了基因敲除，CRISPR/Cas9技术还可以实现基因插入和修饰等功能。通过设计不同的引导RNA序列，可以将外源基因插入到特定位置，或者实现对基因组的精细修饰。这些功能使得
CRISPR/Cas9技术在基因编辑领域具有广泛的应用前景。
总之，cas9基因敲除原理是CRISPR/Cas9技术中的重要组成部分，它通过设计引导RNA序列，精确地将Cas9蛋白引导到基因组的特定位置，实现对基因的敲除。这种技术为基因编辑领域带来了革命性的变革，为疾病治疗和生物学研究提供了强大的工具。随着对CRISPR/Cas9技术的进一步研究和改进，相信它将在未来发挥更加重要的作用。
CRISPRCas9基因敲除研究进展
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2021年 第1期
CRISPR/Cas9基因敲除研究进展
白祥慧
（青海师范大学生命科学学院，青海 西宁 810008）
摘 要：功能基因组学的发展促进基因敲除技术的进步，基因敲除技术从载体的构建到细胞筛选再到动物模型都取得长足进步。基因敲除手段种类繁多，其中CRISPR/Cas9作为常用的基因编辑技术，具有高效、便捷、精确等优点，在农业、医学、生物学的模型构建中被广泛运用。随着科研工作的逐渐深入，CRISPR/Cas9技术逐渐渗透到植物和微生物研究领域中。文章综述近年来CRISPR/Cas9的应用，为科研工作的开展提供参考。
关键词：CRISPR/Cas9；基因；敲除
中图分类号：S 852 文献标识码：A 文章编号：1672-9692（2021）01-0090-03
Research progress of CRISPR/Cas9 gene knockout
Bai Xianghui
(College of Life Science, Qinghai Normal University, Qinghai Xining 810008)
Abstract: The development of functional genomics has promoted the development of gene knockout technology, which has made great progress from vector construction to cell screening to animal models. There are many kinds of gene knockout methods, among which CRISPR/Cas9, as a common gene editing technology, has the advantages of high efficiency, convenience and accuracy, making it widely used in the construction of models in agriculture, medicine and biology. CRISPR/Cas9 technology has gradually infiltrated the field of plant and microbial research as scientific work demands. In the paper, the application of CRISPR/Cas9 in recent years is briefly reviewed to provide reference for the development of scientific research.
用CRISPR Cas9方案构建双基因敲除鼠, 获得双基因敲除纯合子小鼠的交配方案
双基因敲除小鼠繁殖工作：
CRISPR/Cas9方案构建双基因敲除鼠，得到F0杂合子之后，如何建系才能获
得双基因敲除纯合子小鼠？这是经常被问到的问题，下面就简单回答一下。
假设我们的目的基因为A和B，通常用CRISPR/Cas9方法得到的基因敲除鼠
为杂合子，双杂合子小鼠基因型为AaBb，大写字母代表野生型（dominant），小写字母代表突变型（recessive）。得到F0杂合子（AaBb）之后，可以用
以下方案之一来获得双基因敲除纯合子小鼠：
方案一：
1.将双杂合子小鼠（AaBb）与野生鼠（AABB）交配，理论上将得到25%的
野生型（AABB），25%基因A单杂合子（AaBB）,25%基因B单杂合子
（AABb）及25%双杂合子小鼠（AaBb）。
2.将所得到的双杂合子小鼠（AaBb）互交（inter-cross），理论上6.25%
的后代将会是双基因敲除纯合子小鼠（aabb），见下图。
3.由于双基因敲除实验中一般都需要单基因敲除动物作为对照，所以在
进行上面小鼠breeding的同时可以将基因A单杂合子（AaBB）互交，
在后代中鉴定出基因A纯合子（aaBB）,同样将基因B单杂合子（AABb）互交，在后代中鉴定出基因B纯合子（AAbb）。
方案二：
将双杂合子小鼠（AaBb）与单基因纯合子（如aaBB）交配，所生小鼠
中约25%为基因A纯合子而基因B杂合子（aaBb,见下图左）。然后将
aaBb小鼠互交，理论上后代小鼠中25%为双基因敲除纯合子小鼠
（aabb），见下图右。
需要特别注意的几个问题：
1)上面所讲的方法适用于位于不同的染色体两个基因的基因敲除，如
cas9基因敲除原理
cas9基因敲除原理
Cas9基因敲除是一种常用的基因编辑技术，基于CRISPR-Cas9系统。在基因敲除过程中，Cas9蛋白质与特定的RNA分子（常为引导RNA）结合形成复合物，该RNA分子与目标基因的特定序列相互配对。经过引导RNA和Cas9的识别和结合，Cas9蛋白质就能够放置于目标基因上，并切断其双链DNA。
Cas9依赖于其内源性双链RNA分子（sgRNA）来准确识别目标基因的DNA序列。由于sgRNA可以经过定制设计来匹配目标基因，因此Cas9基因敲除技术具有较高的准确性和选择性。
在sgRNA的引导下，Cas9蛋白质引导至目标基因，通过其核酸酶活性，Cas9切割两侧的DNA链。当切断发生时，细胞的自我修复机制会介入，尝试恢复切断的DNA链。然而，自我修复过程中可能会产生插入缺失或置换等突变，导致基因功能的受损或基因完全失活。
基因敲除的效率取决于切割位点与目标基因的相对位置和其他因素。在理想情况下，Cas9酶通过精确的切割，可以完全出现目标基因突变。然而，有时候Cas9酶切割的位置会出现越位现象，导致非特异性的剪切。因此，在使用Cas9进行基因敲除时，需要仔细设计及验证sgRNA序列，以确保高效且特异性的基因敲除。
综上所述，Cas9基因敲除是一种通过利用CRISPR-Cas9系统
对目标基因进行准确切割的方法。通过引导RNA的识别和结合，Cas9能够定位并切割目标基因的DNA，进而引发自我修复过程，从而实现对基因的敲除。
CRISPR Cas 细胞 动物KOKI实验基本流程
一、CRISPR-Cas9 细胞基因敲除敲入实验基本操作流程
1)设计sgRNA ：
1.1、确定待敲除基因的靶位点
根据提供的物种、基因名称或者基因ID在NCBI或ENSEMBLE中进行查找。找到该基因CDS 区，分析相应的基因组结构，明确CDS的外显子部分。按照基因本身的性质，选择候选的待敲除位点，确定待敲除位点。对于蛋白编码基因，如果该蛋白具重要结构功能域，可考虑将基因敲除位点设计在编码该结构域的外显子；如果不能确定基因产物性质，可选择将待敲除位点放在起始密码子A TG后的外显子上。如果是microRNA，可以将待敲除位点设计在编码成熟microRNA的外显子或在编码成熟microRNA的外显子的5’和3’侧翼序列。
1.2、设计识别靶位点的一对DNA Oligos
确定待敲除位点后，选择23-至250bp的外显子序列输入到在线免费设计sgRNA的软件Input 框中（/），然后进行设计运算，软件会自动输出sgRNA序列（网站设计一般很慢或数据输出不完整，可使用我的内部软件，2天内输出全部结果，无物种限制）。一般地，基因特异的sgRNA模板序列为位于PAM序列（Protospacer AdjacentMotif）前间区序列邻近基序，这是一种见于crRNA分子的短核苷酸基序，可以被Cas9蛋白特异性识别并切割）的20个nt。而PAM序列的特征为NGG（其中N为任意核苷酸）。因此，sgRNA模板序列选择非常方便，即使没有软件，研究者也可手工进行选择。不过，在线软件可以给出该序列在基因组中存在相似序列的情况，即可能的脱靶位点。因此，利用在线软件可以选择脱靶机会小的序列作为sgRNA模板序列。根据选择的sgRNA模板序列，合成一对序列互补的DNA Oligos （同时设计检测目的基因的引物一起合成）。
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CRISPR/Cas9 是细菌和古细菌在长期演化过程中形成的一种适应性免疫防御，可用来对抗入侵的病毒及外源DNA。CRISPR/Cas9 系统通过将入侵噬菌体和质粒DNA 的片段整合到CRISPR 中，并利用相应的CRISPR RNAs（crRNAs）来指导同源序列的降解，从而提供免疫性。
原理
此系统的工作原理是crRNA（CRISPR-derived RNA ）通过碱基配对与tracrRNA （trans-activating RNA ）结合形成tracrRNA/crRNA 复合物，此复合物引导核酸酶Cas9 蛋白在与crRNA 配对的序列靶位点剪切双链DNA。而通过人工设计这两种RNA，可以改造形成具有引导作用的sgRNA （singleguide RNA ），足以引导Cas9 对DNA 的定点切割。
作为一种RNA 导向的dsDNA 结合蛋白，Cas9 效应物核酸酶是已知的第一个统一因子（unifying factor），能够共定位RNA、DNA 和蛋白，从而拥有巨大的改造潜力。将蛋白与无核酸酶的Cas9（Cas9 nuclease-null）融合，并表达适当的sgRNA ，可靶定任何dsDNA 序列，而sgRNA 的末端可连接到目标DNA，不影响Cas9 的结合。因此，Cas9 能在任何dsDNA 序列处带来任何融合蛋白及RNA，这为生物体的研究和改造带来巨大潜力。
应用
基因敲除动物模型一直以来是在活体动物上开展基因功能研究、寻找合适药物作用靶标的重要工具。但是传统的基因敲除方法需要通过复杂的打靶载体构建、ES细胞筛选、嵌合体小鼠选育等一系列步骤，不仅流程繁琐、对技术的要求很高，而且费用大，耗时较长，成功率受到多方面因素的限制。即使对于技术比较成熟的实验室，利用传统技术构建基因敲除大、小鼠一般也需要一年以上。
2013 年1 月份，美国两个实验室在《Science》杂志发表了基于CRISPR-Cas9 技术在细胞系中进行基因敲除的新方法，该技术与以往的技术不同，是利用靶点特异性的RNA 将Cas9 核酸酶带到基因组上的具体靶点，从而对特定基因位点进行切割导致突变。该技术迅速被运用到基因敲除小鼠和大鼠动物模型的构建之中。通过一系列研究，首先证明了通过RNA 注射的方式将CRISPR-Cas 系统导入小鼠受精卵比DNA 注射能更有效的在胚胎中产生定点突变。在此基础上，又发现了该方法没有小鼠遗传品系的限制，能够对大片段的基因组DNA 进行删除，也可以通过同时注射针对不同基因的RNA 序列达到在同一只小鼠或大鼠中产生多个基因突变的效果。此外，还证明了利用CRISPR-Cas 技术构建的基因敲除大鼠模型与传统方法构建的同一基因（肥胖相关G 蛋白偶联受体Mc4R）突变大鼠相比具有一致的表型。该方法构建的基因突变动物具有显著高于传统方法的生殖系转移能力，是一种可靠、高效、快速的构建敲除动物模型的新方法。
CRISPR-Cas 技术是继锌指核酸酶（ZFN）、ES 细胞打靶和TALEN 等技术后可用于定点构建基因敲除大、小鼠动物的第四种方法，且有效率高、速度快、生殖系转移能力强及简单经济的特点，在动物模型构建的应用前景将非常广阔。
技术优缺点
CRISPR （Clustered Regularly Interspersed Short Palindromic Repeats）是细菌用来抵御病毒侵袭/躲避哺乳动物免疫反应的基因系统。科学家们利用RNA引导Cas9核酸酶可在多种细胞（包括iPS）的特定的基因组位点上进行切割，修饰。Rudolf Jaenisch 研究组将Cas9与Te1和Tet2特异的sgRNA共注射到小鼠的受精卵中，成功得到双基因敲除的纯合子小鼠，效率高达80%。他们将Cas9/sgRNA 与带突变序列的引物共注射，能准确在小鼠两个基因引入所要的点突变。在ES细胞中他们更是成功的一次敲除了五个基因。与ZFN/TALEN相比，CRISPR/Cas更易于操作，效率更高，更容易得到纯合子突变体，而且可以在不同的位点同时引入多个突变。但该系统是否有脱靶效应尚需进一步的研究。
传统的转基因和基因打靶技术，由于技术稳定成熟，可以对小鼠和大鼠的基因组序列进行各种修饰，仍将是模式动物的构建的主要技术。核酸酶ZFN/TALEN 尤其是CRISPR/Cas技术如果能解决脱靶效应的话，有可能会广泛应用于小鼠，大鼠及其他模式动物的制备和研究中，成为传统的转基因和基因打靶技术的重要补充。