转基因大豆、玉米、水稻深加工产品的五重巢式PCR技术检测
PCR 技术的种类及其应用
PCR 技术的种类及其应用
1PCR 技术的基本原理
PCR技术是在模板DNA、引物和四种dNTP等存在的条件下, 依赖于DNA聚合酶（T aq酶)的酶促合成反应。其具体反应分三步：变性、退火、聚合。以上三步为一个循环, 每一循环的产物DNA又可以作为下一个循环模板，数小时后，介于两个引物之间的目的DNA得到了大量的复制，经25～30次循环DNA数量可达2×106～7拷贝数。2PCR技术的种类
2。1反向PCR（Inverse PCR，IPCR)技术
原理：反向PCR是克隆已知序列旁侧序列的一种方法．主要原理是用一种在已知序列中无切点的限制性内切酶消化基因组I)NA．后酶切片段自身环化．以环化的DNA 作为模板，用一对与已知序列两端特异性结合的引物，扩增夹在中间的未知序列。该扩增产物是线性的DNA片段,大小取决于上述限制性内切酶在已知基闲侧翼DNA 序列内部的酶切位点分布情况。用不同的限制性内切酶消化，可以得到大小不同的模板DNA,再通过反向PCR获得未知片段 .
该方法的不足是：①需要从许多酶中选择限制酶，或者说必须选择一种合适的酶进行酶切才能得到合理大小的DNA片段。这种选择不能在非酶切位点切断靶DNA。②大多数有核基因组含有大量中度和高度重复序列，而在YAC或Cosmid 中的未知功能序列中有时也会有这些序列，这样,通过反向PCR得到的探针就有可能与多个基因序列杂交。
2.2锚定PCR（Anchored PCR, APCR）技术
用酶法在一通用引物反转录cDNA3'—末端加上一段已知序列, 然后以此序列为引物结合位点对该cDNA进行扩增，称为APCR。
PCR扩增检测转基因大豆、玉米
在治疗上，除了药物外，还有针灸、 推拿气 功、（df高血 压958心 脏病983u6糖 尿病87fr ）耳针 等特殊 疗法， 它是世 界传统 医学中 最完善 的一种 医学理 论体系 。它为 人类尤 其为中 国人民 （4f肿 瘤fbb癌 症 yuw3胃癌d65io肠 癌.f2tr肺 癌65ff）
健康和民族繁衍做出了巨大贡献。 （df肺25s血液f369血小板t5172红血球gdf55m白血 球fd2）
3. 琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增结果
配制0.8％琼脂糖凝胶，取PCR产物5μL 加 1μL 点 样 液 混 合 后 点 入 上 样 孔 ， 于 120V电压电泳20~30min。电泳结束后， 用自动凝胶成像分析系统检测
M123456 7
M 1 234 5 6 7
内源基因(Lectin)特异性扩增 M12345 67
血球gdf55m白血球fd2），风马牛不相 及，从 理论上 讲就没 有结合 的可能 ，只是 形式上 的融合 罢了。 （df4肺炎88gdg青霉素d25f肝炎df6）
故出现西医对治疗不了的疾病只好求 助中医 ，而中 医则往 往采用 西医诊 断中医 治疗， 以及中 西治疗 法一块 用的局 面。
（df高血压958心脏病983u6糖尿病87fr ）至于 （45传 染病q566丙肝964jo乙 肝28jgs x甲肝gh）循 证医学 、比较 医学、 后现代 医学、 行为医 学等所 谓“医 学”， 都称不 上一门 独立的 医学科 学，关 于这一 点在灵 魂医学 有关章 节中将 有相关 点评。
玉米转基因检测工作总结
玉米转基因检测工作总结
近年来，随着生物技术的发展，转基因作物的种植越来越普遍。而玉米作为世
界上种植面积最大的转基因作物之一，其转基因检测工作也变得愈发重要。本文将对玉米转基因检测工作进行总结，以期为相关领域的研究和实践提供参考。
首先，玉米转基因检测工作的目的是为了确保市场上销售的玉米产品符合相关
的法律法规和标准。通过检测玉米中是否含有转基因成分，可以保障消费者的权益，同时也有助于监管部门对市场上的玉米产品进行有效管理。
其次，玉米转基因检测工作通常包括样品收集、DNA提取、PCR扩增、基因
分型和数据分析等环节。样品收集是整个检测工作的第一步，必须确保样品的来源真实可靠。DNA提取是提取玉米样品中的基因组DNA，为后续的PCR扩增提供
原料。PCR扩增是通过特定引物扩增目标基因片段，从而检测玉米中是否含有转
基因成分。基因分型和数据分析则是对PCR扩增产物进行分析和鉴定，最终确定
样品中是否含有转基因成分。
最后，玉米转基因检测工作还需要关注一些问题。例如，样品收集的时机和方法、DNA提取的纯度和质量、PCR扩增的引物设计和反应条件、基因分型的准确
性和灵敏度等都需要认真考虑和解决。同时，检测结果的解读和报告也需要准确和详尽，避免因为技术误差或其他原因导致的错误判断。
总的来说，玉米转基因检测工作是一项复杂而重要的工作，涉及到多个环节和
技术。只有严格按照标准操作流程，确保每个环节的准确性和可靠性，才能够得到真实有效的检测结果。希望本文的总结能够为相关领域的研究和实践提供一定的参考和借鉴。
转基因大豆植株数字PCR在分析中的应用
转基因大豆植株数字PCR在分析中的
应用
1。介绍
如今，转基因作物通常在美国种植。根据
从美国农业部最近的报告，基因
种植作物（主要是玉米，棉花和大豆）种植约
2013美国土地一半用于农作物
（HTTP：/ / www.ers。农业部政府/媒体/ 1282246 / err162 .pdf）。其他国家，如中国
和巴西，正在迅速赶上采用和种植转基因作物
为工程性状的好处，如除草剂耐受性和抗虫性。
不过，公众仍然非常关注基因的潜在风险
改性生物（转基因生物）对人类，动物和环境[ 1 ] - [ 6 ]。
一些国家已经采取严格的法规来控制转基因生物，例如，
欧洲联盟（欧盟）。检测和量化的转基因生物是必要的
执行这些规定。目前，各种DNA聚合酶链反应
PCR（PCR）方法通常用于检测和/或量化转基因
转基因生物由于其敏感性，例如，定期终点PCR和实时定量
PCR（qPCR）方法，尤其是后者[ 5 ] [ 7 ] - [ 16 ]。偶尔，其他方法，
1
如生物传感器和免疫测定，也用于分析转基因生物[ 5 ] [ 7 ]—
[ 13 ]。此外，一些新技术，如新一代测序和
数字PCR（dPCR），也被用在分析转基因生物，例如，[ 15 ] [ 17 ] [ 18 ]
[ 19 ] [ 20 ] [ 21 ]。
采用反应是基于以下原则：一是充分的DNA模板
随后稀释成许多独立的小等体积反应
（在威尔斯或液滴中）。以及这些反应中模板分子的数目
服从泊松分布。因此，绝对量化可以通过以下方式实现
比较正面和负面的反应[ 14 ] [ 22 ] [ 23 ] [ 24 ] [ 25 ] [ 26 ]。因此，检测
利用PCR方法检测转BT基因水稻
Ｔａ ｓ ｅ ｉ ｃ ｒｍ ｅｃ ｕ ｔｒａｔ ｆｎ ｎ ＧＭ ｒｄ ｃｓａ ｄｔｅｄ ｔｃｉｎｓｓ ｍ ｄｆｒｃ ｒｅａｉ ｅｍａｋ ｄｇ ｎ ｓａ ｄｔ ｎ ｇ ｎｃ Ｔ ｅ ｒｎ ｇ ｎｃＲｉ ｆｏ ｔ ｏ ｎｅｐ ｒ ｏ ｏ － ｅ ｈ ｐｏ ｕ ｔ ｎ ｈ ｅ ｔ ｔ ａ ｏｒｌｔ ｇ ｔ ｒｅ ｅ ｅ ａ ｓ ｅ ｉ． ｈ ｅ ｏ ｙｅ ｎ ｏ ｎ ｈ ｎ ｒ
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多重实时荧光PCR快速检测转基因大豆及其加工产品
大 豆 是 世界 最 主 要 的油 料 作 物 ，是 人 类 优 质 蛋 白和 油 脂 的 主要 来 源 ，自 ２０世 纪 ６０年 代 以来 ，世 界 大 豆 生 产 迅 速 发 展 … 。２０１６年 转 基 因大 豆 的 播 种 面 积 高 达 ９ １４０万 公 顷 ，占全 球 转 基 因作 物 总 种 植 面 积 的 一 半 －３１。从 全 球 单 个 作 物 的种 植 面 积 来 看 ，２０１６年 转 基 因大 豆 的应 用 率 为 ７８％ ，高 于 转 基 因棉 花 、玉 米 和 油 菜 的应 用 率 。抗 虫／耐 除 草 剂 大 豆 （Ｉｎｔａｃｔａ ）在 ２００３－２０１５年 的应 用 带 来 了 ２４ 亿 美 元 的 经 济 效 益 ，为 全 球 ７４亿 人 口提 供 了可 获 得 的粮食 和 营养 Ｊ。从 世 界 范 围来 看 ，大 豆 种 植 的 集 中度 非 常 高 ，主 要 集 中在 北 美 洲 的 美 国 、南 美 洲 的 巴西 和 阿 根 廷 、亚 洲 的 和 印 度 等 少 数 几 个 国家 。 以 上 五 个 主 产 国 大 豆 种 植 面 积 占 全 世 界 的 ８５％ ～９０％ ，总 占全世 界 的 ８５％ ～９０％ ，单 产 高 出世 界 平均 水平 ５％ 一１０％ Ｊ。
关键 词 转基 因大豆 多重 实 时荧光 ＰＣＲ 快速检 测 加 工 产品 中 图分类 号 ：￥５２９ 文 献标识 码 ：Ａ 文 章编 号 ：１００３～０１７４（２０１８）０９—０１３５—０７ 网络 出版 时 间 ：２０１８—０７—１８ １４：４１：２４ 网络 出版 地址 ：ｈｔｔｐ：／／ｋｎｓ．ｃｎｋｉ．ｎｅｔ／ｋｃｍｓ／ｄｅｔａｉｌ／１１．２８６４．ＴＳ．２０１８０７１８．１４４１．０１６．ｈｔｍｌ
如何检测转基因大豆
PCR检测转基因大豆：[目的]定性检测转基因大豆。[方法]以非转基因大豆和CP4-EPSPS转基因大豆为材料,以大豆内源基因Lectin和外源基因5-莽草酸-3-磷酸合成酶基因(CP4-EPSPS)为检测的目的片段,建立PCR反应体系。采用改进CTAB法提取大豆基因组DNA,并对所提DNA进行PCR扩增和电泳检测,确定转基因大豆的PCR检测限。
实时荧光定量PCR技术检测转基因大豆方法的建立：采用实时荧光定量PCR技术,通过使用特异的引物和探针,对大豆中的内源基因Lectin和转基因大豆中的外源基因EPSPS进行了定量检测,建立了Monsanto公司生产的商业化转基因大豆Roundup Ready○R的定量PCR检测方法。该方法的检测灵敏度<001%,是国际上设定的转基因最低限量的100倍
用巢式和半巢式PCR检测转基因大豆Roundup Ready及其深加工食品：用从转基因大豆(Glycinemax )颗粒中提取的DNA作为模板,经过稀释,形成不同浓度梯度的DNA溶液,然后用巢式和半巢式PCR进行扩增反应。结果表明,巢式和半巢式PCR均可以扩增DNA浓度为10-14g/μL的溶液。用巢式和半巢式PCR对市场的食品原料和深加工食品进行检测,可以从大豆油、酱油、面酱、大豆磷脂、豆腐、豆浆等食品原料和深加工食品的17个品牌的食品中检测出大豆内标基因(housekeepinggene)。
ELISA方法定量检测转基因大豆及其产品的研究：以美国、阿根廷、巴西转基因大豆等为材料,建立了ELISA法定量检测抗草甘膦转基因大豆CP4 EP- SPS蛋白的方法,成功检测出美国转基因大豆含量为3.768%、阿根廷转基因大豆含量为
大豆卵磷脂DNA的提取方法及应用
分析与检测
大豆卵磷脂 DNA 的提取方法及应用*
韩建勋，吴亚君，王斌，杨海荣，陈颖
（ 中国检验检疫科学研究院，北京，100123）
摘 要 以大豆卵磷脂为研究对象，比较了 CTAB 法、磁珠试剂盒法以及硅胶膜试剂盒法等 3 种 DNA 提取纯化 方法。通过大豆内源基因 Lectin 实时荧光 PCR 检测，发现 CTAB 法提取的大豆卵磷脂 DNA 质量优于其它两种 方法，并以 CTAB 法为基础进行条件优化，进一步提高 DNA 纯度。采用该方法对 6 个不同品牌的市售大豆卵磷 脂产品进行转基因成分（ CAMV35S 启动子及 NOS 终止子） 检测，结果证实均不含转基因成分。 关键词 大豆卵磷脂，DNA 提取，实时荧光 PCR
取 8 粒软胶囊中的卵磷脂至一洁净的 50 mL 离 心管中，加入 4 mL A 液、2 mL B 液，于摇床（ XHZ-3 SHAKER） 300 r / min，20 min，加入 5 mL Precipitation Solution，剧烈振荡 30 s，8000 g 15 min，去除上层油 相，小心将下层水相约 5. 5 mL 转移至一洁净的 50 mL 离心管中，加入 200 μL 磁粉及 0. 9 倍体积（ 4. 95 mL） 异丙醇，室温静置 1 h，期间不断混匀，上磁力架， 去除水相后加入 1 mL 70% 乙醇，振荡混匀 30 s，上磁 力架，去除液相，加入 500 μL 70% 乙醇，振荡混匀 30 s，上磁 力 架，去 除 液 相，于 65 ℃ 烘 箱 中 烘 干，加 入 200 μL ddH2 O 溶解，65 ℃ 孵育 10 min，间期不断混 匀，上磁力架，转移水相至一洁净的 1. 5 mL 离心管 中，加入 50 μL 磁粉及 0. 8 倍体积异丙醇，静置 10 min，间期不断混匀，上磁力架，去除液相后加入 500 μL 70% 乙醇，振荡混匀 30s，上磁力架，去除液相，于 65 ℃ 烘箱中烘干，加入 120 μL ddH2 O 溶解，65 ℃ 孵 育 10 min，间期不断混匀，上磁力架，转移水相约 100
用于筛选转基因玉米的高通量多重串联PCR测定法
用于筛选转基因玉米的高通量多重串联PCR测定法摘要
转基因生物（GMO）越来越被接受，这导致了对高通量检测方法的需求日益增加。这项研究描述了一个高通量和低成本的多重串联PCR（MT-PCR）检测方法，此方法使用SYBR Green I进行定量分析，用于筛选包含7个转基因（GM）共有的筛选元素，6个转基因玉米和一个玉米参考基因共14个靶标。这14个目标的高通量多重串联PCR分析成功地扩增了单一事件样本中转基因玉米DNA含量小于0.001 ng的产物，并显示出高度特异性。该测定可有效地用于筛选食物和饲料中的GM玉米。
引言
近几十年来，许多国家的市场上都有大量的转基因生物。根据国际农业生物技术应用服务处的统计，到2016年，全世界已经有29种转基因品种被开发和商业化。值得注意的是，玉米获得了世界范围内最大的认可，有29个国家批准了229个转基因品种。有几个国家对来自欧盟成员国等转基因植物的食品实行强制性标签，规定含有超过0.9％转基因材料的产品必须按照现行法规加贴标签。然而，未经授权的转基因生物（UGM）偶尔会被释放到市场中。为了保护消费者的权益，有必要采用大容量监测方法检测转基因玉米。
GMO检测是基于发现插入的外源基因（含有插入连接序列）或在转基因植物中特异性表达的蛋白质。基于蛋白质的方法是费力和不太敏感的，通常不适用于可能引起蛋白质变性的加工产物。相比之下，基于DNA的PCR方法更为广泛的应用。近年来，已经描述了高通量的基于DNA的GMO检测方法的许多策略。其中，一次反应可同时扩增多个DNA目标的多重PCR是监测多个GM含量的基本策略。
实时荧光定量PCR技术检测转基因大豆方法的建立 (1)
测内源特异参照基因 (内源基因) ,可以判定
DNA 是否被提取出来 ,或所提 DNA 是否适
合于进行 PCR 扩增 ,从而可以避免检测结果
的假阴性 。因此 ,对大豆内源基因 Lectin[5 ]
的检测即是对被检测样品 DNA 提取质量的
检测 。
本研究通过采用特异引物首先对转基因
大豆中的内源基因进行了定性 PCR 检测 ,以 确定所提取的 DNA 是否适合于 PCR 扩增 。 PCR 电泳显示 :转基因成分含量分别为 5 %、 2 %、1 %、015 %、011 %、0 %的转基因大豆 ,均 扩增出了 118 bp 片断 (电泳结果未显示) ,该 结果表明 ,所提取的 DNA 数量和质量均适 合于 PCR 扩增 。 212 标准曲线的建立
法的精密度 。
DNA 的起始拷贝数越少 。当 Ct < 40 时 ,即
标准偏差 ( RSD)
在该 PCR 循环时 ,可以检测到高于基线的报
= ( d1 - X) 2 + ……( dn - X) 2 ]/ ( n - 1) 变异系数 (CV) = SD/ X ×100 % 其中 :d1～d n 为样品 1～ n 次测量所得
第一作者 :博士 ,高级工程师 。 3 科技部社会公益研究专项资金项目 收稿时间 :2003 - 04 - 14 ,改回时间 :2003 - 07 - 07
pcr转基因实验报告
pcr转基因实验报告
PCR在转基因中的应用
PCR技术在转基因食品中的应用
(石河子大学食品学院农产品加工及贮藏专业，李珍新疆石河子832000)
摘要：转基因食品近年来，已经成为公众争论的焦点。本文概述了转基因食品国内外发展现状及在转基因食品安全性基础上，提出了其检测方法—PCR技术，并重点介绍了PCR技术在转基因食品检测上的应用及发展趋势。
关键词：PCR；转基因食品；食品检测
PCR Technology In Genetically Modified Food
Abstract:Genetically modified foods in recent years has become the focus of public debate.This article summarizes the current situation and the development of the genetically modified foods in domestic and foreign on the basis of safety,Introduce the detection method-PCR technology, And focus on the application of PCR technology and development trends in the detection of genetically modified foods.
Key words:PCR; Genetically Modified Food;Food Testing
我国转基因食品安全的法律规制
我国转基因食品安全的法律规制
【摘要】不管我们是否准备好，转基因食品这头“巨兽”已经进入中国。转基因食品对解决粮食短缺问题有很大的作用，但作为一种新型食品，转基因食品存在不确定的危险，引起人们对其安全问题的极大关注。对转基因食品研究的目的就在于通过有效的法律规制以最大限度发挥转基因食品优势，减少转基因食品可能存在的安全问题。本文分析了我国目前转基因食品安全法律规制的现状，对我国转基因食品安全性法律规制提出了制订专门的转基因食品安全法律、制订统一的转基因食品检测标准的立法建议，以期从法律层面促进转基因食品的健康发展。
【关键词】转基因食品；法律规制；食品安全
前段时间一条关于食品条形码以“8”开头即为转基因食品的微博，再次掀起人们对转基因食品安全问题的热议。转基因食品作为一项重大的科技成果，可以解决我们的“吃饭”问题，普遍存在于我们的日常生活中①。同时，转基因食品对人类健康的有不确定的危险，因而存在安全隐患，所以一直是人们争论的焦点。
一、法律规制转基因食品的必要性
作为一项重大的科技成果，转基因食品可以解决食品短缺问题，同时丰富人们的食品。但是作为一种新型食品，转基因食品仍然存在许多安全隐患，最重要的就是对人体健康的影响，但是不能因为转基因食品存在风险，我们就放弃它将为造福人类发挥的作用，因此如何保障转基因食品的安全成为目前公众关注的重点。现在法治是中国社会的主旋律，依法治国被明文载入我国宪法修正案，在这样的社会大背景下，转基因食品的安全必然离不开法律的保障，对转基因食品的安全性进行法律规制是当务之急。基于民众对食品安全的顾虑、关注和积极支持，相对完整的专适于转基因食品的法律规制是必要的。对于转基因食品的安全问题，必须首先从法律规制上着手，同时这也是我们面对转基因难题时最富有成效的努力。
五重PCR检测转基因大豆
五重PCR检测转基因大豆
张秀丰苏旭东张伟袁耀武周巍张会彦齐哲
(河北农业大学食品科技学院，保定071001)
摘要旨在建立一套准确、快速、可靠的用于转基因大豆检浏及DNA提取方法;以35S 启动子
( Cauliflowennosaicvitus 35S , CaMV 35S) , N.终止子(Nopalinesynthase, Nos) , NPT } , CP4一EPSPS四种外源基因和
大豆内源基因(Lectin)为检测的目的片段，建立五重PCR反应体系，并采用改进的方法提取DNA，进行PCR扩
增，实际检浏了已知转基因大豆和市售大豆;改进的DNA提取方法与经典的CTAB方法相比，提取时间至少缩
短了1h，降低了提取成本。经过PCR扩增对五种外源基因进行了检测，经DNA浏序证实了产物为目的扩增
产物。转基因大豆的检出限为0.2% } 0.5%。改进后的DNA提取方法能够快速提取用于PCR 扩增的高质量
模板，消除了PCR反应的抑制因子;建立的五重PCR反应体系能够高效、准确的检测转基因大豆。
关健词转基因大豆DNA提取多重PCR检测
随着转基因产品商品化，使得转基因植物、动
物、微生物加工而成的转基因食品在传统食品市场
中的份额在不断加大，转基因食品已经在人们不知
不觉的日常生活中走进了人们的餐桌，进人了食物
链。然而，转基因食品中含有新的遗传物质，即外源
DNA以及由外源基因编码的新蛋白，而传统食品是
不存在这些情况的，并且传统食品是经过人类几千
年的食用证明是安全的，因此转基因食品的安全性
是摆在人类面前的重大难题;由于转基因食品的安
玉米转基因检测标准
玉米转基因检测标准
1. PCR检测方法，PCR（聚合酶链式反应）是目前最常用的转基因检测方法之一。检测标准通常会规定PCR反应的条件、引物设计、阳性对照、负性对照等内容，以确保检测的准确性和可靠性。
2. 适用范围，检测标准会明确适用于哪些类型的转基因玉米，比如Bt玉米、抗除草剂玉米等，以及不同的转基因基因型。
3. 检测灵敏度和特异性，标准通常会规定检测方法的灵敏度和特异性要求，确保可以检测到极低水平的转基因成分，并且不会对非转基因玉米产生误检。
4. 样品处理和前处理，标准通常会包括样品的处理方法，比如样品的提取、纯化等，以及前处理步骤，确保样品中的转基因成分可以被有效地检测出来。
5. 质控要求，检测标准通常会包括质控要求，比如实验室的质控体系、质控样品的使用、实验人员的技术要求等，以确保检测结果的准确性和可靠性。
此外，国际上也有一些相关的组织和机构发布了转基因玉米检测标准，比如国际标准化组织（ISO）和美国食品药品监督管理局（FDA）等。这些标准通常会受到各国法律法规的影响和认可，对于确保转基因玉米产品的安全性和合规性起着重要作用。
总的来说，玉米转基因检测标准涉及到多个方面，包括检测方法、适用范围、灵敏度和特异性、样品处理和前处理、质控要求等内容，以确保转基因玉米产品的质量和安全。这些标准的制定和执行对于保障食品安全和消费者权益具有重要意义。
玉米转基因检测工作总结
玉米转基因检测工作总结
近年来，随着转基因技术的不断发展，转基因作物在农业生产中的应用也越来
越广泛。其中，转基因玉米作为重要的农作物之一，其安全性和品质问题备受关注。为了确保转基因玉米产品的质量和安全，转基因检测工作显得尤为重要。
转基因玉米检测工作主要包括样品采集、DNA提取、PCR扩增、基因分析和
结果判读等环节。首先，进行样品采集时需要注意采样点的选择和采样方法的规范，以确保样品的代表性和可靠性。接着，对样品中的DNA进行提取和纯化，以获取
高质量的DNA模板。随后，利用PCR技术对目标基因进行扩增和检测，通过比对转基因和非转基因玉米的特定基因序列，来判断样品中是否存在转基因成分。最后，根据PCR结果进行基因分析和结果判读，以确定样品中的转基因含量和种类。
在实际工作中，玉米转基因检测工作面临着许多挑战和困难。首先，样品来源
的多样性和复杂性使得样品采集和处理工作较为繁琐和耗时。其次，PCR扩增和
基因分析过程中，需要严格控制实验条件和操作流程，以避免外源污染和假阳性结果的产生。此外，不同转基因玉米品种的基因序列差异和检测方法的局限性也给检测工作带来了一定的难度。
然而，通过不懈努力和技术创新，玉米转基因检测工作取得了一系列成果和进展。现在，已经建立了一套完善的转基因玉米检测体系和方法，可以对不同来源和类型的玉米样品进行准确和快速的检测。同时，一些先进的检测技术和设备的引入，也为玉米转基因检测工作提供了更多的技术支持和保障。
总的来说，玉米转基因检测工作是一项重要且复杂的工作，需要多方合作和共
多重PCR分析方法应用于转基因农作物的检测_吴影
多重PCR分析方法应用于转基因农作物的检测
吴影1,2,陆徐忠1,赵伟1,汪秀峰1,李莉1
(1.安徽省农业科学院水稻研究所,安徽合肥230031;2.安徽农业大学生命科学学院,安徽合肥230036)
摘要 以转基因大豆、水稻等样品为材料,采用多重PCR技术对转基因作物中常见的启动子、终止子、筛选标记基因和转入的目的基因等多个外源转基因元件进行检测,以期建立一套快速、准确、高效的转基因农作物筛查鉴定技术。通过多重扩增实验,建立了关于转基因大豆检测的大豆内源Lectin基因,花椰菜花叶病毒(Cauliflower mosaic virus,CaMV)35S启动子和根癌农杆菌胭脂碱合成酶基因NOS 终止子的三重PCR分析体系,及关于转基因水稻检测的CaMV35S、NPTII和HPT基因的三重PCR分析的技术体系。并以大豆、水稻等农作物样品为检测材料,采用单一PCR和多重PCR技术同时进行检测,结果表明多重PC R方法具有快速、高效、简便、准确等特点,在转基因成分的检测上具有非常重要的实际应用价值和潜力。
关键词 转基因成分;多重PCR;检测;技术体系
中图分类号 Q943.2 文献标识码 A 文章编号 0517-6611(2006)07-1297-03
Analysis Method of Genetically Modified Detection of Multiplex Polymerase C hain Reaction(MPC R)
WU Y ing et al (Rice Research Ins titute,Anhui Academy of Agricul tural Sciences,Hefei,Anhui230031)
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转基因大豆、玉米、水稻深加工产品的五重巢式PCR技术检测
近年主要转基因粮食作物大豆、玉米和水稻加工产品已应用于食品制造业，为此，食品中转基因成分的安全性受到广泛关注。当前，国际贸易和各国食品工业等部门对转基因产品逐步实施IP(Identity Preservation)管理，加强检测监控。
深加工品经过若干道加工程序，理化性质变化、DNA断裂，转基因成分检测的难度大大增加。目前，国际上没有统一的针对转基因粮食作物深加工产品的检测标准，而我国也没有建立有效的检测标准对市场上常见的转基因大豆、玉米和水稻深加工产品中的主要外源CrylA (B)、BAR、CP4 EPSPS和PAT基因进行检测。
五重巢式PCR是近几年出现的检测技术，它结合了巢式PCR的高灵敏度和多重PCR的快速、简单和高特异性特点，可以减少假阳性，可以同时检测多个基因片段，可以使检测灵敏度的下限提高几千倍…3]。五重巢式PCR方法快速、灵敏度高，在人和动物疾病检测和病毒鉴定中应用较多。目前该技术在转基因检测中的应用还较少，仅在转基因大豆深加工制品和转基因水稻种子的检测中有半巢式PCR应用的报道。但这些技术仅能对转基因大豆或水稻单一品种进行检测，在做不同品种或品系转基因成分检测时，需要分别试验，比较繁琐。迄今为止，还没有快速、高通量同时检测不同品种和不同品系的转基因大豆、玉米和水稻外源基因的报道。本研究旨在建立五重巢式PCR体系，探索粮食深加工产品中的转基因成分，实现不同品种和不同品系粮食作物转基因成分的高通量检测，为转基因深加工产品检测标准的建立提供理论基础。
1 材料与方法
1.1材料
1.1.1 试验材料
转基因RR大豆购自美国孟山都公司；转基因玉米Bt11、Bt176由吉林农科院惠赠；转基因水稻由农业部转基因生物安全管理办公室提供；转基因玉米MON810、TC1507、T25和CBH-351购自香港基因芯片公司，作为阳性对照。非转基因大豆、玉米和水稻由东北农业大学农学院提供，作为阴性对照。待检深加工产品大豆蛋白质粉、巧克力饮品、婴儿米粉、大豆卵磷脂、大豆油、大豆色拉油、玉米油、玉米淀粉、玉米蛋白粉、营养麦片（含有稻米成分）和玉米泥均购自超市，均未注明是否含有转基因成分。
1.1.2试验试剂
Wizard@试剂盒，Promega公司(Madison，USA)；Taq DNA聚合酶、dNTP、10×PCR缓冲液（含MgC12）、DL DNA2000分子质量标准，大连宝生物工程有限公司；特异引物，上海英俊生物公司。
1.1.3仪器设备
高速离心机（上海安亭公司，TDL-40B型）、PCR仪（德国Biometra，Biometra Tgradient 型）、核酸电泳仪（杭州托普仪器有限公司，GE-100型）、紫外分光光度仪（美国BECKMAN，DU@ 640型）、凝胶成像系统（美国UVP，G8000型）。
1.2方法
1.2.1 DNA提取
将转基因大豆、玉米、水稻和非转基因转基因大豆、玉米、水稻分别按不同质量比混合成标准品，取标准品和待测样品（按操作说明要求的质量）分别根据Wizard@试剂盒操作说明进行DNA提取，并
用紫外分光光度计将DNA溶液稀释至同一质量浓度(50 ng/uL)。
1.2.2 引物设计
利用Primer Premier V5.0软件进行五重巢式PCR的引物设计，用Oligo V6.22软件筛选出引物之间互相干扰最小的引物，引物所扩增目的片段及扩增产物大小见表1。
1.2.3 五重巢式PCR反应体系
1)第1轮五重PCR反应体系及反应条件。在第1轮五重PCR反应体系中，加DNA模板1uL(50 ng)，dNTP各0.4 mmol/L，2×PCR缓冲液，引物混合液工（CP4 WF/ CP4 WR，0.8umol/L;Rbcl WF/Rbcl WR,0.3 umol/L;CryWF/Cry WR,0.25 umol/L;BAR WF/BAR WR,0.4umol/L; Pat WF/Pat WR，0.4 ptmol/L;)10 uL，DNA聚合酶4 U，补去离子水至50 uL。
扩增条件为：95℃预变性10 min; 95℃30 s，65℃60 s，72℃60 s，10个循环；95℃30 s，62℃60 s，72℃60 s，10个循环；95℃30 s，60℃60 s，72℃60 s，10个循环；95℃30 s，58℃60 s，72℃60 s，10个循环：72℃，10 min。
2)第2轮五重PCR反应体系及反应条件。取第1轮五重PCR产物1_uL作为模板，进行五重巢式PCR第2轮扩增。反应体系中加引物混合液Ⅱ(CP4 NF/ CP4 NR,0.6umol/L; Rbcl NF/Rbcl NR,0. 25 umol/L; CryNF/Cry NR,0.5umol/L; BAR NF/BAR NR,0.3 umol/L;Pat NF/Pat NR,0.6
umol/L;)10 uL，DNA聚合酶4U，其余步骤同前。
扩增条件同上。
3)检测方法的灵敏度分析。将转基因大豆、玉米、水稻和非转基因大豆、玉米、水稻分别按不同质量比混合，使样品转基因成分的含量分别达到5%、1%、5×10-1%、5×10_2%、5×10_3%、10-3%、5×10_4%和10-4%。用上述PCR方法对含混合DNA样品进行灵敏度测试。
4)扩增产物检测。
两轮多重PCR扩增产物用琼脂糖电泳检测，琼脂糖胶质量分数为3%，胶中溴化乙锭质量浓度为0.5ug/mL，电泳缓冲液为1× TAE，以DL-2000 DNA做分子质量标准，电泳条件为10 V/cm电压，电泳lh。
2 结果与分析
2.1 DNA提取
本研究所选材料均是深加工制品，测量所提取DNA样品的OD260值小于0.1以及
OD260/OD280也小于1.5，进行电泳检测时也观察不到DNA条带（图1），说明所提取DNA样品浓度很低。用普通PCR扩增是检测不出结果的，但用随后的五重巢式PCR进行扩增却可以检测到清楚的目的带，说明使用Wizard@试剂盒提取的DNA可以满足五重巢式PCR扩增的需要。
2.2 五重巢式PCR样品检测
第1轮扩增结果见图2(a)，该体系扩增出阳性对照的CP4-EPSPS基因、RBCL基因、CrylA (B)基因、BAR基因和PAT基因，扩增片段大小分别为498、433、321、201和160 bp及阴性对照的RBCL 基因。阳性对照结果说明扩增体系正常，可以扩增出目的基因；阴性对照结果表明实验过程中无假阳性结果，排除转基因成分污染的可能；空白对照无扩增条带说明无污染。但其他泳道未看到扩增结果，表明深加工制品中DNA含量非常低，普通的PCR反应无法进行转基因检测。
第2轮扩增结果(图2(b))显示，卵磷脂、大豆蛋白质粉、巧克力饮品、婴儿米粉扩增出RBCL基因和CP4-EPSPS基因片段，即以上4种样品含有转CP4-EPSPS基因成分；玉米淀粉和玉米泥中扩增出RBCL基因、CrylA (B)基因和PAT基因片段，即以上2种样品含有转CrylA (B)基因和PAT基因成分；玉米蛋白粉扩增出RBCL基因、CrylA(B)基因和BAR基因片段，即含有转CrSA (B)基因和BAR 基因成分；营养麦片扩增出RBCL基因和CrylA (B)基因片段，即含有转CrylA (B)基因成分；大豆精炼油大豆色拉油和玉米油未检出任何条带，即未从这3种样品中提取出DNA。表明经过第2轮的巢式