AFLP a new technique for DNA fingerprinting
分子标记——AFLP原理和操作步骤
分子标记——AFLP原理和操作步骤一、原理AFLP也是通过限制性内切酶片段的不同长度检测DNA多态性的一种DNA分子标记技术。
但AFLP是通过P CR反应先把酶切片段扩增，然后把扩增的酶切片段在高分辨率的顺序分析胶上进行电泳，多态性即以扩增片段的长度不同被检测出来。
实验中酶切片段首先与含有与其共同粘末端的人工接头连接，连接后的粘末端顺序和接头顺序就作为以后PCR反应的引物结合位点。
实验中，根据需要通过选择在末端上分别填加了1～3个选择性核苷的不同引物，可以达到选择性扩增的目的。
这些选择性核苷酸使得引物能选择性地识别具有特异配对顺序的内切酶片段，进行结合，导致特异性扩增。
二、实验试剂Taq酶、EcoRI/ MseIEcoRI/ MseI接头、E+A引物M+C引物、T4DNALigaseE和M引物、琼脂、过硫酸胺、丙烯酰胺、尿素、硝酸银、甲酰胺、dNTPs、二甲苯青、冰醋酸、玻璃硅烷、50bpMark三、操作步骤（一）基因组DNA提取和纯化A、参考实验一的大量提取DNA实验方法，B、DNA的纯化：用0.8%琼脂糖凝胶（含EB0.5μg/ml）电泳检测片段大小，取出其中的1/3已提取的基因组D NA进行纯化，首先用TE缓冲液补满至总体积50ul，再等体积苯酚/氯仿/异戊醇（25：24：1）、氯仿/异戊醇（2 4∶1）各抽提一次，离心吸上清液于Eppendorf管中，加入1/10体积的NaAC和二倍体积预冷的无水乙醇，－20℃放置2h以上，10000g离心10min，用70%的乙醇漂洗DNA沉淀2次，风干后溶于30μlTE缓冲液中，U V-2401PC（岛津）紫外分光光度计检测A260、A280值并定量，再用0.8%琼脂糖凝胶（含EB0.5μg/ml）电泳检测片段大小。
注：0.1-0.2g组织可用100ul溶液E溶，0.5g组织，溶液E可增加至300ul，此时DNA浓度大约为100ng/ul。
（二）限制性酶切及连接在0.2ml离心管中加入：模板量约为250ng，2.5μl 10×酶切缓冲液， 2.5μl 10×T4DNA连接酶切缓冲液，5U EcoRⅠ，5U MseⅠ，2U T4连接酶，50pmol MseⅠ接头（序列见表2），双蒸水补至25μl。
AFLP标记技术的发展和完善
而建立的 ， 该方法首先采用单一限制性内切酶如 接着 !"# ! 消化基因组 "#$ 或 !"#$ 并连接接头， 用无选择性碱基引物进行扩增， 产生了没有甲基化 扩增产物再经对甲基化敏感的内切 , 残基的模板， 酶如 $"% !进行二次消化， 然后接相应接头， 接着用 带有选 择 性 碱 基 的 标 准 $&’( 引 物 进 行 第 二 次 扩 增， 其产生的带型与标准 $&’( 所产生的带型进行 比较， 原来在 $"% ! 位点包含有甲基化的 , 残基经 过初始的无选择性碱基引物扩增后可以被 $"% ! 二 次消化， 而标准 $&’( 的原始模板在 $"% ! 位点被甲 基化了的 , 残基则不能被 $"% !消化。 !"+ — —三限制性酶切 ’()* ,-&’()*— ［ ］ -.*$&’( 是 /01 234 56477 #% &’ 8 报道的一种基
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李 韬
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教育部植物功能基因组学重点实验室， 江苏省作物遗传生理重点实验室， 扬州大学
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AFLP分子标记技术在昆虫学研究中的应用
AFLP 分子标记技术在昆虫学研究中的应用3郑先云 马恩波33 郭亚平(山西大学生命科学与技术学院 太原 030006)Applications of the AF LP molecular genetic m arker in E ntomology .ZHE NG X ian 2Y un ,M A En 2Bo 33,G UOY a 2Ping (College o f Life Science and Technology ,Shanxi Univer sity ,T aiyuan 030006,China ).Abstract Amplified fragment length polym orphism (AF LP )is a novel m olecular fingerprinting technique based on PCR reaction and the RF LP technique.The superiority of AF LP analysis resides in its rich polym orphism ,g ood stability and reliability ,high power of reproducibility ,ability to w ork with smaller quantities of DNA and no requirement for prior sequence knowledge of the genome.AF LP has been used extensively for the construction of genetic mapping ,genetic diversity studies ,phylogenetic study and tax onomy ,genetic breeding and qualitative judgment ,location of target genes and s o on.This review describes its principles and applications in entom ology.K ey w ords m olecular genetic marker ,AF LP ,entom ology摘 要 AF LP 分子标记技术是一种建立在PCR 技术和RF LP 标记基础上的新的DNA 指纹分析技术,具有多态性丰富、结果稳定可靠、重复性好、所需DNA 量少、可以在不知道基因组序列的情况下进行研究等特点,现已广泛用于构建遗传图谱、遗传多样性研究、系统进化及分类学、遗传育种和品质鉴定以及基因定位等方面。
AFLP分子标记技术的发展
文章编号:100021336(2003)0120065203AFLP 分子标记技术的发展郑先云 郭亚平 马恩波(山西大学生命科学与技术学院,太原030006)摘要:AFL P 分子标记技术是一种建立在PCR 技术和RFL P 标记基础上的新的DNA 指纹分析技术,具有多态性丰富、结果稳定可靠、重复性好、所需DNA 量少,且可以在不知道基因组序列的情况下进行研究等特点,现已被广泛用于构建遗传图谱、遗传多样性研究、系统进化及分类学、遗传育种和品质鉴定以及基因定位等方面。
介绍AFL P 技术的原理以及AFL P 技术基础上条件的改进。
关键词:分子遗传标记;AFL P ;条件优化中图分类号:Q7收稿日期:2002209229国家自然科学基金(No.30170612)和山西省自然科学基金项目(No.991096)资助作者简介:郑先云(1974—),女,博士生;马恩波(1953—),女,博士生导师,教授,本文联系作者。
扩增片段长度多态性(amplified fragment length polymorphism ,AFL P )是一种基于PCR 和RFL P 基础上发明的DNA 指纹技术。
该技术与RFL P 的主要区别是用PCR 代替Southern 杂交,它兼有RFL P 技术的可靠性和PCR 技术的高效性,且具有快速、灵敏、稳定、所需DNA 量少、多态性检出率高、重复性好、可以在不知道基因组序列特点的情况下进行研究等特点,所以被认为是一种十分理想的、有效的、先进的分子标记,现已被广泛用于遗传图谱构建、遗传多样性研究、基因定位及品质鉴定等方面。
1.AFLP 技术的原理AFL P 技术是建立在基因组限制性片段基础上的PCR 扩增。
由于不同物种的基因组DNA 大小不同,基因组DNA 经限制性内切酶酶切后,产生分子量大小不同的限制性片段。
使用特定的双链接头与酶切DNA 片段连接作为扩增反应的模板,用含有选择性碱基的引物对摸板DNA 进行扩增,选择性碱基的种类、数目和顺序决定了扩增片段的特殊性,只有那些限制性位点侧翼的核苷酸与引物的选择性碱基相匹配的限制性片段才可被扩增。
AFLP标记及其在园艺植物遗传育种中的应用
[收稿日期]20040911[基金项目]国家科技部基础性工作资助项目(00-18) [第一作者简介]陈启亮(1976),男,湖北枝江市人,湖北省农业科学院果茶蚕桑研究所助理研究员AFLP 标记及其在园艺植物遗传育种中的应用陈启亮(湖北省农业科学院果茶蚕桑研究所,湖北武汉430209) 李清国(武汉市东西湖区园艺所,湖北武汉430040) 田 瑞(湖北省农业科学院果茶蚕桑研究所,湖北武汉430209) 张青林 (华中农业大学园艺园林学院,湖北武汉430070)[摘要]A FL P (扩增片段长度多态性)标记是一种新的DN A 分子标记技术,对其基本原理、方法及特点做了简要介绍。
从遗传多样性和亲缘关系分析、品种鉴定和指纹图谱构建、遗传图谱构建、基因定位与克隆、QT L 定位、标记辅助选择育种、基因表达与调控研究等方面概述了A FL P 标记在园艺植物上的应用进展,并对其存在的问题和应用前景做了探讨。
[关键词]A FL P 标记;园艺植物;遗传育种[中图分类号]S603 2;Q 78[文献标识码]A [文章编号]16731409(2005)02001906AFLP (amplified fragm ent length polym orphism)即扩增片段长度多态性,是RFLP 技术和PCR 技术的结合。
A FLP 标记结合了RFLP 标记的高重复性与RAPD 标记不需要预先知道基因组背景,多态位点丰富等优点,克服了RFLP 检测位点有限和RA PD 的不稳定性等缺点,目前已经广泛应用于多种植物的遗传育种研究,如水稻[1]、玉米[2]、小麦[3]、枳[4]、柿[5]、花椰菜[6]等。
笔者拟对AFLP 标记原理、方法特点及其在园艺植物遗传育种研究中的应用做概要介绍。
1 AFLP 技术的原理、基本反应程序及特点1 1 AFLP 技术的发展AFLP 技术是1993年由荷兰科学家Zabeau 和Vos 建立并发展起来的一种检测DNA 多态性的新方法。
大白菜基因组DNA的提取及AFLP反应体系的建立
菜基因组 ＡＦＬＰ 分析的技术体系，为从分子水平上 认识大白菜种质的遗传多样性和遗传亲缘关系、构 建大白菜遗传连锁图谱等研究奠定基础。
１ 材料和方法
蔬菜，在全国蔬菜栽培面积中占第一位（中华人民共 １．１ 大白菜种质材料
和国农业部，２００４），对其基础理论以及重要经济性
状进行分子水平的研究，为有效地利用现有资源进
分子植物育种 ３７２ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｌａｎｔ Ｂｒｅｅｄｉｎｇ
１．２ 试剂
１０ ×Ｈ Ｂｕｆｆｅｒ，ＤＮＡ 模 板 ４．０ μＬ （ 约 １２０ ｎｇ），和
本试验采用 ＡＦＬＰＴＭ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ Ｉ Ｋｉｔ，内切 酶为 ＥｃｏＲⅠ／ＭｓｅⅠ。ＡＦＬＰ Ｐｒｅ－ａｍｐ Ｐｒｉｍｅｒ ＭｉｘⅠ、引 物试剂盒、１００ ｂｐ ＤＮＡ ｌａｄｄｅｒ、３０￣３３０ ｂｐ ＤＮＡ ｌａｄｄｅｒ 均为 Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ 公司产品。Ｔａｑ 酶选用赛百盛产品。
分子标记技术与数值分类方法相结合，是研究 植物遗传多样性与亲缘关系，从而对品种资源合理 利用与保护的有利工具（黄建安等， ２００６）。扩增片段 长度多态性（ＡＦＬＰ）是 ２０ 世纪 ９０ 年代初期发展的一
种分子标记技术，该技术结合了 ＲＦＬＰ 的稳定性和 ＲＡＰＤ 技术的简便高效性，同时又能克服 ＲＦＬＰ 带型 少、信息量小以及 ＲＡＰＤ 技术不稳定的缺点（杨娟等， ２００５； 王惠哲等， ２００７）。因为 ＡＦＬＰ 技术显现的多态
编号 Ｓｅｒｉａｌ Ｎｏ． １７ １８ １９ ２０ ２１ ２２ ２３ ２４ ２５ ２６ ２７ ２８ ２９ ３０ ３１ ３２
种质名称（代号） Ｇｅｒｍｐｌａｓｍ ｎａｍｅｓ 正定二桩 Ｚｈｅｎｇｄｉｎｇ Ｅｒｚｈｕａｎｇ 安阳大包 Ａｎｙａｎｇ Ｄａｂａｏ 玉泉抱头青 Ｙｕｑｕａｎ Ｂａｏｔｏｕｑｉｎｇ 大青口核桃纹 Ｄａｑｉｎｇｋｏｕ Ｈｅｔａｏｗｅｎ 通县大青口 Ｔｏｎｇｘｉａｎ Ｄａｑｉｎｇｋｏｕ 北京橘红心 Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｊｕｈｏｎｇｘｉｎ 兴城麻叶 Ｘｉｎｇｃｈｅｎｇ Ｍａｙｅ 晋菜三号 Ｊｉｎｃａｉ３ 连江平头连江白 Ｌｉａｎｊｉａｎｇ Ｐｉｎｇｔｏｕ Ｌｉａｎｊｉａｎｇｂａｉ 鱼溪白 Ｙｕｘｉｂａｉ 集安大花心 Ｊｉ＇ａｎ Ｄａｈｕａｘｉｎ 泌阳菊花心 Ｂｉｙａｎｇ Ｊｕｈｕａｘｉｎ 福山二包头 Ｆｕｓｈａｎ Ｅｒｂａｏｔｏｕ 福山大包 Ｆｕｓｈａｎ Ｄａｂａｏ 焦作小包心 Ｊｉａｏｚｕｉ Ｘｉａｏｂａｏｘｉｎ 洛阳大包头 Ｌｕｏｙａｎｇ Ｄａｂａｏｔｏｕ
AFLP-a new technique for DNA fingerprinting
Received July 14,1995; Revised and Accepted October 5,1995
ABSTRACT A novel DNA fingerprinting technique called AFLP is described. The AFLP technique is based on the selective PCR amplification of restriction fragments from a total digest of genomic DNA. The technique involves three steps: (i) restriction of the DNA and ligation of oligonucleotide adapters, (ii) selective amplification of sets of restriction fragments, and (iii) gel analysis of the amplified fragments. PCR amplification of restriction fragments is achieved by using the adapter and restriction site sequence as target sites for primer annealing. The selective amplification is achieved by the use of primers that extend into the restriction fragments, amplifying only those fragments in which the primer extensions match the nucleotides flanking the restriction sites. Using this method, sets of restriction fragments may be visualized by PCR without knowledge of nucleotide sequence. The method allows the specific co-amplification of high numbers of restriction fragments. The number of fragments that can be analyzed simultaneously, however, is dependent on the resolution of the detection system. Typically 50-100 restriction fragments are amplified and detected on denaturing polyacrylamide gels. The AFLP technique provides a novel and very powerful DNA fingerprinting technique for DNAs of any origin or complexity. INTRODUCTION DNA fingerprinting involves the display of a set of DNA fragments from a specific DNA sample. A variety of DNA fingerprinting techniques is presently available (1-11), most of which use PCR for detection of fragments. The choice of which fingerprinting technique to use, is dependent on the application e.g. DNA typing, DNA marker mapping and the organism under investigation e.g. prokaryotes, plants, animals, humans. Ideally, a fingerprinting technique should require no prior investments in terms of sequence analysis, primer synthesis or characterization of DNA probes. A number of fingerprinting methods which meet these requirements have been developed over the past few years, including random amplified polymorphic DNA (RAPD; 8), DNA amplification fingerprinting (DAF; 9) and arbitrarily primed PCR (AP-PCR; 10,11). These methods are all based on the amplification of random genomic DNA fragments by arbitrarily selected
生物学综合性实验
扩增产物凝胶电泳
扩增片段通常用变性聚丙烯酰胺凝 胶电泳，根据扩增片段大小范围选 择应用4%一10%的凝胶电银染、荧 光测序仪等方法显示结果， 通过Gene-Scan, Gel-Compare 等软件进行数据分析。
DNA的提取（SDS法和CTAB法）
SDS是Sodium dodecyl sulfate的缩写称为 十二烷基磺酸钠， CTAB是Cetyl trimethyl ammonium bromide的缩写十六烷基三甲基溴化氨， 两种都是去污剂，它们都能破坏细胞膜 使膜蛋白变性沉淀，故而使核酸释放出 来，另外，它还能保护DNA不受内源核 酸酶的降解。
主要是因为生物具有多样性 ！！？？
生物的多样性主要包括四个层次即：遗 传多样性、物种多样性、生态系统多样 性和景观多样性。 而遗传多样性是其它多样性的基础，也 可以说，生物多样性归根到底就是遗传 多样性。 那么遗传多样性又是如何检测的呢？
（1）形态学标记 （2）细胞学标记 （3）生化标记 （4）分子标记
利用一套特别的引物在不需要知道DNA序列的情况下， 可在一次单个反应中检测到大量的片段。由于AFLP扩增 可使某一品种出现特定的DNA谱带，而在另一品种中可 能无此谱带产生，因此，这种通过引物诱导及DNA扩增 后得到的DNA多态性可作为一种分子标记。所以说AFLP 技术是一种新的且功能强大的DNA指纹技术。
连接
酶切后的DNA片段在T4 DNA连接酶作用 下与两种内切酶相应的特定接头相连接， 形成带接头的特异性片段。接头为双链， 由两部分组成，一部分是核心序列，一部 分是酶特定序列(能与酶切片段粘端互补)， 通常在酶特定序列中变换了一个内切酶识 别位点的碱基，保证了连接片段不能再被 酶切。只有遵循“引物扩增原则”设计的 接头才能得到满意的扩增结果。
AFLP的原理及其应用
基础理论 Basic researchA FLP的原理及其应用王 斌 翁曼丽(中国科学院遗传研究所 100101)提 要:AFLP是检测DNA多态性的一种新的分子标记技术。
对其起源、基本原理、技术程序和应用范围及前景进行了介绍和描述。
关键词:分子标记技术 AFLP 原理 应用1 分子标记技术的快速发展在过去10a中,分子标记技术得到了突飞猛进的发展,至今已有10余种分子标记技术相继出现,并在各个研究领域得到了应用。
其中在植物分子生物学领域中应用最广泛的是RF LP和RA PD。
R FL P 的结果稳定可靠,重复性好,特别适应于建立连锁图,例如水稻RF LP连锁图的建立〔1,2〕。
RF L P比较作图进一步揭示了在主要粮食作物中,R FL P标记在染色体上的排列具有类似的顺序〔3,4〕。
因此R FL P 自出现至今虽然已有10多a了,但它仍是当今应用最广泛的一种分子标记。
然而,R FL P必须经过滤膜转移和So uthern杂交,费时、费力、周期长。
另外, RF L P对DN A多态性检出的灵敏度不高,RF L P连锁图上还有很多大的空间区,这限制了它的进一步发展。
PCR对分子标记技术的发展产生了巨大的推动作用,迄今所用的分子标记技术尽管可以分为多种类型,其实除了以传统的Souther n杂交为基础的RF L P外,其它各类分子标记都涉及P CR。
R AP D就是以随机引物为模板通过P CR扩增进行DN A多态性研究的,与RF LP相比,它较便宜,方便易行,非常灵敏,DN A用量少,而且不需要同位素,安全性好。
继RF L P之后,RA PD是应用最广泛的,特别是在寻找与目的基因连锁的分子标记方面,近年来报道了大量的与各种目的基因连锁的R AP D标记。
近来西红柿P to基因和水稻Xa21基因的成功分离就是首先找到了与目的基因紧密连锁的RA PD标记,然后通过M BC(M ap based clo ning)方法克隆了目的基因〔5,6〕。
AFLP 分子标记及其在茶树遗传育种中的应用
AFLP 背景介绍
• AFLP优点：DNA 用量少、灵敏度高, 丌需要预先知道基因 组的信息。一般一次反应可得到50～150 个扩增片段, 具有 很高的可靠性, 被认为是效率最高的标记。AFLP 采用长引 物和更高的退火温度迚行PCR, 比RAPD 等其他以PCR 为基 础的分子标记具有更好的重复性。这种方法由亍结合了 RFLP 和PCR 的优点, 既具有RFLP 可靠性好、重复性高的特 点, 同时又具有PCR 的高效性、安全性和方便性的优点 。 AFLP 标记所检测的多态性本质上不RFLP 一致,但技术上却 简单的多, 幵丏可以通过控制引物随机核苷酸的种类和数 目来调节AFLP 产物的条带的特异性和数量, 因此能提供较 多的基因组多态性信息。
模板DNA 的制备
• 用亍限制性片段切割的二种酶，一种是罕见切割酶，一 种是常用切割酶。 • AFLP 的接头是一种人工合成的双链DNA , 长度一般为14～ 18 个核苷酸, 由核心序列和内切酶位点特异序列两部分组 成。由亍EcoRI 酶切可以产生小片段DNA 便亍扩增, MseⅠ 酶切可以产生小而稳定的酶切片段, 因此, 目前EcoRI 接头 和MseⅠ接头已广泛应用亍AFLP 多态性分析中。
AFLP 标记的技术关键
1、模板DNA 的质量
2、引物、接头的合成及引物的巧妙组合
3、优化反应条件, 重视检测手段
模板DNA 的质量
• 高质量DNA 的成功制备和避克部分降解至兲重要, 基因组DNA260/280 的OD 值应为1. 8 左右。在制 备DNA 的过程中要注意避克核酸酶及各种失活物 质的污染。
DNA 扩增反应
• 以酶切后连接产物作为模板, 用人工合成的选择性单链寡 核苷酸作为引物，在Taq聚合酶的作用下，完成AFLP的选 择性扩增。酶切片段要经过连续两次PCR 扩增。 • 预扩增采用含有一个选择性碱基戒丌含选择性碱基的引 物迚行。 • 目的：为了减少选择性碱基的错配, 为选择性扩增提供更 多的模板, 同时对模板起到选择性纯化的作用, 避克直接 扩增造成的指纹带型背景拖尾现象, 从而使产生的指纹图 谱更清晰和具有更好的重复性。
AFLP分子标记技术
•二、AFLP的基本原理是什么？•三、AFLP的实验过程怎样？•四、AFLP的应用研究如何？•五、对AFLP的评价分子标记的历史：•第一代分子标记技术RFLP（Restriction Fragment Length Polymorphism，限制性片段长度多态性）•第二代分子标记技术RAPD（Random Amplified PolymorphicDNA，随机扩增多态性DNA）AFLP（AmplifiedFragmentLengthPolymorphism，扩增片断长度多态性）•事实上，还有很多分子标记技术像SSR、ISSR、SRAP（相关序列扩增多态性）另外，还有现在号称为第三代分子标记的SNP（单核苷酸多态性)等AFLP的基本原理•基因组DNA经两种限制性内切酶酶切，形成分子量大小不等的随机限制性酶切片段，将特定的人工合成的短的双链接头连在这些片段的两端，形成一个带接头的特异片段，通过接头序列和PCR引物3ˊ端选择性碱基的识别，对特异性片段进行预扩增和选择性扩增。
最后只有那些两端序列能与选择性碱基配对的限制性酶切片段才能被扩增；最后将选择性扩增产物在高分辨率的变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳，寻找多态性扩增片段。
AFLP的实验流程•模板制备DNA的提取（SDS法和CTAB法）酶切连接PCR扩增(PCR AMPLIFIED )预扩增(Pre-amplified)选择性扩增(Elective amplified)DNA的提取（SDS法和CTAB法）•SDS是Sodium dodecyl sulfate的缩写称为十二烷基磺酸钠，•CTAB是Cetyltrimethyl ammoniumbromide的缩写十六烷基三甲基溴化氨，•两种都是去污剂，它们都能破坏细胞膜使膜蛋白变性沉淀，故而使核酸释放出来，另外，它还能保护DNA不受内源核酸酶的降解。
酶切•为了使酶切片段大小分布均匀，一般采用两个限制性内切酶，一个用6个碱基识别位点的限制性内切酶(常用EcoRI,、PstI或SacI)，另一个用4个碱基识别位点的限制性内切酶(常用MseI、TaqI)。
AFLP分子标记技术及其应用
AFLP分子标记技术及其应用孙晓鹏（北京师范大学生命科学学院生态学专业）摘要：扩增片段长度多态性(AFLP，Amplified restriction fragment polymorphism)，是1993年荷兰科学家Zabeau和Vos 发展起来的一种检测DNA多态性的分子标记技术。
文章主要讲述该技术的原理、流程及特点，并从以下三个方面讲述该技术的应用情况：动物学方面，讲述其在动物遗传学，动物系统学，性别鉴定与繁殖行为研究上的应用；植物学方面，讲述其在种质资源鉴定，作物育种上的应用；医学方面，讲述其在肿瘤，遗传病，流行病学方面的进展。
文章还分析了AFLP技术的优缺点并展望了其应用前景。
关键词：AFLP，分子标记技术，应用目前遗传标记主要有4种类型，即形态标记(Morphological Markers)、细胞标记(Cytological Markers)、生化标记(Biochemical Markers)和分子标记(Molecular Markers) [1]。
分子标记一般指DNA标记。
分子标记依据所用的分子生物学技术,大致分为三大类：(Ⅰ)以电泳技术和分子杂交技术为核心,其代表性技术有RFLP和DNA指纹技术(DNA Fingerprinting) 。
（Ⅱ）以电泳技术和PCR技术为核心,其代表性技术有RAPD( Random amplified polymorphism DNA) 、SSLP(Simple sequence length polymorphism ,或称Sequence-tagged microsatellitesite, STMS)和AFLP。
（Ⅲ）基于DNA芯片技术的分子标记,即SNP[ 2-4 ]。
其中，扩增片段长度多态性(AFLP，Amplified restriction fragment polymorphism)，是1993年荷兰科学家Zabeau和Vos发展起来的一种检测DNA多态性的方法，已获欧洲专利局的发明专利。
几种常用的分子标记.
RAPD标记的特点： 1.RAPD标记引物扩增产物所扩增的DNA区段是事
先未知的，具有随机性和任意性，因此随机引物PCR标 记技术可用于对任何未知基因组的研究。
2.RAPD标记的不足之处是，一般表现为显性遗传， 不能区分显性纯合和杂合的基因型，因而提供的信息 量不完整。
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品系1 品系2
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S451对DH962×冀棉5号F2群体扩增图
RAPD可用于对整个基因组DNA进行多态性检测，也可 用于构建基因组指纹图谱。
1.品种鉴定、系谱分析：用于识别种群、家族、 种内或 种间的遗传变异，为生物血缘关系或分类提供依据，还可以 分析混合基因组样品等。
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头 （c）寡核苷酸接头与限制片段连接 （d）用选择性引物进行PCR扩 增
种子生产与经营专业教学资源库
四、简单序列重复（SSR）标记
又称微卫星，是一类由几个（一般2-6个）核苷酸为 重复单位组成的长达几十个核苷酸的串联重复序列。如 (CA)n、(AT)n、(GGC)n等。
微卫星DNA的简单序列的重复次数在同一物种的不同 品种或不同个体中存在较大的差异，即微卫星座位上存在 丰富的等位基因。如在水稻中，RFLP座位的等位基因数 为2-4个，而SSR的等位基因数为2-25个。
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三、扩增片段长度多态性（AFLP）标记
AFLP标记，是结合RFLP和PCR的优点发明的一种 DNA指纹技术。通过对基因组DNA酶切片段的选择性扩 增来检测DNA酶切片段长度的多态性 。
aflp技术
AFLP技术1 导论扩增酶切片段多态性（Amplified Restriction fragment polymorphism，AFLP）是由Zabeau等（1992）发明，并于1993年获得欧洲专利，该专利的专利权现在由荷兰Keygene公司拥有；被誉为新一代的分子标记技术。
AFLP实质上是RFLP和RAPD的的结合和发展，它继承了RFLP的可靠性和RAPD的方便敏捷。
AFLP只需要极少量的DNA材料，不需要Sourthern杂交，不需要预先知道DNA的顺序信息，实验结果可以提供大量稳定可靠的信息。
同时，AFLP产物是典型的孟德尔方式遗传。
AFLP的基本原理是对基因组DNA限制性酶切片段进行选择性扩增。
首先用限制性酶产生基因组DNA酶切片段，然后使用双链接头与基因组DNA的酶切片段相连接形成扩增反应的模板。
接头与接头相邻的酶切片段的几个碱基序列作为引物的结合位点。
引物由三部分组成：①核心碱基序列，该序列与人工接头互补；②限制性内切酶识别序列；③引物3’端的选择碱基。
选择碱基延伸到酶切片段区，这样只有那些两端序列能与选择碱基配对的限制性酶切片段被扩增。
扩增片段通过变性聚丙烯酰胺电泳分离检测。
被扩增的DNA限制性酶切片段由二个限制性内切酶产生，一个为酶切位点较少的限制性酶（如EcoR I），另一个为多酶切位点的限制酶（如Mse I）。
所以，AFLP反应的结果是主要扩增那些由上述两种酶共同酶切的片段。
采用双酶切的原由是：①多位点酶切产生小的DNA片段，这些片段易被扩增且片段长短适宜在变性胶上分离；②切点数少的酶可减少扩增片段的数目。
由于扩增片段是由多切点酶和切点数较少的酶酶切后产生酶切片段，这样就可选择扩增时所需的选择碱基数目限制在一定的范围内；③利用双酶切使对PCR产物的单链进行标记成为可能，从而防止胶上由于扩增片段双链迁移率不一致而造成的双带现象（doublets）；④双酶切可以对扩增片段的数目进行使活调节；⑤通过少数引物可产生许多不同的引物组合，从而产生大量的不同的AFLP指纹。
第六讲 AFLP技术及其在果树学上的应用
第六讲扩增片段长度多态性（AFLP）技术及其在果树学上的应用（一）AFLP 技术的发展及其原理1． 1限制性内切酶1． 2模板1． 3引物设计1． 4PCR反应（二）AFLP 技术方法及其特点2． 1AFLP的方法2． 2AFLP技术的关键3． 3引物设计3． 4DNA模板质量和浓度要求3． 5PCR产物检测（四）AFLP技术在果树上的应用4． 1种质资源遗传多样性及起源与进化研究4． 2果树品2． 3AFLP的技术特点及评价（三）影响AFLP技术试验成功的关键因素3． 1限制性核酸内切酶的选择和组合3． 2接头设计种鉴别4． 3体细胞无性系变异的监测4． 4分子遗传图谱的构建4． 5目标基因的定位和克隆（五）AFLP技术存在的问题分子标记发展至今，可以划分为三个阶段，RFLP是第一代分子标记，该技术以电泳技术和分子杂交技术为核心，结果稳定可靠，重复性好，适应于建立遗传图谱，但它对DNA 检出的灵敏度不高，不适应于目前人们对DNA分析精度越来越高的要求；第二代分子标记是RAPD，以电泳技术和PCR技术为核心，该技术简便易行，灵敏度高，缺点是结果的重复性差，稳定性难以保证，在不同实验条件下、设备及操作的情况下得到的实验结果差异很大；AFLP是第三代分子标记，是近年来发展起来的很具生命力的分子生物学技术，本技术结合了RFLP和PCR技术的特点，具有RFLP的稳定性和PCR技术的高效性。
利用这一方法，在不需要预先知道DNA序列信息的情况下就可以同时进行多数DNA酶切片的PCR扩增。
（一）AFLP技术的发展及其原理AFLP(Amplified Fragment Length Polymorphism, 扩增片段长度多态性)是1993年由荷兰科学家M.Zabeau和P.V os发展起来的一种检测DNA多态性的新方法，该技术于1993获得欧洲专利局专利（ZABEAU M，1993），其专利权归属荷兰Keygene公司。
DNA指纹技术PPT课件
三、DNA指纹的特点
• 多位点性 高分辨率的DNA指纹图谱通常由 15-30条带 组成，看上去就像挂号信上的条码签一样。DNA指纹区 中的绝大多数区带是独立遗传的，因此一个DNA指纹探 针能同时检测基因组中数十个位点的变异性。
• 简单的遗传方式 DNA指纹图中的区带是可以遗传的， 这不同于人的指纹。DNA指纹区带遵循简单的孟德尔遗 传方式。后代图中的每一条带都可以在双亲之一的图中找 到，只有0.004的可能性使子女中的一条带不能在其父 母中的图中找到。同一个体无病变的不同组织产生的 DNA指纹图完全相同，并能在培养的细胞株中维持下去 。需要说明的是，同卵双胞胎的DNA指纹图完全相同。
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第一个DNA指纹
• 早在1984年，英国莱斯特大学的遗传学家Jefferys及 其合作者首次通过DNA分子生物学实验方法获得了一系 列可以在胶片上看到的图纹，这些图纹极少有两个人完全 相同，故称为“DNA指纹”，意思是它与人的指纹一样是 每个人所特有的。
• 人类历史上第一个用DNA指纹破案的例子也是由 Jefferys参与完成的。在1986年的一起发生在英国列 斯特郡的奸杀案中，Jefferys使用DNA指纹成功的证明 了当时一名嫌疑男子并非真正凶手。
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• 高度变异性 不同的个体或群体有不同的DNA指 纹图。一般选用任何一种识别四个碱基的内切酶 来切DNA，经过电泳后，这种个体间差异性就能 表现出来。英国遗传学家杰弗里斯对白种人研究 表明，两个随机个体具有完全相同的DNA指纹图 的概率为3000亿分之一，两个同胞个体具有相 同图谱的概率也仅仅为200万分之一。7来自二、DNA指纹图谱的构建
• 国外在20世纪70年代发展起来的DNA片段分析技术—— 限制性片段长度多态性标记（RFLP）在许多领域都有成功 的应用，也常用于构建各种DNA指纹图谱。
AFLP实验流程protocol(精)
AFLP实验流程protocolStep1 DNA提取（DNA extraction）Using CTAB method （这个我们现在都是用试剂盒提取了，不知道你们用什么提取，还是发给你，AFLP对DNA纯度和浓度的要求很高，CTAB很难满足这个要求，尤其是纯度要求）1.裂解液的制备：检查水浴锅是否有水，打开设温65℃，将CTAB母液预热溶解，按照每管1ml的体积取CTAB母液，加入3％PVP（即0.03g/管），加热溶解，使用前．．．加入1～2％β-巯基乙醇（即10～20μl/管）2.取样：称取0.02~0.025g（即20~30mg）硅胶干燥的样品，放入fastprep管中，做好标记。
※NOTE：样品在放入管中时，挑取幼嫩的叶片，尽量不要将叶脉等维管组织放入，切误将一个管中的样品溅入另一个管中。
3.打碎：将称好的样品放入fastprep打碎机中打碎，speed 5.0 time 30s, 取出加入制备好的CTAB裂解缓冲液800μl/管，（※NOTE：裂解液的体积应该在fastprep管的一半以上，注意盖好管冒，防止裂解液在打碎和裂解的时候溢出。
），混匀，使裂解液和样品充分接触，再打一次speed 5.0 time 30s。
4.裂解：水浴65℃，1h，注意在裂解的过程中每隔10min要混匀一次，（※NOTE：越到裂解的后期动作越要温和，防止DNA剪切破碎。
）5.抽提：取出水浴样品，冷却至室温．．．．．，加入-20℃等体积（800μl/管）氯仿：异戊醇（24：1），手摇晃混合均匀．．．．．．．，离心：室温，12000r/min，10min。
6.再次抽提：取上层液体约550μl，（※NOTE：尽量少取，不要将杂质一并取出）转入一个灭菌1.5ml离心管中，做好标记，加入等体积加入－20℃等体积（800μl/管）氯仿：异戊醇（24：1），手摇晃混合均．．．．．．匀．，离心：4℃，14000r/min，10min。