紫外分光光度法测定蛋白质含量

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紫外分光光度法测定蛋白质含量

紫外分光光度法测定蛋白质含量化学2班李永亮41007061【实验目的】（1）学习紫外分光光度法测定蛋白质含量的原理；（2）掌握紫外分光光度法测定蛋白质含量的实验技术；（3）掌握TU-1901紫外-可见分光光度计的使用方法并了解此仪器的主要构造。

【实验原理】本实验采用紫外分光光度法测定蛋白质含量。

蛋白质中酪氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键，因此，蛋白质具有吸收紫外光的性质，其最大吸收峰位于280 nm附近（不同的蛋白质吸收波长略有差别）。

在最大吸收波长处，吸光度与蛋白质溶液的浓度的关系服从朗伯-比耳定律。

该测定法具有简单、灵敏、快速高、选择性，且稳定性好，干扰易消除，不消耗样品，低浓度的盐类不干扰测定等优点。

利用紫外吸收法测定蛋白质含量准确度较差，其主要原因有两个：其一对于测定那些与标准蛋白质中赖氨酸和色氨酸含量差异较大的蛋白质，有一定误差，故该法适于测定与标准蛋白质氨基酸组成相似的蛋白质；其二若样品中含有嘌呤、嘧啶等吸收紫外光的物质，会出现较大干扰。

【实验仪器与试剂】仪器：TU-1901紫外-可见分光光度计，比色管，吸量管，胶头滴管试剂：标准蛋白质溶液（3.00mg/mL）,0.9% NaCl溶液，待测蛋白质溶液【实验步骤】一、准备工作1、启动计算机，打开主机电源开关，启动工作站并初始化仪器。

2、在工作界面上选择测量项目（光谱扫描，光度测量），本实验选择光度测量，设置测量条件（测量波长等）。

3、将空白放入测量池中，点击开始扫描空白，点击基线校零。

4、标准曲线的绘制二、测量工作1、吸收曲线的绘制用吸量管吸取2mL3.00mg/mL 标准蛋白质溶液于10mL 比色管中，用0.9% NaCl 溶液稀释至刻度，摇匀。

用1cm 石英比色皿，以0.9% NaCl 溶液为参比，在190 nm ～400nm 区间，每隔2nm 测量一次吸光度，记录数据。

2、标准曲线的制作用吸量管分别吸取1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL 3.00 mg/mL 标准蛋白质溶液于5只10 mL 比色管中，用0.9% NaCl 溶液稀释至刻度，摇匀。

常用紫外分光光度法测定蛋白质含量

6种方法测定蛋白质含量一、微量凯氏（kjeldahl）定氮法样品与浓硫酸共热。

含氮有机物即分解产生氨（消化），氨又与硫酸作用，变成硫酸氨。

经强碱碱化使之分解放出氨，借蒸汽将氨蒸至酸液中，根据此酸液被中和的程度可计算得样品之氮含量。

若以甘氨酸为例，其反应式如下：nh2ch2cooh+3h2so4——2co2+3so2+4h2o+nh3 (1)2nh3+h2so4——(nh4)2so4 (2)(nh4)2so4+2naoh——2h2o+na2so4+2nh3 (3)反应（1）、(2)在凯氏瓶内完成，反应（3）在凯氏蒸馏装置中进行。

为了加速消化，可以加入cuso4作催化剂，k2so4以提高溶液的沸点。

收集氨可用硼酸溶液，滴定则用强酸。

实验和计算方法这里从略。

计算所得结果为样品总氮量，如欲求得样品中蛋白含量，应将总氮量减去非蛋白氮即得。

如欲进一步求得样品中蛋白质的含量，即用样品中蛋白氮乘以6．25即得。

二、双缩脲法（biuret法）（一）实验原理双缩脲（nh3conhconh3）是两个分子脲经180℃左右加热，放出一个分子氨后得到的产物。

在强碱性溶液中，双缩脲与cuso4形成紫色络合物，称为双缩脲反应。

凡具有两个酰胺基或两个直接连接的肽键，或能过一个中间碳原子相连的肽键，这类化合物都有双缩脲反应。

紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关，故可用来测定蛋白质含量。

测定范围为1-10mg蛋白质。

干扰这一测定的物质主要有：硫酸铵、tris缓冲液和某些氨基酸等。

此法的优点是较快速，不同的蛋白质产生颜色的深浅相近，以及干扰物质少。

主要的缺点是灵敏度差。

因此双缩脲法常用于需要快速，但并不需要十分精确的蛋白质测定。

（二）试剂与器材1. 试剂：（1）标准蛋白质溶液：用标准的结晶牛血清清蛋白（bsa）或标准酪蛋白，配制成10mg/ml的标准蛋白溶液，可用bsa浓度1mg/ml的a280为0.66来校正其纯度。

试验三紫外分光光度法测定蛋白质

实验三紫外分光光度法测定蛋白质一、原理由于蛋白质中酪氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键，因此蛋白质具有吸收紫外光的性质，吸收高峰在280nm 。

在此波长范围内，蛋白质溶液的光吸收值与其含量呈正比关系，可用作定量测定。

利用紫外吸收法测定蛋白质含量准确度较差，这是由于：(1)对于测定那些与标准蛋白质中酪氨酸和色氨酸含量差异较大的蛋白质，有一定的误差。

故该法适于测定与标准蛋白质氨基酸组成相似的蛋白质。

(2)若样品中含有嘌呤、嘧啶等吸收紫外光的物质，会出现较大干扰。

核酸强烈吸收波长为280nm 的紫外光，它对260nm 紫外光的吸收更强。

但是蛋白质恰恰相反，在280nm 的紫外吸收值大于260nm 的紫外吸收值。

利用这些性质，通过计算可以适当校正核酸对于测定蛋白质含量的干扰作用。

但是，因为不同的蛋白质和核酸的紫外吸收是不同的，虽然经过校正，测定结果还存在着一定的误差。

在测定工作中，可利用在280nm 及260nm 下的吸收差求出蛋白质的浓度。

蛋白质浓度(mg/ml)=1.45A280nm —0.74A260nm ，式中：A280nm 是蛋白质溶液在280nm 下测得的光吸收值；A260nm 是蛋白质溶液在260nm 下测得的光吸收值。

Warburg 和Christian 用结晶的酵母烯醇化酶和纯的酵母核酸作为标准，对有核酸存在时所造成的误差作了评价，并作出了一个校正表(如下)。

紫外吸收法测定蛋白质含量的校正因子F0.6565.500.8461.1160.001.750.6320.6070.5850.5650.5450.5080.4780.4220.3770.3220.2786.006.507.007.508.009.0010.0012.0014.0017.0020.000.8220.8040.7840.7670.7530.7300.7050.6710.6440.6150.5951.0811.0541.0230.9940.9700.9440.8990.8520.8140.7760.7430.6820.250.500.781.001.251.502.002.503.003.504.005.001.631.521.401.361.301.251.161.091.030.9790.9390.874校正因子核酸%A 280nm /A 260nm校正因子核酸%A 280nm /A 260nm注：一般纯蛋白质的A280nm/A260nm 值为约1.8，而纯核酸的A280nm/A260nm 值为约0.5。

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教材1 紫外分光光度法测定蛋白质含量一、实验目的学习紫外分光光度法测定蛋白质含量的原理;掌握紫外分光光度法测定蛋白质含量的实验技术;掌握TU-1901紫外-可见分光光度计的使用方法并了解此仪器的主要构造。

二、实验原理紫外-可见吸收光谱法又称紫外-可见分光光度法, 它是研究分子吸收190nm ～750nm 波长范围内的吸收光谱，是以溶液中物质分子对光的选择性吸收为基础而建立起来的一类分析方法。

紫外-可见吸收光谱的产生是由于分子的外层价电子跃迁的结果，其吸收光谱为分子光谱，是带光谱。

进行定性:利用紫外-可见吸收光谱法进行定性分析一般采用光谱比较法。

即将未知纯化合物的吸收光谱特征，如吸收峰的数目、位置、相对强度以及吸收峰的形状与已知纯化合物的吸收光谱进行比较。

定量分析: 紫外-可见吸收光谱法进行定量分析的依据是朗伯-比尔定律：A=lgI0/I=εbc ，当入射光波长λ及光程b 一定时，在一定浓度范围内，有色物质的吸光度A 与该物质的浓度c 成正比，即物质在一定波长处的吸光度与它的浓度成线形关系。

因此，通过测定溶液对一定波长入射光的吸光度，就可求出溶液中物质浓度和含量。

由于最大吸收波长λmax 处的摩尔吸收系数最大，通常都是测量λmax 的吸光度，以获得最大灵敏度。

光度分析时，分别将空白溶液和待测溶液装入厚度为b 的两个吸收池中，让一束一定波长的平行单色光非别照射空白和待测溶液，以通过空白溶液的透光强度为I 0，通过待测溶液的透光强度为I ，根据上式，由仪器直接给出I 0与I 之比的对数值即吸光度。

紫外-可见分光光度计:紫外-可见吸收光谱法所采用的仪器称为分光光度计，它的主要部件有五个部分组成，即由光源发出的复合光经过单色器分光后即可获得任一所需波长的平行单色光, 该单色光通过样品池静样品溶液吸收后，通过光照到光电管或光电倍增管等检测器上产生光电流，产生的光电流由信号显示器直接读出吸光度A 。

可见光区采用钨灯光源、玻璃吸收池; 紫外光区采用氘灯光源、石英吸收池。

紫外分光光度法测定蛋白质含量实验报告

紫外分光光度法测定蛋白质含量一、实验目的1.学习紫外光度法测定蛋白质含量的原理；2.掌握紫外分光光度法测蛋白质含量的实验技术。

二、实验原理1.测蛋白质含量的方法主要有：①测参数法：折射率、相对密度、紫外吸收等；②基于化学反应:定氮法、双缩脲法、Folin―酚试剂法等。

本实验采用紫外分光光度法。

2.蛋白质中的酪氨酸和色氨酸残基的苯环中含有共轭双键，因此，蛋白质具有吸收紫外光的性质，其最大吸收峰位于280nm附近（不同蛋白质略有不同）。

在最大吸收波长处，吸光度与蛋白质溶液的浓度服从朗伯―比尔定律。

利用紫外吸收法测蛋白质含量的准确度较差，原因有二：①对于测定那些与标准蛋白质中酪氨酸和色氨酸含量差异较大的蛋白质，有一定误差，故该法适于测定与标准蛋白质氨基酸组成相似的蛋白质；②样品中含有的嘌呤、嘧啶等吸收紫外光的物质，会出现较大干扰。

三、仪器与试剂TU―1901紫外可见分光光度计、标准蛋白质溶液3.00mg·mL-1、0.9%NaCl 溶液、试样蛋白质溶液。

10mL比色管、1cm石英比色皿、吸量管。

四、实验步骤1.绘制吸收曲线用吸量管吸取2mL3.00mg·mL-1标准蛋白质溶液于10mL比色管中，用0.9%NaCl溶液稀释至刻度，摇匀。

用1cm石英比色皿，以0.9%NaCl溶液作参比溶液，在190~400nm间每隔5nm测一次吸光度Abs，记录数据并作图。

2.绘制标准曲线用吸量管分别吸取1.0、1.5、2.0、2.5、，用0.9%NaCl溶液稀释至刻度，摇匀。

用1cm石英比色皿，以0.9%NaCl溶液作参比溶液，在波长280nm处分别测其吸光度，记录数据并作图。

3.样品测定取适量浓度试样蛋白质溶液，在波长280nm处测其吸光度，重复三次。

在已经得到标准曲线的情况下，为了使测量结果准确度高，待测溶液的浓度需在标准曲线的线性范围内，所以，先测定试样蛋白质原液的吸光度（1.363），估算浓度为2.0960 mg·mL-1，再将原试液稀释至5倍（即取2mL试液，用0.9%NaCl 溶液稀释至刻度，摇匀），估算浓度为0.4192 mg·mL-1，测吸光度，重复三次五、数据处理与结果分析图1吸收曲线在上图吸收曲线中可以看到有两处吸收峰，且在波长225nm处的吸收峰远大于280nm处，这是由于在波长250nm以下时，溶剂吸收较为严重，干扰较大，所以，蛋白的最大吸收波长应为280nm。

蛋白质类药物含量测定的方法

蛋白质类药物含量测定的方法
蛋白质类药物含量测定有多种方法，以下是其中几种常用的方法：
1. 紫外分光光度法：蛋白质分子中含有酪氨酸和色氨酸，它们在紫外光
280nm处有最大吸收峰。

在一定浓度范围内，蛋白质溶液的吸光度值与其
浓度成正比，可以用于定量测定。

此方法操作简单、快捷，且样品可回收。

然而，此方法不适用于酪氨酸和色氨酸含量差异大的蛋白质，且易受其他在280nm有吸收的物质（如核酸）干扰。

2. Bradford法：该法基于染料与蛋白质结合后改变最大吸收光，从465nm 变为595nm。

蛋白质-染料复合物具有高消光系数，提高了蛋白质测定的灵敏度（最低检出量为1μg）。

染料与蛋白质结合迅速，颜色在1小时内稳定。

一些阳离子、(NH4)2SO4、乙醇等物质不干扰测定，但大量去污剂如TritonX-100、SDS等会严重干扰测定。

3. 双缩脲法：具有两个或两个以上肽键的化合物都有双缩脲反应，蛋白质在碱性溶液中能与Cu2+络合呈紫红色，颜色深浅与蛋白质浓度成正比，故可用比色法进行测定，根据标准曲线进行计算可以确定蛋白质浓度。

除上述方法外，还有酚试剂法、考马斯亮蓝法、免疫分析法等测定蛋白质含量的方法。

在实际操作中，应根据具体药物选择合适的测定方法。

实验3 紫外分光光度法测定蛋白质含量

本法适用于微量蛋白质浓度测定，本法适用于微量蛋白质浓度测定，对盐类混杂的情况比较合适，为简便起见，对混合蛋白质溶液，况比较合适，为简便起见，对混合蛋白质溶液，可用 A280×0.75来表示蛋白质大概浓度来表示蛋白质大概浓度。 A280×0.75来表示蛋白质大概浓度。注意事项】【注意事项】由于各种蛋白质的酪氨酸和苯丙氨酸含量不同，由于各种蛋白质的酪氨酸和苯丙氨酸含量不同，显色深浅随不同蛋白质改变，显色深浅随不同蛋白质改变，因而本法只适用于蛋白质相对浓度的测定，核酸对结果也有影响，质相对浓度的测定，核酸对结果也有影响，尽管进行了公式校正，但是不同样品干扰成分差异较大，了公式校正，但是不同样品干扰成分差异较大，致使 280nm紫外吸收法检测的准确性较差紫外吸收法检测的准确性较差。 280nm紫外吸收法检测的准确性较差。思考题】【思考题】紫外分光光度法测定蛋白质浓度的原理是什么？ 1. 紫外分光光度法测定蛋白质浓度的原理是什么？影响紫外分光光度法测定准确性的因素有那些？ 2. 影响紫外分光光度法测定准确性的因素有那些？
【实验步骤】实验步骤】 1、标准曲线法标准曲线的制作：只试管按表2 加入试剂，（1）标准曲线的制作：取8只试管按表2-5加入试剂，摇选择光程1cm 石英比色皿， 280nm波长测定A280，波长测定A280 匀。选择光程1cm 石英比色皿，在280nm波长测定A280， A280值为纵坐标蛋白质浓度为横坐标，绘制标准曲线。值为纵坐标，以A280值为纵坐标，蛋白质浓度为横坐标，绘制标准曲线。
6 2.5 1.5 0.62 5
7 3.0 定：样品测定：配制待测蛋白质溶液1ml 加入蒸馏水3ml 1ml， 3ml，配制待测蛋白质溶液1ml，加入蒸馏水3ml，摇匀，测定A280，从标准曲线中查出蛋白质浓度。测定A280，从标准曲线中查出蛋白质浓度。 A280 2. 直接测定法在紫外分光光度计上，在紫外分光光度计上，将待测蛋白质溶液加入比色皿，以生理盐水为对照，测定280nm 280nm和比色皿，以生理盐水为对照，测定280nm和260nm 波长吸光度。按一下公式计算蛋白质浓度：波长吸光度。按一下公式计算蛋白质浓度：蛋白质浓度（mg/mL）=1.45A280蛋白质浓度（mg/mL）=1.45A280-0.74A260 (C为蛋白质浓度，mg/ml,A280和A260分别为 (C为蛋白质浓度，mg/ml,A280和A260分别为为蛋白质浓度蛋白质溶液在280nm 260nm处测得的吸光度值 280nm和处测得的吸光度值) 蛋白质溶液在280nm和260nm处测得的吸光度值)。

紫外分光光度法测定蛋白质含量

紫外分光光度法测定蛋白质含量实验目的1、学习紫外光度法测定蛋白质含量的原理。

2、掌握紫外分光光度法测定蛋白质含量的实验技术。

实验原理本实验采用紫外分光光度法测定蛋白质含量。

蛋白质中酪氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键，因此蛋白质具有吸收紫外光的性质，其最大吸收峰位于280nm 附近（不同蛋白质的吸收波长略有差别）。

在最大吸收波长处，吸光度与蛋白质溶液浓度的关系服从朗伯—比尔定律。

利用紫外吸收法测定蛋白质含量准确度较差，其主要原因有两个：其一，测定的蛋白质与标准蛋白质中色氨酸、酪氨酸的含量不同，会造成一定的误差，故该法适用于测定与标准蛋白质氨基酸组成相近的蛋白质；其二，若样品中含有嘌呤、嘧啶（核酸）等吸收紫外光的物质，会产生较大的干扰。

核酸强烈吸收波长为280nm的紫外光，对260nm 波长的紫外光吸收更强，其与蛋白质不同，蛋白质在280nm处的吸收大于260nm 的吸收，故可利用这一性质，通过计算适当校正核酸对于测定蛋白质含量的干扰作用。

由于不同的蛋白质与核酸的紫外吸收不同，故测定的结果还是会产生一定的误差。

在测定工作中，可利用在280nm及260nm下的吸收差求出蛋白质的浓度。

蛋白质浓度（mg·mL-1）=1.45A280—0.74A260其中A280、A260分别为蛋白质溶液在280nm与260nm 处测得的吸光度值。

Warburg 和 Chirstian 用结晶的酵母烯醇化酶和纯的酵母核酸作为标准，对于有核算存在时所造成误差做出了评价，并作出校正表。

A280与A260的比值为校正因子F，可从校正表中查出，同时可查出该样品溶液中混杂核酸的百分含量，将F值代入，再由经验公式直接计算该溶液的蛋白质浓度。

蛋白质浓度（mg·mL-1）=F * 1/d * A280* D其中d为石英比色池的厚度；D为溶液的稀释倍数。

紫外吸收法在蛋白质含量为20~100μg·mL-1范围内服从比尔定律，氯化钠、硫酸铵以及0.1mol·L-1磷酸、硼酸和Tris 等缓冲溶液都无显著干扰，但是，0.1mol·L-1乙酸、琥珀酸、邻苯二甲酸以及巴比妥等缓冲溶液在215nm 下的吸收较大不能应用，必须降至0.005mol·L-1才无显著影响。

紫外分光光度法测蛋白质的含量

紫外分光光度法测蛋白质的含量一、实验目的1、学习紫外分光光度法测定蛋白质含量的原理。

2、掌握紫外分光光度法测定蛋白质含量的实验技术。

3、掌握TU-1901紫外-可见分光光度计的使用方法并了解此仪器的主要构造。

二、实验原理本实验采用紫外分光光度法测定蛋白质含量。

在最大吸收波长处，吸光度与蛋白质溶液的浓度的关系服从朗伯-比耳定律。

该测定方法简单、灵敏、快速，不消耗样品，低浓度的盐类不干扰测定。

1.紫外-可见分光光度法，是以溶液中物质的分子或离子对紫外和可见光谱区辐射能的选择性吸收为基础而建立起来的一类分析方法。

紫外光：10-400 nm可见光：400-780 nm特点：带光谱、分子光谱应用：定性分析-最大吸收波长；定量分析-朗伯-比尔定律（标准曲线法和标准加入法）a.定性分析原理：吸收曲线：吸收峰的数目、位置、相对强度以及吸收峰的形状.b.定量分析原理：根据朗伯－比耳定律：A=εbc，当入射光波长λ及光程b一定时，在一定浓度范围内，有色物质的吸光度A与该物质的浓度c成正比。

定量分析常用的方法是标准曲线法即只要绘出以吸光度A为纵坐标，浓度c为横坐标的标准曲线，测出试液的吸光度，就可以由标准曲线查得对应的浓度值，即未知样的含量。

c.仪器组成部件:各种类型的紫外-可见分光光度计，如下图所示，从总体上来说是由五个部分组成，即光源、单色器、吸收池、检测器和信号显示记录装置。

2.本实验采用紫外分光光度法测定蛋白质含量的实验原理：（1）蛋白质中酪氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键，所以蛋白质溶液在275--280nm具有一个吸收紫外吸收高峰。

在一定浓度范围内，蛋白质溶液在最大吸收波长处的吸光度与其浓度成正比，服从朗伯-比耳定律，因此可作定量分析。

该法测定蛋白质的浓度范围为0.1—1.0mg/mL。

生物化学实验2.紫外法测定血清蛋白质含量

蛋白质浓度(mg/mL) =（1.45×A280 – 0.74×A260）×500 =（1.55×A280 – 0.76×A260）×500
三、试剂和仪器
(一）试剂 1、0.9%Nacl溶液 2、小牛血清
(二）仪器
754型紫外分光光度计、刻度吸量管、微量移
液器
四、实验步骤
1、稀释血清
准确吸取0.1mL血清，置于50mL容量瓶中，用0.9%Nacl溶液稀释至标准刻度（即500倍）。
利用吸光度值计算出蛋白质浓度。
蛋白质浓度(mg/mL) =（1.45×A280 – 0.74×A260）×500 =（1.55×A280 – 0.76×A260）×500
2、测定吸光度
检查→开机→预热（30min）→ 设置波长→放入比色皿
→校正仪器（开门调0关门调100）→测定→收整
在紫外分光光度计上，将稀释的血清置于比色皿中，以0.9%Nacl溶液作为空白对照，分别在260nm和280nm波长下，读取 A280和A260，带入公式计算蛋白质浓度。
五、结果与分析
紫外分光光度法测定蛋白质含量
研究对象
血清总蛋白 •正常值：60～80g/L •血浆总蛋白上升
常见于脱水导致的血浆浓缩，例如急性失水、休克、肾上腺皮质功能不全等 •血浆总蛋白下降血浆水分增加，如水钠潴留长期消耗性疾病，如肺结核、肿瘤等肝功能损伤、肾功能损伤等
一、实验目的
1、掌握紫外分光光度法测定血光度计的使用方法。
二、实验原理
含有共轭双键的色氨酸、酪氨酸对紫外光有较强的光吸收。其吸收峰在 280nm 左右，以色氨酸吸收最强。
大多数蛋白质含有这两种氨基酸残基，且含量比较接近，因此可利用此性质采用紫外分光光度法测定蛋白质的含量。

国标紫外分光光度法测定蛋白质含量

国标紫外分光光度法测定蛋白质含量蛋白质是构成生物体内各种细胞、器官和组织的主要物质之一，其含量的测定对于科学研究和工业生产具有重要意义。

目前国际上常用的测定蛋白质含量的方法有比色法、低力荧光素法和生物素-四硫化物法等，而国家标准推荐使用紫外分光光度法测定蛋白质含量，因其准确性和可靠性较高，具有广泛适用性。

一、实验原理国标紫外分光光度法利用蛋白质分子内含有色氨酸（W）、酪氨酸（T）和苯丙氨酸（F）等氨基酸团的紫外吸收特性，即在近220nm处有吸收峰。

通过分析样品在220nm处的吸光度值，就可以计算出其蛋白质含量。

二、实验步骤1. 样品的制备将所需测定的物质按照预定比例溶解在适量的缓冲溶液中，混合均匀，离心沉淀物质后，称取上清液并记录其质量，得到样品洗脱液。

2. 样品的测定(1)制备含有对照蛋白质的样品洗脱液。

将已知浓度的蛋白质按需求浓度稀释后，制成一系列的对照样品，称取适量的对照样品，经过与样品液的处理过程相同的操作后，得到对照样品洗脱液。

(2)利用紫外分光光度计测量样品洗脱液和对照样品洗脱液在220nm处的吸光度，记录数据。

(3)计算样品洗脱液中蛋白质的含量。

根据统计学方法，将同一浓度蛋白质的对照样品的吸光度取平均值，并绘制标准曲线。

根据样品洗脱液的吸光度值和标准曲线，计算出样品中蛋白质的含量。

三、实验注意事项1. 操作时需严格按照实验指导书的规定操作。

2. 紫外分光光度计在对样品洗脱液进行吸光度测定时，应使用二元芳香胺半波长试管作为样品池。

3. 为防止各种最终洗涤液误差的影响，应利用含有NaHCO3 or Na2CO3的去离子水作为纯化洗涤液。

四、实验结果的分析利用国标紫外分光光度法测定出的蛋白质含量，可点评该样品是否符合质量要求。

若蛋白质含量低于标准要求，则说明样品质量不好，需再次提取纯化；若蛋白质含量超过标准，则说明提取效率较好，但仍需注意实验中的误差，以获得更加准确的结果。

总之，国标紫外分光光度法测定蛋白质含量是一种可靠、简便、经济的方法，可广泛应用于生物科学、医药研究、食品工业等领域，对于推动相关研究和产业发展起到了积极的促进作用。

紫外分光光度计——蛋白质含量测定

紫外分光光度计——蛋白质含量测定紫外可见分光光度法是在190～760nm波长范围内测定物质的吸光度，用于鉴别、杂质检查和定量测定的方法。

当光穿过被测物质溶液时，物质对光的吸收程度随光的波长不同而变化。

因此，通过测定物质在不同波长处的吸光度，并绘制其吸光度与波长的关系图即得被测物质的吸收光谱。

从吸收光谱中，可以确定最大吸收波长λmax和最小吸收波长λmin。

物质的吸收光谱具有与其结构相关的特征性。

因此，可以通过特定波长范围内样品的光谱与对照光谱或对照品光谱的比较，或通过确定最大吸收波长，或通过测量两个特定波长处的吸收比值而鉴别物质。

用于定量时，在最大吸收波长处测量一定浓度样品溶液的吸光度，并与一定浓度的对照溶液的吸光度进行比较或采用吸收系数法求算出样品溶液的浓度。

紫外分光光度法测量光谱法（spectrometry）是基于物质与电磁辐射作用时，测量由物质内部发生量子化的能级之间的跃迁而产生的发射、吸收或散射辐射的波长和强度进行分析的方法。

光谱法可分为发射光谱法、吸收光谱法、散射光谱法；或分为原子光谱法和分子光谱法；或分为能级谱，电子、振动、转动光谱，电子自旋及核自旋谱等。

分光光度法是光谱法的重要组成部分，是通过测定被测物质在特定波长处或一定波长范围内的吸光度或发光强度，对该物质进行定性和定量分析的方法。

常用的技术包括紫外-可见分光光度法、红外分光光度法、荧光分光光度法和原子吸收分光光度法等。

物质对光的选择性吸收波长，以及相应的吸收系数是该物质的物理常数。

在一定条件下，物质的吸收系数是恒定的，且与入射光的强度、吸收池厚度及样品浓度无关。

当已知某纯物质在一定条件下的吸收系数后，可用同样条件将该供试品配成溶液，测定其吸光度，即可由上式计算出供试品中该物质的含量。

在可见光区，除某些物质对光有吸收外，很多物质本身并没有吸收，但可在一定条件下加入显色试剂或经过处理使其显色后再测定，故又称之为比色分析。

蛋白质与生命的起源、存在和进化都密切相关,蛋白质测定涉及到生产和利研的众多领域。

常用紫外分光光度法测定蛋白质含量

6种方法测定蛋白质含量一、微量凯氏（kjeldahl）定氮法样品与浓硫酸共热。

含氮有机物即分解产生氨（消化），氨又与硫酸作用，变成硫酸氨。

经强碱碱化使之分解放出氨，借蒸汽将氨蒸至酸液中，根据此酸液被中和的程度可计算得样品之氮含量。

为了加速消化，可以加入cuso4作催化剂，k2so4以提高溶液的沸点。

收集氨可用硼酸溶液，滴定则用强酸。

实验和计算方法这里从略。

计算所得结果为样品总氮量，如欲求得样品中蛋白含量，应将总氮量减去非蛋白氮即得。

如欲进一步求得样品中蛋白质的含量，即用样品中蛋白氮乘以6．25即得。

二、双缩脲法（biuret法）（一）实验原理双缩脲（nh3conhconh3）是两个分子脲经180℃左右加热，放出一个分子氨后得到的产物。

在强碱性溶液中，双缩脲与cuso4形成紫色络合物，称为双缩脲反应。

凡具有两个酰胺基或两个直接连接的肽键，或能过一个中间碳原子相连的肽键，这类化合物都有双缩脲反应。

紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关，故可用来测定蛋白质含量。

测定范围为1-10mg蛋白质。

干扰这一测定的物质主要有：硫酸铵、tris缓冲液和某些氨基酸等。

此法的优点是较快速，不同的蛋白质产生颜色的深浅相近，以及干扰物质少。

主要的缺点是灵敏度差。

因此双缩脲法常用于需要快速，但并不需要十分精确的蛋白质测定。

（二）试剂与器材1. 试剂：（1）标准蛋白质溶液：用标准的结晶牛血清清蛋白（bsa）或标准酪蛋白，配制成10mg/ml的标准蛋白溶液，可用bsa浓度1mg/ml的a280为来校正其纯度。

紫外分光光度法测蛋白质含量UV-4802

紫外分光光度法测定蛋白质含量1、学习紫外分光光度法测定蛋白质含量的原理；2、掌握紫外分光光度法测定蛋白质含量的实验技术；3、掌握UV-4802紫外-可见分光光度计的使用方法并了解此仪器的主要构造。

二、实验原理：紫外-可见吸收光谱法又称紫外-可见分光光度法，是以溶液中物质的分子或离子对紫外和可见光谱区辐射能的选择性吸收为基础而建立起来的一类分析方法。

紫外光波长在10-400nm之间，可见光波长在400-780nm之间，可被人们的眼睛所感觉。

紫外-可见吸收光谱的特点：带光谱、分子光谱。

紫外分光光度法根据最大吸收波长可做定性分析；根据朗伯-比尔定律（标准曲线法和标准加入法）可做定量分析。

a.定性分析原理：根据吸收曲线可以判断吸收峰的数目、位置、相对强度以及吸收峰的形状。

b.定量分析原理：根据朗伯－比耳定律：A=εbc，当入射光波长λ及光程b一定时，在一定浓度范围内，有色物质的吸光度A与该物质的浓度c成正比。

（5）仪器组成部件:各种类型的紫外-可见分光光度计，从总体上来说是由五个部分组成，即光源、单色器、吸收池、检测器和信号显示记录装置。

2. 本实验采用紫外分光光度法测定蛋白质含量。

（1）蛋白质中酪氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键，所以蛋白质溶液在275--280nm具有一个吸收紫外吸收高峰。

在一定浓度范围内，蛋白质溶液在最大吸收波长处的吸光度与其浓度成正比，服从朗伯-比耳定律，因此可作定量分析。

该法测定蛋白质的浓度范围为0.1—1.0mg/mL。

（2）由于不同蛋白质中酪氨酸和色氨酸的含量不同，所处的微环境也不同，所以不同蛋白质溶液在280nm的光吸收职也不同。

据初步统计，浓度为1.0 mg/mL的1800种蛋白质及蛋白质亚基在280nm的吸光度在0.3—3.0之间，平均值为1.25+/-0.51。

蛋白质浓度测定方法紫外分光光度法

蛋白质浓度测定方法紫外分光光度法紫外光谱吸收法测定蛋白质含量是讲蛋白质溶液直接在紫外分光光度计中测定的方法，不需要任何试剂，操作简单且易回收。

蛋白质溶液在280nm附近有强烈的吸收，这是由于蛋白质中酪氨酸、色氨酸残基而引起的，所以光密度受这两种氨基酸含量的支配。

另外核蛋白或提取过程中杂有的核酸对测定结果引起极大误差，其最大吸收在260nm。

所以同时测定280及260nm两种波长的吸光度，通过计算可得较为正确的蛋白质含量。

蛋白质测定常用的几种方法

I. 紫外分光光度法测定蛋白质的含量一、实验目的掌握紫外分光光度法测定蛋白质的含量的方法。

二、实验原理蛋白质分子中存在含有共轭双键的酪氨酸和色氨酸，使蛋白质对280nm的光波具有最大吸收值，在一定的范围内，蛋白质溶液的吸光值与其浓度成正比，可作定量测定。

该法操作简单、快捷，并且测定的样品可以回收，低浓度盐类不干扰测定，故在蛋白质和酶的生化制备中广泛被采用。

但此方法存在以下缺点：1．当待测的蛋白质中酪氨酸和色氨酸残基含量差别较大是会产生一定的误差，故该法适用于测定与标准蛋白质氨基酸组成相似的样品。

2．若样品中含有其他在280nm吸收的物质如核酸等化合物，就会出现较大的干扰。

但核酸的吸收高峰在260nm，因此分别测定280nm和260nm两处的光吸收值，通过计算可以适当的消除核酸对于测定蛋白质浓度的干扰作用。

但因为不同的蛋白质和核酸的紫外吸收是不同的，虽经校正，测定结果还存在着一定的误差。

三、实验器材1．紫外分光光度计2．移液管3．试管及试管架4．石英比色皿四、材料与试剂1．标准蛋白质溶液：准确称取经凯氏定氮校正的牛血清清蛋白，配制成浓度为1mg/mL的溶液。

2．待测蛋白溶液：酪蛋白稀释溶液，使其浓度在标准曲线范围内。

五、操作方法1．标准曲线的制作按表1加入试剂。

表1 标准曲线的制作度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制出血清蛋白的标准曲线。

2．未知样品的测定取待测蛋白质溶液1mL，加入3mL蒸馏水，在280nm下测定其吸光度值。

并从标准曲线上查出待测蛋白质的浓度。

II. Bradford法测定蛋白质的含量一、实验目的学习考马斯亮蓝G-250染色法测定蛋白质的原理和方法。

二、实验原理1976年Bradford建立了用考马斯亮蓝G-250与蛋白质结合的原理，迅速而准确的定量蛋白质的方法。

染料与蛋白质结合后引起染料最大吸收光的改变，从465nm变为595nm。

蛋白质-染料复合物具有高的消光系数，因此大大提高了蛋白质测定的灵敏度（最低检出量为1μg）。