染色技术

非切片法
三、染色结果的观察方法
（一）普通光学显微镜技术 （二）荧光显微镜技术 （三）电子显微镜技术
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第二节
细胞普通染色
一、染料与染色 二、临床常用的染色方法
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一、染料与染色
（一）染料的性质 （二）分类 （三）染色原理 （四）染色方法
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紫外光激发荧光物质放射荧光示意图
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荧光染料

分类：呫吨、吖啶、喹啉、聚甲炔和噻唑五类。 常用：
异硫氰酸荧光素（FITC） 吖啶橙（AO） 罗丹明 四甲基罗丹明（RB200） 伊红 碘化丙啶（PI） DAPI （4，6-联脒-2-苯基吲哚） PerCP（多甲藻黄素叶绿素）
【processes】 见书
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二、生物玻片标本制作的方法
（一）固定和固定液 （二）制片方法
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（一）固定和固定液
【definition】
指获取材料以后，立即采取一种方法，将组织 细胞尽可能保持原有的形态结构，且有利于保存 和适于制片的操作。

指经化学处理使组织或细胞的某一组分起化学变
化，产生特殊的染色反应，并通过显微镜来鉴定
组织或细胞中含有物的性质和位置的一类方法。

可特异性地显示细胞内的细胞器和化学成分，如
无机物、蛋白质、糖类、脂类、核酸、酶等。
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一、基于光学显微镜的普通细胞化学染色
【Principle】 让细胞内的成分与染色剂经过化学作用形 成有色的反应产物，通过光学显微镜观察颜 色部位及深浅来确定该成分在细胞中的分布 及含量。
染色技术
实验诊断教研室 施琼
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内 容
一、染色的前期工作
二、细胞普通染色 三、细胞化学染色
四、免疫细胞化学染色
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第一节
一、一般准备
染色的前期工作
二、生物玻片标本制作的方法 三、染色结果的观察方法
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苏丹黑B法
苏丹黑为偶氮染料， 具有脂溶性，可溶于 无水酒精，但不溶于 水（常用70%酒精饱和 液）。当组织切片入 染液时，苏丹黑B便离 开染液而溶于组织内 的脂质（如脂滴中） 使组织内脂类着色。
脂类的苏丹黑B（SB）染色
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应产物，从而在电子显微镜下直接观察此产物。
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【显色方法】
1. 2. 3. 4. 铅沉淀法 3,3’－二氨基联苯胺（DAB）显色法 硝基蓝四唑盐（NBT）显色法 铁氰酸盐－铜（亚铁氰化铜）沉淀法
【Processes】
生物体取材→固定→组织洗涤→切组织片→ 置换缓冲液或预孵育→孵育反应→洗涤组织块 →后固定→脱水→渗透→包埋→超薄切片→染 色→电镜观察
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四、活体染色与离体活体染色
活体染色：指对生活有机体的细胞能着色而又无 毒害的一种染色方法。常用注射、吸收或咽下等 方式进入生活有机体内进行染色。如：英国的银 脸人。
离体活体染色：指对离体的或刚杀死的生物体内 的活细胞，置于适当的培养液中，使之保持生活 状态，再进行染色的一种方法。 常用的活体染料有中性红、台盼蓝、詹纳斯绿等
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利用人工合成的酚 类化合物作为酶底 物，酶反应产物α －萘酚与重氮盐结 合发生偶氮偶联反 应，生成不溶性偶 氮色素
非特异性酯酶的偶氮偶联法染色
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高碘酸为强氧化 剂，它可以氧化 多糖分子内1， 2—乙二醇（顺 式和反式）而产 生醛基，此醛基 再与Schiff试剂 结合即产生红紫 色。 糖原的PAS染色
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过氧化物酶分解 H202，产生新生态 氧，后者再将无 色的联苯胺或DAB 氧化成联苯胺蓝， 进而环化变成棕 褐色沉淀
过氧化物酶的DAB法染色
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二、基于荧光显微镜的荧光标记细胞 化学染色
【Principle】
用荧光染料对细胞内的化学成分及细胞结构染 色，通过荧光显微镜观察，对亚细胞组分进行定 位的最常用的方法之一，具有高灵敏度、高特异 性等优点。 能够产生荧光并能作为染料的化合物称为荧光 染料（荧光素、荧光色素）。

根据染色剂的化学性质：碱性，酸性，中
性染色剂（复合染色剂）
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（三）染色原理
物理作用：溶解、吸附、沉淀
化学作用 目前认为组织细胞的染色是物理的与化学
的综合作用的结果
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（四）染色方法

累进染色法 退回染色法
（2）用毛细吸管吸少许混合液置细胞计数板，显微镜 下计数，观察。
【Results】
凡折光性强而不着色者为活细胞，染上蓝色者为死 细胞。
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五、各种细胞化学成分的染色方法
（一）铁的染色亚铁氰化钾法
（二）糖原的染色高碘酸－席夫反应（PAS）法
（三）脂类的染色苏丹黑B（SB）染色法 （四）核酸（DNA与RNA）的染色吖啶橙荧光染色法
（hematoxylin-eosin，HE）

适用材料 人与动物组织的切片

染色程序
固定→苏木精染细胞核→酸
酒精分化→“蓝化”→伊红染细胞质→梯 度乙醇溶液脱水→透明 →封固
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染色结果
细胞核呈蓝紫色或深蓝色，细胞质呈淡红色。
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简单固定液
混合固定液
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常用简单固定液的性质
名称 乙醇 福尔马林 醋酸 性质 还原剂 强还原剂 酸类 干燥时，易爆炸， 剧毒 还原剂 氧化剂 强氧化剂 剧毒 强氧化剂
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苦味酸
丙酮 铬酸 重铬酸钾 氯化汞 锇酸
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常用于细胞学的混合固定液
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台盼蓝拒染法
【Principle】 死亡细胞的细胞膜受损，台盼蓝能够进 入细胞内使死亡细胞呈兰色，而活细胞由 于胞膜完整，染液不能进入胞内，故细胞 不着色。
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【Processes】
（1）每ml细胞悬液加入10ul0.4％台盼蓝染液，混匀；
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一、一般准备
制片、染色所需的主要设备
载玻片和盖玻片的清洗 常用玻璃器皿的清洗 载玻片的前处理方法
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（一）制片、染色所需的主要设备
1. 2. 3. 4. 5. 6. 显微镜 组织切片制备工具 细胞离心涂片器 染色工具 载玻片和盖玻片 其他常用的仪器和用具

适用材料 血液、骨髓涂片；体外培养细
胞悬液涂片

染色程序
特点 对胞质染色好，胞核较差
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染色结果
细胞核呈蓝紫色或深蓝色，细胞质呈淡 红色，（与HE染色相似 ）
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（四）瑞氏(Wright's)- 姬姆萨 （Giemsa's）混合染色法
1）酒精－醋酸混合液 2）苦味酸－甲醛－醋酸混合液
3）升汞混合液
4）重铬酸钾混合液
5）10％中性甲醛液
6）10％中性缓冲甲醛液
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（二）制片方法
切片法
徒手切片法 石蜡切片法 火棉胶切片法 冰冻切片法 整体封藏法 涂片法 压片法 伸展（平铺）法 甩片法
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（五）DNA的染色富尔根（Feulgen）染色法
（六）过氧化物酶（POX）的染色DAB显色法
（七）碱性磷酸酶（ALP）的染色偶氮偶联法
（八）酸性磷酸酶（ACP）的染色铅沉淀法 （九）非特异性酯酶（NSE）的染色偶氮偶联法 （十）细胞色素氧化酶的染色 Nadi反应 laboratory diagnosis
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第三节

细胞化学染色
普通细胞化学染色 荧光标记细胞化学染色 超微结构酶细胞化学染色 活体染色与离体活体染色 各种细胞化学成分的染色方法



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细胞化学或组织化学染色
（cytochemical or histochemical staining）

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二、临床常用的染色方法
苏木精–伊红（HE）染色法 瑞氏（Wright’s）染色法 姬姆萨（Giemsa）染色法 瑞氏(Wright's)-
姬姆萨（Giemsa's）
混合染色法
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（一）苏木精–伊红染色法
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（二）载玻片和盖玻片的清洗
新载玻片和盖玻片的清洗常用的方法主 要有以下两种： （1）95％酒精浸泡清洗
（2）清洁液浸泡清洗
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（三）载玻片的前处理方法
【objective】 将细胞牢固贴附于载玻片上，在染色过程 中不从载玻片脱落 【methods】 常用多聚赖氨酸涂布法 多聚L－赖氨酸
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【Methods】
1.金属沉淀法：铁染色
2.偶氮偶联法：磷酸酶、酯酶
3.Schiff反应 ：糖原
4.联苯胺反应：过氧化物酶
5. “Nadi”反应：细胞色素氧化酶
6.脂溶染色法：脂质
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磷酸酶分解 磷酸酯底物 后，反应产 物与金属离 子（Co2+、 Pb2+等）结 合，最终生 成有色沉淀 酸性磷酸酶的铅沉淀法染色
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（一）染料的性质
基本条件
①要具有颜色(发色团)
②和被染物之间具有亲和力(助色团)
大多数合成染料都是分子结构上具有发 色团和助色团的芳香族有机化合物
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（二）分类

根据来源： 天然染料，人工染料 根据用途：细胞核染色剂，细胞质染色剂， 脂质染色剂

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胞核黄-黄绿色荧 光(DNA)，胞浆桔 红色荧光（RNA）
核酸的吖啶橙荧光染色
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【Usage】

应用于人与动物组织的切片，血液、骨髓涂片，
体外培养细胞的悬液涂片以及活体细胞等。

采用不同的荧光染料可以分别对细胞质膜、细胞
【objectives】
1、防止组织自溶和腐败 2、沉淀、保存细胞的各种组成成分 3、细胞中不同成分有不同的折光率，便于观察 4、有的固定剂有助染作用 5、使组织变硬，易于操作
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【methods】
物理方法：干燥、高热和低温骤冷 化学方法：固定液
【固定液的种类】
骨架、细胞核、线粒体、高尔基体、溶酶体、受
体、胞饮泡和胞质等细胞组分进行标记，从而达
到定位检测的目的。
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三、基于电子显微镜的超微结构酶细 胞化学染色
【Principle】
有机体细胞中酶的定位必须要在最适条件下，在
含有酶的底物和捕捉剂（即辅基，通常是重金属
如铅、钡、铜等）的孵育液中进行一定时间的孵 育，孵育过程中不同性质的酶发生不同性质的化 学反应，通过酶反应在酶的活性部位上形成一种 电子密度很高的、不易除去的、不溶性的最终反
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化学成分
常用方法
呈色
观察方法
常用固定液
铁பைடு நூலகம்
糖原 脂类 核酸
亚铁氰化钾法（普鲁士蓝反 应）
高碘酸－无色品红法（PAS反 应） 苏丹黑B（SB）染色法 吖啶橙荧光染色法 甲基绿派洛宁染色法
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（二）瑞氏（Wright's）染色法

适用材料 血液、骨髓涂片，体外培养细
胞悬液涂片

染色程序

特点 对胞核染色好，胞质较差
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染色结果
细胞核呈蓝紫色或深蓝色，细胞质呈淡红色
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（三）姬姆萨（Giemsa）染色法