酶工程实验大纲
酶工程教学大纲
【单元目标】
总学时数： 30
酶工程( enzyme engneering)是生物技术专业的主干必修课，是酶 学、微生物学的基本原理与化学工程有机结合而产生的一门新的科学技术， 在生物技术人材培养中处于至关重要的地位。它涉及细胞工程、基因工程、 发酵工程、生物分离工程和化学工程等诸多学科，主要内容包括酶的发酵生 产、酶的分离纯化、酶和细胞固定化以及酶的份子工程。学生通过酶工程的 学习，能够掌握酶的生产与分离纯化的基本理论、基本技术以及自然酶、化 学修饰酶、固定化酶的研究和应用，了解酶在各行各业中的最新发展及研究 趋势。
学生通过酶工程的学习，应熟悉从应用目的出发研究酶，在一定生物反 应装置中利用酶的催化性质的研究路线，掌握酶的生产与应用的基本理论、 基本技术、 酶的分 离纯化、 固定化酶以及酶的化学修饰的研究和应用， 进一 步了解酶在各行各业中实际应用的最新发展和发展趋势，在以后的毕业环节 和工作中能够自觉地应用这些技 术方法来指导自己的工作。
本课程理论课 30 学时，于本科三年级第二学期开设。
讲授方式：
1．讲授
2．利用 CAI 课件
1．了解酶工程的研究意义；
2．掌握酶工程的概念及研究内容。
【授课内容】
一．酶与酶工程发展简史
(一)酶学研究简史
(二)酶工程研究简史
二. 酶工程简介
1.酶工程
2.组成
3.分类
【单元目标】
1.掌握酶生物合成的调节类型及调节机制
2.了解产酶微生物的分离和选育方法
3.了解动植物细胞与微生物细胞发酵产酶的异同【授课内容】
一、酶的生物合成
(一) RNA 的生物合成--转录(transcription)
酶工程教学大纲
标题：酶工程教学大纲
引言：
酶工程是将酶的特性与工程原理相结合，应用于生物技术和工业生产中的一门学科。它涉及酶的分离纯化、活性检测、酶动力学研究和酶反应工程等内容。鉴于酶工程在现代生物技术和工业领域的广泛应用，培养具备相关专业知识和技能的人才显得尤为重要。
一、课程目的
本课程旨在使学生了解酶的基本原理、方法和应用，培养其掌握酶的分离纯化、活性检测和酶反应工程的能力，并能将其应用于生物技术和工业生产中。
二、教学内容
1. 酶的基本原理
- 酶的定义与分类
- 酶的结构与功能
- 酶的催化机理
2. 酶的分离纯化
- 细胞破碎与酶的释放
- 酶的分离与纯化方法
- 酶的纯化评价指标
3. 酶的活性检测方法
- 酶活性的测定原理
- 酶活性检测的常用方法
- 酶抑制剂的筛选与应用
4. 酶动力学研究
- Michaelis-Menten方程与酶动力学参数- 受抑制和受激动的酶反应
- 酶动力学实验与数据处理
5. 酶反应工程
- 酶反应的工程原理
- 酶反应的优化方法
- 酶反应的规模化与工业应用
三、教学方法
本课程将采用多种教学方法相结合，包括理论讲解、案例分析、实验操作、小组讨论等。理论讲解部分将通过授课和教材阅读进行，案例分析和小组讨论将有助于学生理解酶工程在实际应用中的问题
和解决方法。实验操作将培养学生的实践能力和团队合作精神。
四、教学评估
教学评估将以平时作业、实验报告、期中考试和期末考试等方
式进行。平时作业和实验报告将考察学生对课堂理论的掌握程度以
及实际操作能力，期中考试和期末考试将全面评估学生对课程内容
的理解与掌握。
五、教材参考
酶工程实验 讲义
实验二大肠杆菌菌体总蛋白的超声破碎抽提与蛋白质的凝胶
过滤纯化
[实验原理]
利用溶菌酶、反复冻融或超声波破碎的方法将培养的细菌的细胞壁破碎后，可使那些可溶性的蛋白释放出来，再利用硫酸铵沉淀、蛋白质层析技术和制备电泳等方法能够将蛋白分离纯化出来，供进一步的研究使用。超声破碎时要产生大量的热，会引起蛋白的变性。为了避免产生高温，超声时一般使用间隔的脉冲处理，而且应在冰浴中进行。
凝胶是一种多孔性的不带表面电荷的物质，当带有多种成分的样品溶液在凝胶内运动时，由于它们的分子量不同而表现出速度的快慢，在缓冲液洗脱时，分子量大的物质不能进入凝胶孔内，而在凝胶间几乎是垂直的向下运动，而分子量小的物质则进入凝胶孔内进行“绕道”运行，这样就可以按分子量的大小，先后流出凝胶柱，达到分离的目的
[仪器、试剂和材料]
1、大肠杆菌
2、细菌蛋白抽提液（100mmol/L NaCl，10mmol/L EDTA，pH 8.0)
3、恒温摇床
4、小型高速离心机
5、超声波组织细胞破碎仪
6、玻璃试管，三角瓶
7、1.5mL 和5mL 塑料离心管
8、“枪”，枪头
[实验操作]
1、大肠杆菌的培养：
从过夜培养的大肠杆菌LB琼脂平板上挑取2-3个菌落，接种5mL LB的玻璃试管中，放恒温摇床中，37℃培养过夜。
2、超声破碎抽提：
将培养的大肠杆菌培养物转移到数只5mL离心管中，8000转/分离心5分钟，倾去上清液后，在沉淀上面再加培养物，继续离心，将所有的培养物都收集在一起。每管中加入1.5mL的细菌蛋白抽提液（100mmol/L NaCl，10mmol/L EDTA，pH 8.0），用枪吹打，使沉淀悬浮。将离心管放在小试管架上，将超声波破碎仪的金属头插到离心管中，调整好试管的位置后关上超声破碎仪的门，打开仪器的电源，对每只离心管中的菌体进行超声破碎。条件：功率80瓦，工作2秒，间隔2秒，每一次处理5个循环。
酶工程实验doc
酶工程实验指导
实验一从植物材料中提取制备过氧化物酶
一．实验目的
学习从植物材料中制备过氧化物酶的方法，了解纯化酶的一些基本步骤。比较不同植物材料过氧化物酶的含量与活性，掌握酶纯化的相关计算方法。
二．实验原理
过氧化物酶（EC 1. 11. 1. 7）是一类以铁卟啉为辅基的氧化酶，在细胞代谢的氧化还原过程中起重要作用，在工业上也广泛被应用。过氧化物酶可溶于水，溶解度约为5%（W/V），溶液呈棕红色，透明。此酶可溶于0.58饱和度以下的硫酸铵溶液，而在0.62饱和度以上则不溶。该酶能催化愈创木酚反应产生有色物质：
以此可进行酶活性的测定。
许多植物如辣根、柑桔叶子、白萝卜等含有较多的过氧化物酶，在这些植物材料的溶出物中，加入不同浓度的硫酸铵进行分段盐析，对过氧化物酶进行粗提，然后用有机溶剂沉淀、结晶等方法可对该酶进行纯化，得出较纯的制品。
三．主要仪器与试剂
仪器：组织捣碎机，冰箱，真空冷冻干燥机，离心机，紫外-可见分光光度计等。
试剂：愈创木酚，丙酮，过氧化氢，硫酸铵等。
四．实验步骤
（尽量在冰浴中进行）鲜植物样品约70克，剪碎或捣烂，加少许水研磨成浆（可用捣碎机），转移到500ml的烧杯中，加水至约200ml，于冰箱中浸提约2小时（中间多次搅动）。多层纱布挤压过滤后离心（4000rpm），10ml上清液用来测酶活力，其余上清液按226克/升加硫酸铵盐析，冰箱中静置1小时以上，离心(4000rpm)去沉淀。上清液再按258克/升加硫酸铵盐析，冰箱中静置4小时以上。离心收集沉淀，用水溶解至约10ml，用水透析去盐，离心去沉淀，取部分酶液稀释后测酶活。其余酶液用作精制样品。
酶工程实验报告册
酶工程实验报告册
实验目的
本次实验旨在通过酶工程技术，利用已知的酶催化反应，研究酶的可控性和催化效率，以此为基础进一步探讨酶工程在生物技术领域中的应用。
实验材料
* 酶底物：葡萄糖溶液
* 酶：葡萄糖酶
* 实验器材：试管、显微镜、荧光分析仪
实验步骤
1. 准备实验器材和试剂，保证实验环境的洁净。
2. 将葡萄糖底物溶液放入试管中，分为十组，每组添加不同浓度的葡萄糖底物。
3. 将葡萄糖酶加入到每个试管中，调整酶的浓度。
4. 将试管放入恒温水浴中，使反应温度稳定在适宜的酶活性温度。
5. 设置实验时间，每隔一定时间取出一组试管进行荧光分析，记录反应速率。实验结果
根据实验数据得到以下结果：
* 反应速率与底物浓度呈正相关关系，随着底物浓度的增加，反应速率也增加。* 酶活性随着温度的增加呈增加趋势，但超过酶的适宜温度范围后，酶活性会急剧下降。
结果分析
本实验结果表明葡萄糖酶催化反应具有高度的可控性和催化效率。随着底物浓度的增加，酶催化反应速率增加，这可以为工业生产中的底物转化提供重要参考。
而温度对酶活性的影响也表明了酶工程中合适的条件选取的重要性，过高或过低的温度都会影响酶的活性，从而降低反应效率。
实验结论
通过本次实验，我们验证了酶工程技术在酶催化反应中的重要作用。酶工程技术不仅可以提高反应效率，还可以调控酶的活性和特异性，从而对底物进行选择性催化。这对于工业生产和医药研发有着重要的意义。
实验心得
通过本次实验，我深刻认识到酶工程技术在生物技术领域的重要性。酶工程技术可以帮助我们解决传统催化反应过程中的瓶颈问题，提高反应的效率和选择性。同时，酶工程技术还为制定合适的反应条件提供了理论依据，进一步推动了生物技术的发展。
酶工程实验1-2
二、实验原理
2、外源基因的诱导表达 提高外源基因表达水平的基本手段之一， 就是将宿主菌的生长与外源基因的表达分成 两个阶段，以减轻宿主菌的负荷。 常用的有温度诱导和药物诱导。 本实验采用异丙基硫代 -β-D- 半乳糖昔 （IPTG）诱导外源基因表达。 不同的表达质粒表达方法并不完全相同， 因启动子不同，诱导表达要根据具体情况而 定。
6)、注意事项
（1）汽未放尽前，不得开启高压锅； （ 2 ）如果灭菌后的培养基在锅内不及时拿出，需在蒸汽 放尽后将锅盖打开，切忌将培养基封闭在锅内过夜； （3）压力表指针在 0.05MPa以上时，不能过快放汽，以 防止压力急速下降，液体滚沸，从培养容器中溢出。 （4）操作过程，请注意安全，小心烫伤
2、大肠杆菌pET30a-kerA和pET32a-manA诱导产蛋 白
1）挑取单克隆接种至50 mL含Kan和Amp的液体LB培养基中；
2）37 ℃ 200 r/min气浴恒温摇床培养到OD600达0.5-0.6左右（约4-4.5 h）；
3）往液体培养基中加入500 μL100 mM的IPTG，37 ℃ 200 r/min继续 培养4-5 h； 4）培养结束后，培养液冰浴5-10 min，取适当菌液，4℃ 10000 r/min 离心10 min收集菌体； 5 ）菌体用 50 mM pH 7.5 Tris/HCl 充分重悬，经超声波处理后， 4 ℃ 10000 r/min 离心10 min收集菌体和上清，上清即为粗酶液； 6）分别加入50 μL上样缓冲液，煮沸8 min后进行SDS-PAGE分析或者20 ℃贮存待用。
生物大实验2(酶工程实验)
实验一酶促反应中初速度时间范围测定
一、实验目的
1.了解酶促反应中初速度时间范围测定的基本原理；
2.掌握酶促反应中初速度时间范围的测定方法。
二、实验原理
酸性磷酸酯酶（acid phosphatase, EC 3.1.3.2）广泛分布于动植物体中，尤其是植物的种子、动物肝脏和人体的前列腺中。它对生物体内核苷酸、磷蛋白和磷脂的代谢起着重要作用。
酸性磷酸酯酶能专一性水解磷酸单酯键。以人工合成的对硝基苯磷酸酯（4-nitrophenyl phosphate,NPP）作底物，水解产生对硝基苯酚和磷酸。在碱性溶液中，对硝基酚的盐离子于405nm处光吸收强烈，而底物没有这种特性。
利用产物的这种特性，可以定量的测定产物的生成量，从而求得酶的活力单位。即通过测定单位时间内405nm处光吸收值的变化来确定酸性磷酸酯酶的活性。
酸性磷酸酯酶的一个活力单位是指在酶反应的最适条件下，每分钟生成1μmol产物所需的酶量。
要进行酶活力测定，首先要确定酶反应时间。而酶的反应时间应该在初速度时间范围内选择。可以通过进程曲线的制作来求出酶的初速度时间范围。进程曲线的制作是指在酶反应的最适条件下，采用每隔一定时间测定产物生成量，以酶反应时间为横坐标，产物生成量为纵坐标绘制而成。从进程曲线可知，在曲线起始的一段时间内为直线，其斜率代表初速度。随着反应时间的延长，曲线趋于平坦，斜率变小，反应速度下降。要真实反映出酶活力大小，就应在初速度时间内测定。
三、实验试剂与器材
1.试剂
（1）酸性磷酸酯酶原液（从绿豆芽中提取）
（2）酸性磷酸酯酶液（通过原酶液稀释得到）
酶工程实验
实验1、大蒜细胞SOD的提取和分离
一、原理
超氧化物歧化酶（SOD）是一种具有抗氧化、抗衰老、抗辐射和消炎作用的药用酶。它可催化超氧负离子（O2-）进行歧化反应，生成氧和过氧化氢。大蒜蒜瓣和悬浮培养的大蒜细胞中含有较丰富的SOD，通过组织或细胞破碎后，可用
pH7.8磷酸缓冲液提取出。由于SOD不溶于丙酮，可用丙酮将其沉淀析出。
二、材料和试剂
1、新鲜蒜瓣
2、0.05mol/L磷酸缓冲液（pH7.8）
3、氯仿-乙醇混合液：氯仿:无水乙醇=3:5
4、丙酮：用前需预冷至4-10℃
5、0.05mol/L碳酸盐缓冲液（pH10.2）
6、0.1mol/L EDTA溶液
7、2mmol/L肾上腺素溶液
三、步骤
1、组织细胞破碎：称取5g大蒜蒜瓣，置于研钵中研磨。
2、SOD的提取：破碎后的组织中加入2-3倍体积的0.05mol/L磷酸缓冲液
（pH7.8），继续研磨20min，使SOD充分溶解到缓冲液中，然后在5000rpm下离心15min，取上清液。
3、除杂蛋白：上清液加入0.25体积的氯仿-乙醇混合液搅拌15min，5000rpm离心15min，得到的上清液为粗酶液。
4、SOD的沉淀分离：粗酶液中加入等体积的冷丙酮，搅拌15min，5000rpm离心15min，得SOD沉淀。将SOD沉淀溶于0.05mol/L磷酸缓冲液（pH7.8）中，于55-60℃热处理15 min，得到SOD酶液。
5、SOD活力测定
将上述提取液、粗酶液和酶液分别取样，测定各自的SOD活力。
试剂空白管对照管样品管
碳酸缓冲液 5.0 5.0 5.0
酶工程实验大纲
湖北大学
酶工程实验
(0818800193）
实验教学大纲
（第2版）
生命科学学院
生化教研室
2014年7月
前言
课程名称:酶工程实验实验学时:16学时
适用专业：生物工程课程性质：必修
一、实验课程简介
酶工程是生物工程的主要内容之一，是现代酶学和生物工程学相互结合而发展起来的一门新的技术学科.它将酶学、微生物学的基本原理与化工、发酵等工程技术有机结合起来，并随着酶学研究的迅速发展，特别是酶的广泛应用而在国民生产生活中日益发挥着越来越重要的作用。酶工程实验课是生物工程等本科实验教学的一个重要组成部分，通过实验教学可以加强学生对酶工程基本知识和基本理论的理解，掌握现代酶学与相关技术的有关的基本的实验原理与技能。在实验过程中要求学生自己动手，分析思考并完成实验报告。酶工程实验性质有基础性、综合性、设计(创新）性三层次。
二、课程目的
本实验课程主要根据酶工程的三大块内容即酶的生产、酶的改性与酶的应用来设计安排实验,通过这些实验内容，使学生深入理解酶工程课程的基本知识;巩固和加深所学的基本理论；掌握酶工程中基本的操作技能。同时，通过实验培养学生独立观察、思考和分析问题、解决问题和提出问题的能力,养成实事求是、严肃认真的科学态度，以及敢于创新的开拓精神;并在实验中进一步提高学生的科学素养。
三、考核方式及成绩评定标准
考核内容包括实验过程中的操作情况，实验记录及结果的准确性，实验报告的书写及结果分析，思考题的回答情况,仪器设备的使用情况及遵守实验室规章制度的情况等,根据这
些方面进行成绩评判和记录，综合给出实验总成绩。
酶工程实验方案
酶工程实验方案
一、实验目的
通过本实验，学生将学会利用酶工程实验技术，熟悉酶的生产、纯化和应用过程，培养学
生实验操作技能和科学研究能力，为学生今后的科研工作打下良好的基础。
二、实验原理
酶工程是利用生物工程学原理和技术手段，对酶进行筛选、改造和工程应用。酶在生产中
扮演着极其重要的角色，它广泛应用于食品、医药、环保、能源、材料等领域。酶工程实
验的关键是酶的生产和纯化技术。典型的酶工程包括：酶源的筛选、酶基因的克隆与表达、酶的纯化和酶的应用等。
三、实验内容
本实验将包括以下内容：
1. 酶源的筛选：选择一种具有较高酶活性的微生物菌株，进行培养、鉴定，筛选出所需酶。
2. 酶基因的克隆与表达：通过PCR技术扩增酶基因，将其克隆至适当的表达载体中，然
后将其转化至表达宿主中，表达目的蛋白。
3. 酶的纯化：采用离心、柱层析、过滤等方法对表达蛋白进行酶的分离和纯化。
4. 酶的应用：将纯化的酶用于特定的生产或研究中，评价酶的性能。
四、实验步骤
1. 酶源的筛选
（1）选择合适的微生物菌株，进行培养并获得菌液样品。
（2）采集菌液样品，进行酶活性测试，筛选出具有较高酶活性的菌株。
2. 酶基因的克隆与表达
（1）利用PCR技术扩增酶基因。
（2）将扩增出的酶基因克隆至表达载体中。
（3）转化表达载体至适当的表达宿主中，进行表达。
3. 酶的纯化
（1）收集表达蛋白，进行细胞破碎，得到目的蛋白混合物。
（2）通过离心、柱层析、过滤等方法对蛋白混合物进行纯化。
4. 酶的应用
（1）评价纯化酶的性能。
（2）将纯化的酶用于特定的生产或研究中。
《酶工程》课程实验教学大纲
《酶工程》课程实验教学大纲
一、实验课程基本情况
二、实验课程简介
《酶工程》是制药工程的主要内容之一，是现代酶学和生物工程学相互结合而发展起来的一门新的技术学科。它将酶学、微生物学的基本原理与化工、发酵等工程技术有机结合起来，并随着酶学研究的迅速发展，特别是酶的广泛应用而在国民生产生活中日益发挥着越来越重要的作用。酶工程实验课是制药工程等本科实验教学的一个重要组成部分，通过实验教学可以加强学生对酶工程基本知识和基本理论的理解，掌握现代酶学与相关技术的有关的基本的实验原理与技能。在实验过程中要求学生自己动手，分析思考并完成实验报告。酶工程实验性质有基础性、综合性、设计（创新）性三层次。。
三、实验教学目的和基本要求
本实验课程主要根据酶工程的三大块内容即酶的生产、酶的改性与酶的应用来设计安排实验，通过这些实验内容，使学生深入理解酶工程课程的基本知识；巩固和加深所学的基本理论；掌握酶工程中基本的操作技能。同时，通过实验培养学生独立观察、思考和分析问题、解决问题和提出问题的能力，养成实事求是、严肃认真的科学态度，以及敢于创新的开拓精神；并在实验中进一步提高学生的科学素养。
四、实验内容与学时分配
课堂教学与实验教学结合。课堂教学合班上课，实验课分小班进行，每4
人一组。实验设计尽量从实际生产中提出问题，增加学生对实际动手操作的兴趣，安排每个人动手。通过实际操作巩固掌握教材相关理论知识。
六、考核方法
实验成绩占课程总成绩的20%。主要考察学生每次实验的表现：动手操作能力，观察能力，解决问题的能力等。其次检查实验报告的书写情况是否认真准确。
部分修改-酶工程实验-权春善
实验一紫外吸收法测定蛋白质含量
一、实验目的
学会用紫外吸收法测定蛋白质含量的方法。
二、实验仪器
紫外分光光度计
三、实验原理
大多数蛋白质由于有酪氨酸和色氨酸的存在，在紫外光280 nm有吸收高峰，可以进行蛋白质含量的测定。但是核酸在280 nm也有吸收，干扰测定，不过核酸的最大吸收峰在260 nm，warburg等测定了酵母烯醇酶和酵母核酸在280 nm和260 nm时吸光值（A）的比值，然后通过计算消除核酸存在的影响，可以求得有核酸存在时蛋白质的浓度。
该方法是以酵母烯醇酶蛋白和酵母核酸为标准建立计算公式，而不同蛋白质的氨基酸组成也不同，因而光吸收也不尽相同，这就会带来一定的误差。
四、方法步骤
1．取待测样品溶液置于光径1cm的石英比色杯中，于紫外分光光度计波长280 nm和260 nm，分别读取A280和A260，用蒸馏水（缓冲溶液或盐溶液，视样品溶液而定）为比色空白对照。
2．根据下列公式计算样品中的蛋白质含量。
蛋白质含量（mg/ml）=1.55A280—0.76A260
五、实验报告
计算所测材料蛋白质的含量。
六、思考题
1．测定蛋白质含量的方法有哪些，它们所根据的原理是什么？
2．试比较测定蛋白质含量的几种方法的优缺点。
实验二蛋白酶活性的测定方法
一、实验目的
（1）了解蛋白酶活力测定的原理
（2）掌握蛋白酶活性的测定方法。
二、实验原理
蛋白酶在一定的条件下不仅能够水解蛋白质中的肽键，也能够水解酰胺键和酯键，因此可用蛋白质或人工合成的酰胺及酯类化合物作为底物来测定蛋白酶的活性。
本实验选用酪蛋白为底物，测定微生物蛋白酶水解肽键的活力。酪蛋白经蛋白酶水解后，降解成相对分子量较小的肽和氨基酸，在反应混合物中加入三氯醋酸溶液，相对分子量较大的蛋白质和肽就沉淀下来，相对分子量较小的肽和氨基酸仍留在溶液中，溶解于三氯醋酸中的肽的数量正比于酶的数量和反应时间。在275 nm波长下测定溶液吸光度的增加，就可以计算出酶的活力。
酶工程实验讲义
实验一酵母蔗糖酶的提取
一、原理
酵母中含有丰富的蔗糖酶(EC.3.2.1.26)，本实验以酵母为原料，通过超声波破碎细胞、硫酸铵沉淀等步骤，分离纯化酵母蔗糖酶。
二、实验材料、仪器和试剂
1.材料活性干酵母
2.仪器
(1)高速离心机
(2)恒温水浴锅
(3)超声破碎仪
3.试剂
(1)1 mol/L醋酸溶液
三、操作步骤
1.破碎细胞
取5 g干酵母，加5 g石英砂，置于预先冷却的研钵中，加30 mL去离子水，研磨30 min，在冰箱中冰冻约10 min（研磨液面上刚出现冰结为宜），重复2次。将研磨液转移至大离心管中，12000 r/min离心15 min，弃去沉淀。
2.加热除杂蛋白
将上清液转入三角瓶，用1 mol/L醋酸溶液逐滴加入，调其pH值至5.0，然后迅速放入50℃的水浴中，保温30 min。在温育过程中，注意经常缓慢搅拌液体。之后在冰浴中迅速冷却之，以12000 r/min的转速离心20 min，弃去沉淀。留0.5 mL上清液为第二组分。
3.乙醇沉淀
量出上清液的体积，加入等体积的95%冷乙醇溶液(预先放在-20℃低温下的时间不少于30 min)，于冰浴中温和搅拌20 min。然后以12000 r/min的转速离心25 min，小心弃去上清液，沉淀沥干。将沉淀溶解在6 mL 0.05 mol/L Tris-HCl 缓冲液(pH值7.3)中，搅拌(5 min以上)使其完全溶解，以12000 r/min的转速离
心25 min，取出0.5 mL上清液作为第三组分，剩余部分(乙醇抽提液)进行第4步操作。
酶工程实验
酶工程实验
实验一、纤维素酶活力测定及酶促动力学研究
一、原理:酶促动力学研究酶促反应的速度及影响速度的各种因素，而米氏常数K m值等于酶促反应速度为最大速度一般时所对应的底物浓度，其值大小与酶的浓度无关，是酶促反应的特征常数。不同酶的K m值不同，同一种酶与不同的底物反应时，其K m值也不同，K m值反映了酶和底物亲和力的强弱程度，K m值越大，表明酶和底物的亲和力越弱；K m值越小，表明酶与底物的亲和力越强。
酶的活力就是酶催化的反应速度，通常用单位时间内底物的减少或产物的增加来表示。酶反应过程中产物的生成和时间的关系可以用进程曲线来说明，曲线的斜率就是酶反应过程中的反应速度。从进程曲线来看，在一定时间内反应速度维持恒定，但随着时间的延长，反应速度逐渐降低，这是由多种因素造成的。所以，为了准确表示酶的反应速度必须采用初速度，即保持恒定时的速度。同样，不同酶浓度下的反应进程曲线也可以说明这个问题。
酶活力可以被某些物质改变，凡能降低酶的活力甚至使酶失活的物质，均称为抑制剂，分为可逆抑制和不可逆抑制两种类型。可逆抑制包括竞争性抑制、非竞争性抑制等类型。在有抑制剂存在的条件下，酶的一些动力学性质会发生改变，如K m，V max等，可通过作图法求得，作图法很多，最常用的就是Lineweaver-Burk作图法（即双倒数作图法）。
二、仪器和试剂
1、仪器: (1)恒温水浴锅（2）电炉（3）722分光光度计（4）试管、移液管若干
2、试剂: （1）DNS溶液(结晶酚、氢氧化钠、亚硫酸氢钠、酒石酸钾钠、3，5-二硝基水杨酸) （2）2.5mmol/L 葡萄糖溶液（3）0.5%羧甲基纤维素钠溶液（4）1mg/ml纤维素酶溶液（5）磷酸缓冲液pH5.8 （6）8mol/lL 脲（mL）（7）蒸馏水
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湖北大学
酶工程实验
（0818800193）实验教学大纲
（第2版）
生命科学学院
生化教研室
2014年7月
前言
课程名称：酶工程实验实验学时：16学时
适用专业：生物工程课程性质：必修
一、实验课程简介
酶工程是生物工程的主要内容之一，是现代酶学和生物工程学相互结合而发展起来的一门新的技术学科。它将酶学、微生物学的基本原理与化工、发酵等工程技术有机结合起来，并随着酶学研究的迅速发展，特别是酶的广泛应用而在国民生产生活中日益发挥着越来越重要的作用。酶工程实验课是生物工程等本科实验教学的一个重要组成部分，通过实验教学可以加强学生对酶工程基本知识和基本理论的理解，掌握现代酶学与相关技术的有关的基本的实验原理与技能。在实验过程中要求学生自己动手，分析思考并完成实验报告。酶工程实验性质有基础性、综合性、设计（创新）性三层次。
二、课程目的
本实验课程主要根据酶工程的三大块内容即酶的生产、酶的改性与酶的应用来设计安排实验，通过这些实验内容，使学生深入理解酶工程课程的基本知识；巩固和加深所学的基本理论；掌握酶工程中基本的操作技能。同时，通过实验培养学生独立观察、思考和分析问题、解决问题和提出问题的能力，养成实事求是、严肃认真的科学态度，以及敢于创新的开拓精神；并在实验中进一步提高学生的科学素养。
三、考核方式及成绩评定标准
考核内容包括实验过程中的操作情况，实验记录及结果的准确性，实验报告的书写及结果分析，思考题的回答情况，仪器设备的使用情况及遵守实验室规章制度的情况等，根据这些方面进行成绩评判和记录，综合给出实验总成绩。
四、实验指导书及主要参考书
1．魏群：生物工程技术实验指导，高等教育出版社，2002年8月。
2．禹邦超：酶工程（附实验），华中师范大学出版社，2007年8月
五、实验项目
实验项目一览表（可选）
实验类型：演示性、验证性、综合性、设计性、其它
实验一双酶法制备淀粉糖（3课时）
一、实验原理
目前国内外淀粉糖的生产大都采用双酶法。双酶法生产淀粉糖是以淀粉为原料，先经α-淀粉酶液化成糊精，再用糖化酶催化生成淀粉糖浆。α-淀粉酶又称为液化型淀粉酶，它作用于淀粉时，随机地从淀粉分子内部切开α-1，4葡萄糖苷键，使淀粉水解成糊精和一
些还原糖。糖化酶又称为葡萄糖淀粉酶，它作用于淀粉时，从淀粉分子的非还原端开始逐个地水解α-1，4葡萄糖苷键，生成葡萄糖和一些低聚糖。且糖化酶还有一定的水解α-1，6葡
萄糖苷键和α-1，3葡萄糖苷键的能力。
二、实验步骤
1．液化：
准确称取50g生粉，加150mL水（pH 6.0～6.4，HCl)配制成40％的淀粉浆，加入0.1gCaCl2，加入0.7gα-淀粉酶，在75℃温度下保温40min左右，使淀粉液化成糊精。液化反应过程中用碘反应检测，至颜色变为黄棕色时，即为终点。升温至100℃并保温10min。
2．糖化：
将液化淀粉液冷却至55℃～60℃，用0.1m1/LHCl调pH至4.5～5.0，加入0.12g 糖化酶，将水浴槽温度升至60土2℃，保温糖化16h，使糊精转变为葡萄糖和低聚糖(淀粉糖浆)。
3．脱色：
在淀粉糖浆中加入1g活性炭，在80℃下搅拌30min后，滤去活性炭，得无色透明糖液。
4. 所得糖液中葡萄糖含量的测定。用3,5-二硝基水杨酸法测定。
三、实验结果：测定所得无色透明糖液中葡萄糖的浓度。
四、仪器和试剂
1．仪器：
恒温水浴器、烧杯、玻璃棒、天平、量筒及其他常规仪器用具。
2．试剂：
生粉、α-淀粉酶、糖化酶、0。1mol/L HCI、无水CaCl2、。碘液、活性炭。
实验二、不同浓度果胶酶澄清苹果汁效果、对收得率的影响（4
课时）
实验类型：验证性
实验目的：通过实验掌握酶在食品工业上的基本应用，果胶酶作用的基本原理和果汁
生产的基本工艺与过程。
实验内容：
1．制备苹果汁：将苹果洗净，切成小块，用榨汁机打碎成果汗匀浆。加热苹果汁到100℃使酶钝化后，再冷却至50℃左右。
2．配制不同浓度的酶液：取5支10mL的刻度试管，依次编为2号~6号。分别加入2mL、4mL、6mL、8mL、10mL质量浓度为10g/L的果胶酶溶液，再分别加入苹果酸定容至10mL，依次配制质量浓度为2，4，6，8，10g/L的果胶酶溶液备用。（实验老师已配好）3．降解苹果汗：取6个号烧杯，向1号烧杯加蒸馏水1mL，向2号~6号烧杯分别加入1mL质量浓度为2，4，6，8，10g/L的果胶酶溶液。再向6只烧杯中均加入4mL蒸馏水，摇匀，然后都加入95mL经钝化的苹果汁，45℃水浴中恒温60min。
4．沉淀：向上述6只烧杯中均添加明胶约0.02g，硅溶胶约0.1mL，膨润土约0.20g，活性炭约0.05g处理，添加顺序为：明胶等主要起吸附、沉淀和过滤作用。所用物品符合食品安全要求。充分混匀后静置60min，使其充分沉淀后过滤。过滤进先用纱布初滤，并挤干，所得初滤液再抽滤。
5．记录结果
观察6个样品滤液的澄清度，用量筒测量澄清滤液（即苹果汁）的体积，将结果填入下表。
不同酶浓度下苹果汗收得率
澄清效果
苹果汗体积（mL）
澄清苹果汁收得率（%）
实验要求：
总结不同果胶酶浓度下苹果汁的澄清效果，并观察使苹果汁获得最高收得率时所需的果胶酶浓度。分析所出现的实验结果的原因，并回答相应的实验思考题。
实验三、实习参观细胞发酵罐细胞培养产酶（1课时）
实验类型：演示性
实验目的：了解产酶的细胞发酵罐的基本结构，掌握细胞发酵产酶时的工艺条件及进行相关调控的基本原理和方法。
实验内容：
参观发酵罐及其配套的空压机、蒸汽机、发酵罐调控主机，了解各个设备的主要功能。熟悉发酵罐的运行的基本操作，对pH、溶氧、温度、搅拌速度等重要参数动手进行设定、调节。掌握发酵罐的基本结构，内部组成、有关的通气、通水等管道走线的构造、规律等。
主要设备器材：江苏大学产自动控制发酵罐及配套蒸汽机、空压机。
实验要求：
了解发酵罐的基本结构，有关的通气、通水等管道走线的构造、规律，掌握有关发酵罐运行时有关参数的设定、检测及调节的方法，对利用细胞发酵罐进行细胞培养用以产酶的流程有大致的了解。
实验四、有机溶济沉淀法制备大豆脲酶及测定（3课时）
实验类型：综合性
实验目的：
掌握酶的提取与性质测定中的实验方法，熟悉有关酶提取与活力、Km值测定的基本原理和基本操作。
实验内容：
1．提取：（1）称取约5g人造浮石，置小烧杯中，用2%乙酸浸泡1-2分钟，倾去酸，用蒸馏水洗涤至中性，沥干备用。（2）称取约10g新鲜大豆粉，置于锥形瓶中，加上述人造浮石，加50ml32%丙酮溶液，在冰浴中持续摇动4~5min，4层纱布过滤，收集滤液。（3）将滤渣重新置于锥形瓶中，另加10ml32%丙酮，再提取一次。纱布过滤，滤液在4℃，3500r/min下离心8~10min，倾出上清液，计量体积。取1mL酶液保存，供测酶活力用。
2．沉淀酶：（1）将提取的酶液置冰浴中缓慢搅拌下，用滴管逐滴滴加2%醋酸，并不断用精密pH试纸检测pH变化，观察产生混浊现象，至pH4.9。置4℃10分钟。（2）4℃3500r/min离心10min，沉淀用电吹风稍微吹干，所得即为脲酶粗品。称重，计算酶收得率。