第四章 细胞破碎和分离技术..
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细胞的破碎与分离
35
2、珠磨法
1)研磨是常用的一种方法，它将细胞悬浮液与玻璃 小珠、石英砂或氧化铝一起快速搅拌或研磨，使达到 细胞的某种程度破碎。
适用大多数微生物的细胞破碎
将细胞在珠磨机中破碎被认为是最有效的一种 细胞物理破碎法。 破碎微生物细胞用的珠磨机有多种形式。
36
搅拌磨简图
动力分离器，可调节其缝隙
在这类设备中，由于圆盘的高速旋转，使细胞悬浮液和珠子 相互搅动，细胞的破碎是由剪切力层之间的碰撞和磨料的滚 动引起的。破碎作用将遵循一级动力学定律。 37
48
(5)细胞悬浮液的流速 声波破碎是细胞破碎中的一种普通方法， 在许多实验室研究或生化物质的分离制备 中都能见到， 但是要向大量细胞悬浮液中通入足够的能量 是很因难的，故在工业范围中还未采用这 种方法。
49
超声破碎
50
超声波破碎仪
51
52
4、其他类型机械破碎法
• X-press法： 将浓缩的细胞悬浮液低温冷却形成冰晶，再 施以高压，高压力冲击造成冰晶磨损使细胞 破裂。 • 微波法： 胞内物质局部受热，内压升高使细胞表面出 现孔洞或裂纹，小分子能够出入细胞，细胞 仍保持其形态。此法处理蛋白质分子三维结 构随微波场方向变化而被破坏，蛋白质分子 缠绕成球，改变溶解性，便于包含体中重组 蛋白的回收。
便宜 昂贵
适中 便宜 便宜
血红细胞的 破坏
第四章 细胞破碎和分离技术
（2）有机溶剂法
有机溶剂能溶解细胞壁的脂类，从而改变细 胞通透性。
（3）表面活性物质
能溶解膜结构中的脂蛋白，使细胞通透性增加。
化学法的优缺点 优点 细胞外形保持完整，碎片少，浆液粘度低，
易于固液分离和进一步提取。
①通用性差；
缺点 ②时间长，效率低，一般胞内物质释放率
不超过 80％。 ③有些化学试剂有毒，后续工作需设法分 离除去。
第四章 细胞破碎和分离提 取技术
发酵液或培养液 预处理
固液分离（离心或过滤）
固体沉淀：胞内产物
清液：胞外产物
细胞破碎和细胞碎片分离
目标产物
本章内容
目标产物
一、细胞破碎的主要阻力：细胞壁
细胞破碎的主要目的：破坏细胞壁和细胞膜， 使细胞内物质释放出来。
各种微生物细胞壁组成与结构
二、常用细胞破碎技术及原理
（四）生物法
1、酶溶法
（1）原理：利用酶溶解细胞壁，使细胞壁受到部分 或完全破坏；
（2）常用的酶：溶菌酶、 β-1 ,3-葡聚糖酶、 β-1,6-葡聚糖酶、蛋白酶等。
其中溶菌酶主要用于细菌类，其他酶对酵母作用 较显著。
溶菌酶：能直接水解G+菌细胞壁，作用位 点是肽聚糖多肽链中的β-1，4糖甘键。
2、超临界CO2的破壁原理
CO2的临界值：31.26℃；7.38MPa 超临界CO2密度近于液体，粘度近于气体，扩 散系数为液体的100倍，因而具有惊人的溶解 能力。
第四章细胞破碎和分离技术
（3）洗涤 （4）洗脱
（5）柱床再生和清洗
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5、膨胀(péng zhàng)
床的应用 纳豆激酶(jīméi)的分离 提取
纳豆：大豆经纳豆菌发酵而成
精品PPT
降血压，抗癌 抗氧化，溶血栓
纳豆激酶(jīméi)
1980年，日本心脑血管专家须见洋行博士 (bóshì)，从事溶解血栓药物研究工作
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2、高压(gāoyā) 匀浆法
精品PPT
注意：团状或丝状真菌不适用
高压(gāoyā)匀浆机 进料口
出料口
Hale Waihona Puke Baidu
利用高压迫使悬浮液通过针形阀，由于(yóuyú)突然 减压和高速冲撞造成细胞破裂
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3、超声破碎(pò suì)法
原理(yuánlǐ)：空化作用和搅拌作 用
缺点：产生的热量不容易驱散，不适于大 规模操作，主要用于实验室。
通过流速控制膨胀率
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（2）进料吸附 (xīfù)
把目标产物(chǎnwù)吸附在吸附剂上，让杂质或细胞 碎片等固体颗粒流出膨胀床。
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（3）洗涤(xǐdí) 洗去留在柱内的细胞(xìbāo)、细胞(xìbāo)碎片 和弱吸附性的杂质。 洗涤结束后，改用固定床操作
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（4）洗脱(xǐ tuō) 采用固定床操作，将配制好的洗脱液用横流泵 从柱上部导入，下部(xià bù)流出，分段收集， 并分析检测目标产物的活性峰位置。
（5）柱床再生和清洗
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5、膨胀(péng zhàng)
床的应用 纳豆激酶(jīméi)的分离 提取
纳豆：大豆经纳豆菌发酵而成
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降血压，抗癌 抗氧化，溶血栓
纳豆激酶(jīméi)
1980年，日本心脑血管专家须见洋行博士 (bóshì)，从事溶解血栓药物研究工作
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2、高压(gāoyā) 匀浆法
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注意：团状或丝状真菌不适用
高压(gāoyā)匀浆机 进料口
出料口
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利用高压迫使悬浮液通过针形阀，由于(yóuyú)突然 减压和高速冲撞造成细胞破裂
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3、超声破碎(pò suì)法
原理(yuánlǐ)：空化作用和搅拌作 用
缺点：产生的热量不容易驱散，不适于大 规模操作，主要用于实验室。
通过流速控制膨胀率
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（2）进料吸附 (xīfù)
把目标产物(chǎnwù)吸附在吸附剂上，让杂质或细胞 碎片等固体颗粒流出膨胀床。
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（3）洗涤(xǐdí) 洗去留在柱内的细胞(xìbāo)、细胞(xìbāo)碎片 和弱吸附性的杂质。 洗涤结束后，改用固定床操作
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（4）洗脱(xǐ tuō) 采用固定床操作，将配制好的洗脱液用横流泵 从柱上部导入，下部(xià bù)流出，分段收集， 并分析检测目标产物的活性峰位置。
chapter4细胞破碎
Chapter 4
Cell Disruption
第四章 细胞破碎
※ 4.0 Summary 概述
细胞破碎的目的
细胞破碎的原因
由于有许多生物代谢产物存在于细胞内部，必须在纯化以 前将细胞破碎，使胞内物质释放到液相中，然后方可进行 提取
尤其是由基因工程菌产生的大多数蛋白质不会被分泌到发 酵液中，而是在细胞内沉积。脂类物质和一些抗生素也是 包含在生物体中。
胶体磨
德国进口珠磨机
ZM系列卧式密闭珠(砂)磨机
3.超声破碎法（Ultrasonication）
利用发射15-25kHz的超声波探头处理细胞悬浮液。 一般认为超声波破碎的机理是：在超声波作用下液体发生 空化作用，空穴的形成、增大和闭合产生极大的冲击波和 剪切力，使细胞破碎。
影响超声波的细胞破碎效率因素：频率、液体温 度和粘度、处理时间等。 超声波破碎法是很强烈的破碎方法，适用于多数 微生物的破碎。一般杆菌比球菌易破碎，G-细菌
2.碱处理法
碱处理法和酶消化法相反，反应激烈，不具选择性，但
成本低廉。
碱加入细胞悬浮液中后和细胞壁进行了多种反应，包括 使磷脂皂化，使细胞壁的成分溶于表面活性剂，也使蛋 白质变性。该法不仅破坏了细胞壁也破坏了产物。 该法多用于细胞破碎获取粗提物
3.渗透冲击法
三种主要细胞破碎化学方法中最简单的是渗透冲击法。此
Cell Disruption
第四章 细胞破碎
※ 4.0 Summary 概述
细胞破碎的目的
细胞破碎的原因
由于有许多生物代谢产物存在于细胞内部，必须在纯化以 前将细胞破碎，使胞内物质释放到液相中，然后方可进行 提取
尤其是由基因工程菌产生的大多数蛋白质不会被分泌到发 酵液中，而是在细胞内沉积。脂类物质和一些抗生素也是 包含在生物体中。
胶体磨
德国进口珠磨机
ZM系列卧式密闭珠(砂)磨机
3.超声破碎法（Ultrasonication）
利用发射15-25kHz的超声波探头处理细胞悬浮液。 一般认为超声波破碎的机理是：在超声波作用下液体发生 空化作用，空穴的形成、增大和闭合产生极大的冲击波和 剪切力，使细胞破碎。
影响超声波的细胞破碎效率因素：频率、液体温 度和粘度、处理时间等。 超声波破碎法是很强烈的破碎方法，适用于多数 微生物的破碎。一般杆菌比球菌易破碎，G-细菌
2.碱处理法
碱处理法和酶消化法相反，反应激烈，不具选择性，但
成本低廉。
碱加入细胞悬浮液中后和细胞壁进行了多种反应，包括 使磷脂皂化，使细胞壁的成分溶于表面活性剂，也使蛋 白质变性。该法不仅破坏了细胞壁也破坏了产物。 该法多用于细胞破碎获取粗提物
3.渗透冲击法
三种主要细胞破碎化学方法中最简单的是渗透冲击法。此
第四章 细胞破碎..
38
n 阳离子表面活性剂主要是烷基胺盐。图4.3-1中的十二烷 基溴胺是典型的例子。它有一个长烷烃链（十六烷基）和 三个甲基，都连接在一个带正电的氮原子上，负离子通常 是卤素，市场上常做洗发剂出售。细胞破碎时条件较温和。
39
n 非离子表面活性剂是溶于水的聚合物。经济价值不明确， 市场上用于做洗碗剂。同样，这种清洁剂既有亲水基团 又有疏水基团。亲水基团不是硫酸盐，不是烷基胺盐而 是乙醇。
25
渗透流的动力来自渗透压，渗透压可能很大。可以通过 化学平衡来估算，水的化学电势是常数，即：
µH20 (outside) = µH20 (inside)
(4.3-1)
26
细胞外纯水的化学电势包括标准化学电势和压力修正项；与之平 衡的胞内的化学电势包括三项，即标准化学电势、压力修正相 和浓度修正项。对于理想的不可压缩溶液，这些修正相和式 （4.2-1）可改写为：
第四章 细胞破碎
1
概述
不同类型的细胞分泌目标产物的类型： 动物细胞多分泌到细胞外培养液 植物细胞多为胞内产物 微生物（细菌/酵母/真菌）胞内、胞外
对于胞内产物需要收集菌体或细胞进行 破碎。
2
概述
大多数情况下，抗生素，胞外酶，一些多糖， 及氨基酸等目标产物存在于发酵液中。
有些目标产物存在于生物体中。 尤其是由基因工程菌产生的大多数蛋白质是 在细胞内沉积。 脂类物质和一些抗生素包含在生物体中。
n 阳离子表面活性剂主要是烷基胺盐。图4.3-1中的十二烷 基溴胺是典型的例子。它有一个长烷烃链（十六烷基）和 三个甲基，都连接在一个带正电的氮原子上，负离子通常 是卤素，市场上常做洗发剂出售。细胞破碎时条件较温和。
39
n 非离子表面活性剂是溶于水的聚合物。经济价值不明确， 市场上用于做洗碗剂。同样，这种清洁剂既有亲水基团 又有疏水基团。亲水基团不是硫酸盐，不是烷基胺盐而 是乙醇。
25
渗透流的动力来自渗透压，渗透压可能很大。可以通过 化学平衡来估算，水的化学电势是常数，即：
µH20 (outside) = µH20 (inside)
(4.3-1)
26
细胞外纯水的化学电势包括标准化学电势和压力修正项；与之平 衡的胞内的化学电势包括三项，即标准化学电势、压力修正相 和浓度修正项。对于理想的不可压缩溶液，这些修正相和式 （4.2-1）可改写为：
第四章 细胞破碎
1
概述
不同类型的细胞分泌目标产物的类型： 动物细胞多分泌到细胞外培养液 植物细胞多为胞内产物 微生物（细菌/酵母/真菌）胞内、胞外
对于胞内产物需要收集菌体或细胞进行 破碎。
2
概述
大多数情况下，抗生素，胞外酶，一些多糖， 及氨基酸等目标产物存在于发酵液中。
有些目标产物存在于生物体中。 尤其是由基因工程菌产生的大多数蛋白质是 在细胞内沉积。 脂类物质和一些抗生素包含在生物体中。
4生物分离工程技术第四张细胞破碎技术
13、He who seize the right moment, is the right man.谁把握机遇，谁就心想事成。2021/9/72021/9/72021/9/72021/9/79/7/2021 •14、谁要是自己还没有发展培养和教育好，他就不能发展培养和教育别人。2021年9月7日星期二2021/9/72021/9/72021/9/7 •15、一年之计，莫如树谷；十年之计，莫如树木；终身之计，莫如树人。2021年9月2021/9/72021/9/72021/9/79/7/2021 •16、教学的目的是培养学生自己学习，自己研究，用自己的头脑来想，用自己的眼睛看，用自己的手来做这种精神。2021/9/72021/9/7September 7, 2021 •17、儿童是中心，教育的措施便围绕他们而组织起来。2021/9/72021/9/72021/9/72021/9/7 • You have to believe in yourself. That's the secret of success. 人必须相信自己，这是成功的秘诀。 •
生物分离(工程)技术
盐酸胍和脲
盐酸胍和脲是常用的变性剂。一般认为胍能与水中 氢键作用，削弱了溶质分子间的疏水作用，从而使 疏水性化合物溶于水溶液，如胍能从大肠杆菌膜碎 片中溶解蛋白。 盐酸胍不仅能改变细胞的通透性，而且能溶解不溶 性重组蛋白(如包含体)，并在其它试剂的配合下使 其二硫键断裂，变性解离成单体，从而释放出来。 除去变性剂和杂蛋白后，在一定条件下恢复肽链内 或肽链间的二硫键，再折迭复性成具有活性的蛋白 质立体结构。
生物分离(工程)技术
盐酸胍和脲
盐酸胍和脲是常用的变性剂。一般认为胍能与水中 氢键作用，削弱了溶质分子间的疏水作用，从而使 疏水性化合物溶于水溶液，如胍能从大肠杆菌膜碎 片中溶解蛋白。 盐酸胍不仅能改变细胞的通透性，而且能溶解不溶 性重组蛋白(如包含体)，并在其它试剂的配合下使 其二硫键断裂，变性解离成单体，从而释放出来。 除去变性剂和杂蛋白后，在一定条件下恢复肽链内 或肽链间的二硫键，再折迭复性成具有活性的蛋白 质立体结构。
第四章细胞的破碎与分离
第四章细胞的破碎与分离
第四章细胞的破碎与分离
教学基本要求：
1. 掌握细胞破碎的概念。
2. 熟悉和掌握细胞破碎的各种方法。
时间安排：3学时。
教学形式：本章以讲授为主，中间部分进行部分提问，采用PPT 课件讲课。
教学内容：
由于有许多生化物质存在于细胞内部，必须在纯化以前将细胞破碎，使胞内物质释放到液相中，然后方可进行提取。细胞破碎是指选用物理、化学、酶或机械的方法来破坏细胞壁或细胞膜。
破碎率及其测定方法：
破碎率：被破碎细胞的数量占原始细胞数量的百分比。
测定方法：直接测定法和间接测定法。
细胞破碎方法分类
1) 机械破碎法（高速珠磨法、高压匀浆法、超声波法等）
2) 非机械破碎法（化学法、酶解法、渗透压法、冻融法、干燥法等）
机械破碎法：
一、固体剪切方法（珠磨）：
1、定义—利用由高速转动的珠子所产生的剪切力而达到细胞破碎的过程
2、工作原理：固－固剪切力、液－固剪切力等。
3、影响因素：
转盘外缘速度：速度增加，破碎率增加，但功率-，温度-
珠粒添量和大小：要适度
温度：但研磨产热，功率-，温度-。如产物热不稳定，必须控温。
细胞浓度x：最佳x由实验确定。一般产热量随细胞浓度的降低而
下降，但单位细胞重量的能耗-。
流量Q：破碎为一级反应。Q-, E-，Rˉ；Qˉ，Eˉ，R-。
二、高压匀浆法（液体剪切方法）
1、定义—利用高压细胞悬浮液因减压所产生的剪切力而达到细胞破碎的过程
2、工作原理：液－液剪切力、压力差等
3、影响因素：
通过匀浆机的次数
温度：高温使破碎率增加但高温使产物变性
压力：高压使破碎率增加但高压使能耗增加，且会使机器破损。
第4章细胞破碎2010
1）能耗高、产热高，冷却困难。 2）大分子目的物失活增加。 3）碎片小，分离困难。
珠磨法 适用于工业 化规模的菌 体破碎，实 验室规模， 一般使用高 速组织捣碎 机、Braun均 浆机。中试 规模，使用 胶体磨。
二、高压匀浆法
高压匀浆器由高压泵和匀浆阀组成。 工作原理：高压细胞悬液通过针形阀，突然减压和高速撞击破碎细胞。
阀座的形式对破碎细胞有影响
刃缘阀座破碎 效率更高，但更易 摩损。
不宜采用匀浆法的微生物细胞：
1）易造成堵塞的团状或丝状菌。
2）较小的革兰氏阳性菌
3）含有包含体的基因工程菌
匀浆发与珠磨法比较：
匀浆法
珠磨法
操作参数少，易确定。
操作参数多，需凭经验。
温度控制难
温度控制较容易。
破来自百度文库率较低，许多次循环 一次破碎率高
第四章 微生物细胞破碎
第一节 第二节 第三节
细胞破碎的分类 细胞壁的组成与结构 常用破碎方法 珠磨法 高压匀浆法 超声波破碎法 酶解法 化学渗透法 其它方法
第四节 破碎率的测定与破碎技术的研究方向
第一节 细胞破碎的分类
许多生物产品都存在于细胞内部（如胰岛素、干扰素）
很多基因工程产物都是胞内物质， 因此，细胞破碎是提 取这些成分的第一步，也是提取产物的关键性步骤，
高压匀浆一般需多级操作，每次循环前进行级 间冷却。提高压力有利于细胞破碎，但会增加能耗。
珠磨法 适用于工业 化规模的菌 体破碎，实 验室规模， 一般使用高 速组织捣碎 机、Braun均 浆机。中试 规模，使用 胶体磨。
二、高压匀浆法
高压匀浆器由高压泵和匀浆阀组成。 工作原理：高压细胞悬液通过针形阀，突然减压和高速撞击破碎细胞。
阀座的形式对破碎细胞有影响
刃缘阀座破碎 效率更高，但更易 摩损。
不宜采用匀浆法的微生物细胞：
1）易造成堵塞的团状或丝状菌。
2）较小的革兰氏阳性菌
3）含有包含体的基因工程菌
匀浆发与珠磨法比较：
匀浆法
珠磨法
操作参数少，易确定。
操作参数多，需凭经验。
温度控制难
温度控制较容易。
破来自百度文库率较低，许多次循环 一次破碎率高
第四章 微生物细胞破碎
第一节 第二节 第三节
细胞破碎的分类 细胞壁的组成与结构 常用破碎方法 珠磨法 高压匀浆法 超声波破碎法 酶解法 化学渗透法 其它方法
第四节 破碎率的测定与破碎技术的研究方向
第一节 细胞破碎的分类
许多生物产品都存在于细胞内部（如胰岛素、干扰素）
很多基因工程产物都是胞内物质， 因此，细胞破碎是提 取这些成分的第一步，也是提取产物的关键性步骤，
高压匀浆一般需多级操作，每次循环前进行级 间冷却。提高压力有利于细胞破碎，但会增加能耗。
细胞的破碎与分离
超声破碎法
液体剪切作用
对酵母菌效果较差，破碎过程升温剧烈， 不适合大规模操作
非 酶溶法
酶分解作用
具有高度专一性，条件温和，浆液易分离，
机
溶酶价格高，通用性差
械 化学渗透法 改变细胞膜的渗透性 具一定选择性，浆液易分离，但释放率较
法
低，通用性差
渗透压法
渗透压剧烈改变 破碎率较低，常与其他方法结合使用
冻结融化法 干燥法
对酵母细胞采用酶法破碎时，先加入蛋白酶作用 蛋白质-甘露聚糖结构，使二者溶解，再加入葡 聚糖酶作用裸露的葡聚糖层，最后只剩下原生质 体，这时若缓冲液的渗透压变化，则细胞膜破裂， 释出胞内产物。
42
第四十二页，共58页。
外加酶法
优点：产品释放的选择性高；抽提的速率和
收率高；产品的破坏最少；对pH值和温度等 外界条件要求低；不残留细胞碎片。
细胞的破碎与分离
1
第一页，共58页。
生物分离过程的一般流程
原原料料液液 细细胞胞分分离离(( 离离心心，，过过滤滤))
细细胞胞－－胞胞内内产产物物 路线一
路线二 清液－胞外产物
路线一B 包含体
细胞破碎 碎碎片片分分离离
路线一A
溶解(加加盐盐酸酸胍胍、、脲脲)
粗分离(盐盐析析、、萃萃取取、、超超过过滤滤等等)
强度和聚合物网状结构。
生物工程下游技术第4章 微生物细胞破碎
第四章 微生物细胞破碎
微生物代谢产物大多分泌到细胞外， 微生物代谢产物大多分泌到细胞外，如大多数 小分子代谢物、细茵产生的碱性蛋白酶、 小分子代谢物、细茵产生的碱性蛋白酶、霉菌产生 的糖化酶等，称为胞外产物。 的糖化酶等，称为胞外产物。但有些目的产物存在 于细胞内部、如大多数酶蛋白、类脂和部分抗生素 于细胞内部、如大多数酶蛋白、 等，称为胞内产物。 称为胞内产物。 许多基因工程产品都是胞内产物。 许多基因工程产品都是胞内产物。分离提取胞 内产物时，首先必须将细胞破碎，使产物得以释放， 内产物时，首先必须将细胞破碎，使产物得以释放， 才能进一步提取。 才能进一步提取。因此细胞破碎是提取胞内产物的 关键步骤。 关键步骤。
二、酵母菌细胞壁主要化学成分：葡聚糖 ％一34％)、甘露聚 酵母菌细胞壁主要化学成分：葡聚糖(30％ ％、
和脂类； 糖(30％)、 蛋白质 ％一8％)和脂类； ％ 、 蛋白质(6％ ％ 和脂类 主要阻力—壁结构交联的紧密程度和它的厚度。 主要阻力 壁结构交联的紧密程度和它的厚度。 壁结构交联的紧密程度和它的厚度
(1)通用性差，某种试剂只能作用于某些特定类型的细胞。 通用性差，某种试剂只能作用于某些特定类型的细胞。 通用性差 (2)时间长，效率低，一般胞内物质释放率不超过 50％ 。 时间长，效率低， 时间长 ％ (3)有些化学试剂有毒性，在其后的产物提取精制过程中 有些化学试剂有毒性， 有些化学试剂有毒性 需设法分离除去。 需设法分离除去。
微生物代谢产物大多分泌到细胞外， 微生物代谢产物大多分泌到细胞外，如大多数 小分子代谢物、细茵产生的碱性蛋白酶、 小分子代谢物、细茵产生的碱性蛋白酶、霉菌产生 的糖化酶等，称为胞外产物。 的糖化酶等，称为胞外产物。但有些目的产物存在 于细胞内部、如大多数酶蛋白、类脂和部分抗生素 于细胞内部、如大多数酶蛋白、 等，称为胞内产物。 称为胞内产物。 许多基因工程产品都是胞内产物。 许多基因工程产品都是胞内产物。分离提取胞 内产物时，首先必须将细胞破碎，使产物得以释放， 内产物时，首先必须将细胞破碎，使产物得以释放， 才能进一步提取。 才能进一步提取。因此细胞破碎是提取胞内产物的 关键步骤。 关键步骤。
二、酵母菌细胞壁主要化学成分：葡聚糖 ％一34％)、甘露聚 酵母菌细胞壁主要化学成分：葡聚糖(30％ ％、
和脂类； 糖(30％)、 蛋白质 ％一8％)和脂类； ％ 、 蛋白质(6％ ％ 和脂类 主要阻力—壁结构交联的紧密程度和它的厚度。 主要阻力 壁结构交联的紧密程度和它的厚度。 壁结构交联的紧密程度和它的厚度
(1)通用性差，某种试剂只能作用于某些特定类型的细胞。 通用性差，某种试剂只能作用于某些特定类型的细胞。 通用性差 (2)时间长，效率低，一般胞内物质释放率不超过 50％ 。 时间长，效率低， 时间长 ％ (3)有些化学试剂有毒性，在其后的产物提取精制过程中 有些化学试剂有毒性， 有些化学试剂有毒性 需设法分离除去。 需设法分离除去。
第四章-细胞破碎..
碱的皂化作用使细 胞壁融解
温和 温和 适中 剧烈
昂贵 适中 便宜 便宜
血红细胞的破 坏
胆盐作用于大 肠杆菌 甲苯破碎酵母 细胞
14 14
第十四页，共67页。
表 4.0-1. 细胞机械破碎法
方法
技术
原理
效果 成本
举例
机械法 匀浆法（片型） 细胞被搅拌器劈碎 适中 适中
研磨法
细胞被研磨物磨碎 适中 便宜
➢产物抑制的存在。
22 22
第二十二页，共67页。
碱处理法和酶消化法相反，反应激烈，不具选择性，而且 较便宜。碱加入细胞悬浮液中后和细胞壁进行了多种反应， 包括使磷脂皂化。
23 23
第二十三页，共67页。
碱处理法
碱能溶解细胞壁上脂类物质或使某些组分从 细胞内渗漏出来。
成本低，反应激烈，不具选择性。
16 16
第十六页，共67页。
n 表4.1-1介绍了主要的几种化学方法，有渗透冲击法，表 面活性剂增溶法、脂溶法。首先简单的介绍一下酶消化 法和碱处理法。
17 17
第十七页，共67页。
酶消化法和碱处理法都是细胞破碎的有效方法，但 是也都有各自的缺点。
18 18
第十八页，共67页。
1 酶解（酶溶法 Enymatic lysis)
多层
多层
肽聚糖 (5-10%) 脂蛋白 脂多糖(1122%) 磷脂 蛋白质
温和 温和 适中 剧烈
昂贵 适中 便宜 便宜
血红细胞的破 坏
胆盐作用于大 肠杆菌 甲苯破碎酵母 细胞
14 14
第十四页，共67页。
表 4.0-1. 细胞机械破碎法
方法
技术
原理
效果 成本
举例
机械法 匀浆法（片型） 细胞被搅拌器劈碎 适中 适中
研磨法
细胞被研磨物磨碎 适中 便宜
➢产物抑制的存在。
22 22
第二十二页，共67页。
碱处理法和酶消化法相反，反应激烈，不具选择性，而且 较便宜。碱加入细胞悬浮液中后和细胞壁进行了多种反应， 包括使磷脂皂化。
23 23
第二十三页，共67页。
碱处理法
碱能溶解细胞壁上脂类物质或使某些组分从 细胞内渗漏出来。
成本低，反应激烈，不具选择性。
16 16
第十六页，共67页。
n 表4.1-1介绍了主要的几种化学方法，有渗透冲击法，表 面活性剂增溶法、脂溶法。首先简单的介绍一下酶消化 法和碱处理法。
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酶消化法和碱处理法都是细胞破碎的有效方法，但 是也都有各自的缺点。
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1 酶解（酶溶法 Enymatic lysis)
多层
多层
肽聚糖 (5-10%) 脂蛋白 脂多糖(1122%) 磷脂 蛋白质
第四章 细胞破碎和分离提取技术 PPT课件
撞击环 阀
3）超声波破碎（ultrasonication）
• 机理：高于20kHz的超声作用下产生的空穴化作用，空穴由于 超声波的冲击而产生和闭合，产生极大的冲击波和剪切力。
缺点： A、影响因素多，细胞种类、浓度 和处理时间、探头材料和形状； B、有效能量的利用率低； C、产热大，需控温； D、不易放大，仅应用于实验室规 模的细胞破碎。
•可采用间歇式或连续操作珠磨机 •增加装珠量、延长破碎时间、提高 转速等手段可提高破碎率 •→总能耗增加且须注意换热
•适用于多数微生物细胞，esp.有大 量菌丝体的微生物（藻类和真菌菌丝）和 质地坚硬（亚细胞器）的微生物细胞
2）高压匀浆法
（ high-pressure homogenization ）
eg.动物细胞和革兰氏阴性菌。 • 细胞于高渗介质中？脱水达到平衡后，迅速将其转置于低
渗透压的水或缓冲液中，水进入细胞使胞壁和胞膜破裂
• 2）冻结－融化法（Freezing and Thawing） • 细胞急剧冻结后在室温缓慢融化，反复操作多次使细胞破
坏，对于存在于细胞质周围靠近细胞膜的胞内产物释放较 为有效
“x”ml solution of A＋ “y”ml solution of B Involves extra work（making up two solutions） 缺点 Waste（The unused volumes of A and B are discarded） Usually inaccurate Why? The presence of extra salts may change the pH
第四章 细胞破碎技术
时间、液体的温度等 • 优点：操作简单，液量损失少。 • 缺点：易失活，噪声，大容量时声能不易传递、
不易散热。 • 常用间歇处理，冰浴冷却。多在实验室规模用。
11
超声设备
探头式
（超声细胞破碎仪）
槽式
（超声清洗仪）
12
（二）物理破碎法
反复冻融法
物理法总体不适于大规模生产， 因破碎率低、效果较差
• 将细胞在-15℃下急剧冻结、室温缓融，反复多次
剂诱导细胞自溶）。
酶法优点：条件温和、反应迅速、选择性强； 缺点：价格贵、通用性差、有时存在产物抑制、难适用于
大规模工业操作，受影响因素多
15
三、细胞破碎率的评价
细胞破碎率：被破碎细胞的数量占原始细胞 数量的百分比数。即：
Y=(N0-N)/N0×100%
• N0—原始细胞的数量 • N—经细胞破碎处理后余下的完整细胞数
•复性
最后采用透析或超滤除变性剂使蛋白质产物 的构型复原从而使蛋白质复性。
加谷胱甘肽等还原剂、氧化剂复性。
20
丙酮、氯仿、甲苯等。
优点：产物释出性好、细胞外形完整、碎片少、胞内杂质释 放少，便于后步分离 缺点：易引起目的物失活，可能给后续产物纯化带来困难， 从而影响最终纯度
14
（四）酶法破碎法
应用酶破坏细胞壁，可部分或完全破坏细胞壁，再 结合其他方法破坏细胞壁。
不易散热。 • 常用间歇处理，冰浴冷却。多在实验室规模用。
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超声设备
探头式
（超声细胞破碎仪）
槽式
（超声清洗仪）
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（二）物理破碎法
反复冻融法
物理法总体不适于大规模生产， 因破碎率低、效果较差
• 将细胞在-15℃下急剧冻结、室温缓融，反复多次
剂诱导细胞自溶）。
酶法优点：条件温和、反应迅速、选择性强； 缺点：价格贵、通用性差、有时存在产物抑制、难适用于
大规模工业操作，受影响因素多
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三、细胞破碎率的评价
细胞破碎率：被破碎细胞的数量占原始细胞 数量的百分比数。即：
Y=(N0-N)/N0×100%
• N0—原始细胞的数量 • N—经细胞破碎处理后余下的完整细胞数
•复性
最后采用透析或超滤除变性剂使蛋白质产物 的构型复原从而使蛋白质复性。
加谷胱甘肽等还原剂、氧化剂复性。
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丙酮、氯仿、甲苯等。
优点：产物释出性好、细胞外形完整、碎片少、胞内杂质释 放少，便于后步分离 缺点：易引起目的物失活，可能给后续产物纯化带来困难， 从而影响最终纯度
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（四）酶法破碎法
应用酶破坏细胞壁，可部分或完全破坏细胞壁，再 结合其他方法破坏细胞壁。
最新第4章 微生物细胞破碎 作业答案
第4章微生物细胞破碎作业答案
第4章微生物细胞破碎作业参考答案
一名词解释
细胞破碎技术：是指利用外力破坏细胞膜和细胞壁，使细胞内物质包括目的产物成分释放出来的技术。
化学渗透法：某些化学试剂，如表面活性剂、有机溶剂、金属螯合剂等可以改变细胞壁或细胞膜的通透性（渗透性），从而使胞内物质有选择地渗透出来，这种处理方式称为化学渗透法。
二填空题
1 （肽聚糖）是细菌细胞壁的主要化学成分；酵母细胞壁的主要成分是（葡聚糖）；霉菌细胞壁主要由多糖组成，其中大多数的多糖壁是由（几丁质）和葡聚糖构成的。
2 细胞破碎的目的是释放出细胞内目的产物，方法很多。按其是否使用外加作用力可分为（机械法）和（非机械法）两大类。
3 机械法主要有（珠磨法）、（高压匀浆法）、（超声破碎法）和X-press法等。在机械破碎法中，由于消耗的机械能转为热量会使温度上升，在大多数情况下要采用（冷却）措施，以防止生物产品受热破坏。
4 非机械法有（酶溶法）、（化学渗透法）、物理法和干燥法等。
5 细胞破碎率测定方法主要有（直接测定法）、（目的产物测定法）和（导电测定法）三种。
三判断题
1 细胞壁破碎的主要阻力是连接细胞壁网状结构的共价键（√）。
2 革兰氏阳性菌比革兰氏阴性菌细胞壁要薄。（ X ）
四简答题
1 细菌、酵母、霉菌细胞壁的主要成分。
答：细胞破碎的主要阻力来自于细胞壁，不同类型的微生物其细胞壁的结构特性是不同的。
1）细菌细胞壁主要化学成分：肽聚糖；主要阻力—肽聚糖的网状结构。
2）酵母菌细胞壁主要化学成分：葡聚糖(30％一34％)、甘露聚糖(30％)、蛋白质(6％一8％)和脂类；主要阻力—壁结构交联的紧密程度和它的厚度。
第四章 细胞破碎和分离技术
细胞碎片去除和产品纯化同步的方法
（一）双水相分离技术 1、双水相体系简介
1896年，荷兰微生物学家Beijerinck发现
明胶 琼脂（或可溶性淀粉）
传统的双水相体系是指高聚物双水相体系
憎水程度有所差异
2、常用双水相体系
（1）聚乙二醇(PEG)/葡聚糖；
（2）聚乙二醇(PEG)/盐相（硫酸盐或者磷酸盐）
气体
3、应用 （1）表面活性物质的分离纯化
如蛋白质，废水中的去污剂等
（2）能与表面活性物质结合的任何物质
如金属离子
如：环境领域
从工业污水如电镀废水、纺织废水中分离和回 收金属离子。
回收：废水溶液中的Cu2+ 表面活性剂：十二烷基硫酸钠（SDS） 回收率：45.5%
例：生物工程领域（泡沫分离大肠杆菌）
聚乙二醇(PEG) 无毒、无刺激性，具有良好的水溶性
3、双水相体系分离细胞碎片 优点：设备简单，容易放大 缺点：规模放大时，成本增加
目标产物 细胞或细胞碎片 用PEG1500/NaH2PO4体系从 Trichoderma koningii发酵液中分离纯化 β - 木糖苷酶，该酶主要分配在下相，下 相酶活回收率96.3%，纯化倍数33。
注意：破碎时要采取冷却措施
2、高压匀浆法
注意：团状或丝状真菌不适用
出料口
高压匀浆机 进料口
【生物课件】第四章 细胞破碎 [Chapter 4 Cell Disruption]
![【生物课件】第四章 细胞破碎 [Chapter 4 Cell Disruption]](https://img.taocdn.com/s3/m/77bb793b998fcc22bdd10d6f.png)
Moderateexpensive
Bile salts acting on E.coli
Lipid dissolution
Alkali treatment
Organic solvent
Moderate
dissolves iຫໍສະໝຸດ Baidu cell wall
Cheap
Saponification of lipids solubilizes membrane
温和 温和 适中 剧烈
昂贵 适中 便宜 便宜
血红细胞的破 坏
胆盐作用于大 肠杆菌 甲苯破碎酵母 细胞
TABLE 4.0-1. Mechanical Cell Disintegration Techniques
Method Mechanical
Technique
Homogenization (blade type)
※ 4.1 Cell Membranes 细胞膜
At this point, we pause briefly to explore the physical structure of microbial membranes and the complexity of the problems which we face. At present, knowledge of this general structure does not provide a direct guide to methods of cell rupture. In the future, it may. As a result, we feel that a synopsis has merit. In this synopsis, we emphasize Gram-negative procaryotes. 本节主要探寻细胞膜的物质结构及我们所面对的几个复杂问题。现在所 有的关于细胞膜结构的基本知识，并不能为细胞破碎方法提供基本的引 导。也许将来可以。正因如此，对此进行提纲切领的介绍很有必要。主 要强调的是革兰氏阴性原核生物。其细胞结构中没有细胞核：基因物质 位于单链DNA上。典型的生物是大肠杆菌，是生物技术研究的主体。通 过这种细胞生产了很多细胞重组的产物。
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（2）有机溶剂法
有机溶剂能溶解细胞壁的脂类，从而改变细 胞通透性。
（3）表面活性物质
能溶解膜结构中的脂蛋白，使细胞通透性增加。
化学法的优缺点 优点 细胞外形保持完整，碎片少，浆液粘度低，
易于固液分离和进一步提取。
①通用性差； 缺点 ②时间长，效率低，一般胞内物质释放率 不超过 80％。 ③有些化学试剂有毒，后续工作需设法分 离除去。
聚乙二醇(PEG) 无毒、无刺激性，具有良好的水溶性
3、双水相体系分离细胞碎片 优点：设备简单，容易放大 缺点：规模放大时，成本增加
目标产物 细胞或细胞碎片 用PEG1500/NaH2PO4体系从 Trichoderma koningii发酵液中分离纯化 β - 木糖苷酶，该酶主要分配在下相，下 相酶活回收率96.3%，纯化倍数33。
（三）化学法（化学渗透法）
1、碱处理 2、酸处理 3、化学试剂法
1、碱处理 pH值=11.5---12.5碱处理可导致细胞溶解。
优点：价格便宜，适于任何规模 的操作，易使蛋白使活。
2、酸热法
盐酸对细胞壁中的某些成分（主要是多糖和 蛋白质）的水解作用，使细胞壁结构变疏松， 同时经沸 水 浴处 理 ，细 胞 吸 水 膨 胀 破 裂 。
注意：破碎时要采取冷却措施
2、高压匀浆法
注意：团状或丝状真菌不适用
出料口
高压匀浆机 进料口
利用高压迫使悬浮液通过针形阀，由于突然减压 和高速冲撞造成细胞破裂
3、超声破碎法
原理：空化作用和搅拌作用
缺点：产生的热量不容易驱散，不适 于大规模操作，主要用于实验室。
不同机械破碎方法的比较
技术 原理
气体
3、应用 （1）表面活性物质的分离纯化
如蛋白质，废水中的去污剂等
（2）能与表面活性物质结合的任何物质
如金属离子
如：环境领域
从工业污水如电镀废水、纺织废水中分离和回 收金属离子。
回收：废水溶液中的Cu2+ 表面活性剂：十二烷基硫酸钠（SDS） 回收率：45.5%
例：生物工程领域（泡沫分离大肠杆菌）
（3）膨胀床
稳定的、返混很小的流化床，即所谓的膨胀床,它 既能比较容易地让细胞或细胞碎片通过填料层，又 能以填充床的模式来吸附目标产物。
（4）膨胀床与固定床的区别
膨胀床吸附技术
膨胀床的床层上部安装有可调节床层高度的调节 器，当料液从床底输入时，床层产生膨胀，高度 调节器上升，床层空隙增加，允许菌体细胞或细 胞碎片自由通过。因此，膨胀床吸附操作可直接 处理菌体发酵液或细胞匀浆液，回收其中的目标 产物。 节省离心或过 滤等处理过程
G+菌的细胞壁
G-菌的细胞壁
2、自溶法
通过调节温度、pH等诱导细胞产生溶解自身的酶。
45-50℃ 酵母 12-24h 自溶
（五）超临界细胞破碎技术
1、超临界流体
（1）临界温度：在温度高于某一数值时，任何大的 压力均不能使该物质由气相转化为液相，此时的温 度即被称之为临界温度； （2）临界压力：临界温度下，气体能被液化的最低 压力称为临界压力。 （3）超临界流体：指温度和压力处于临界条件之上 的流体。
2、超临界CO2的破壁原理
CO2的临界值：31.26℃；7.38MPa 超临界CO2密度近于液体，粘度近于气体，扩 散系数为液体的100倍，因而具有惊人的溶解 能力。 超临界CO2易于渗透到细胞内，突然降压后， 因细胞内外较大的压差而使细胞急剧膨胀而 破裂。
超临界细胞破碎技术适用于各类细胞的破碎
机械法和非机械法破碎的比较
比较项目 破碎机理 碎片大小 内含物释放 粘度 时间，效率 设备 通用性 经济 应用范围 机械法 切碎细胞 碎片细小 全部 高（核酸多） 时间短，效率高 需专用设备 强 成本低 工业规模，实验室 非机械法 溶解局部壁，膜 细胞碎片较大 部分 低（核酸少） 时间长，效率低 不需专用设备 差（专一性强） 成本高 实验室，部分工业
（2）常用吸附剂
物理吸附，化学吸附 和离子交换吸附
多糖包埋石英砂，玻璃微球等。 如Streamline介质：在石英砂外表面包裹了一层 琼脂糖
琼脂糖上的功能基团可以被修 饰，提高目标产物的吸附容量
4、膨胀床的操作（5个步骤）
（1）平衡：用平衡缓冲液让膨胀床达到平衡，保持 一定的膨胀率。
膨胀2倍，吸附性能最好
三、选择破碎方法的依据
1、细胞的处理量 2、细胞壁的强度和结构 3、目标产物对破碎条件的敏感性 4、破碎程度 适宜的操作条件应有高的产物释放率，低 的能耗和便于后步提取这三方面进行权衡
作业与思考题
1、简要说明常用的细胞破碎方法、原理及特点？
四、从发酵液直接分离产物
细胞破碎
目标产物
细胞碎片很小，很难用 过滤法除去。
。
成本
举例
珠磨法
固体剪切作用
便宜
适中 昂贵
大规模处理
大规模处理 小规模处理
高压匀浆法 液体剪切作用 超声波法 液体剪切作用
（二）物理法
1、渗透压冲击法 2、冷冻-融化法
1、渗透压冲击法（最温和）
将细胞放在高渗溶液中（如高浓度蔗糖溶液），由 于渗透压的作用，细胞内水来自百度文库便向外渗出，细胞发 生收缩，当达到平衡后，将细胞转入水或低渗缓冲 液中，由于渗透压的突然变化，胞外的水迅速渗入 胞内，引起细胞快速膨胀而破裂。 仅适用于细胞壁较脆弱的细胞。
纳豆激酶
1980年，日本心脑血管专家须见洋行博士， 从事溶解血栓药物研究工作
“下午两点半”实验 下午两点半：纳豆提取物加入到人工 血栓中；
下午五点半：血栓溶解2厘米
纳豆的制作
1、泡豆蒸豆
大豆，加水浸泡一夜后，蒸烂。
2、接种纳豆菌
纳豆菌用热水溶解后，加入到大豆中，搅拌均匀，分装。
3、在恒温下发酵14-36小时 4、后熟（活菌低温休眠）
缺点：破壁效果差，后续处理难除HCl。
3、化学试剂法
（1）EDTA螯合法：导致外层膜不稳定或溶解
革兰氏阳性菌
革兰氏阴性菌
革兰氏阴性菌的外层膜结构通常靠二价阳离子 Ca2+ 或 Mg2+ 结合脂多糖和蛋白质来维持，一旦 EDTA将Ca2+或Mg2+ 螯合，大量的脂多糖分子将脱 落，使细胞壁外层膜出现洞穴。这些区域由内层 膜的磷脂来填补，从而导致内层膜通透性的增强。
洋葱质壁分离
2、冷冻-融化法
（1）方法：将细胞放在低温下冷冻，然后在 室温中融化，反复多次而达到破壁作用。 （2）原理：一方面破坏细胞膜的通透性，另 一方面胞内水结晶，形成冰晶粒，细胞液浓度 增高引起细胞溶胀而破裂。
大肠杆菌：可用液氮/37℃反复冻融法破壁
适用于细胞壁较脆弱的菌体，需反复 多次，速率慢，产量低，在冻融过程 中可能引起某些蛋白质变性。
（5）膨胀床与流化床的区别
流化床的填料和液体在床层内混合程度高，吸附效 率低，而膨胀床的填充颗粒基本悬浮于固定的位置， 液体的流动与固定床相似，接近平推流，吸附效率 高。
2、膨胀床装置
调节柱床高度
色 谱 柱
保证液体以平推流形式 流过柱子
3、膨胀床吸附剂
（1）吸附剂应具备的条件 ①吸附性能好 ②沉降速率高 ③吸附剂要在粒径和密度上有差异 ④有良好孔道结构，不易被污染
通过流速控制膨胀率
（2）进料吸附
把目标产物吸附在吸附剂上，让杂质或细胞碎片等 固体颗粒流出膨胀床。
（3）洗涤
洗去留在柱内的细胞、细胞碎片和弱吸附性 的杂质。
洗涤结束后，改用固定床操作
（4）洗脱
采用固定床操作，将配制好的洗脱液用横流 泵从柱上部导入，下部流出，分段收集，并 分析检测目标产物的活性峰位置。
细胞碎片去除和产品纯化同步的方法
（一）双水相分离技术 1、双水相体系简介
1896年，荷兰微生物学家Beijerinck发现
明胶 琼脂（或可溶性淀粉）
传统的双水相体系是指高聚物双水相体系
憎水程度有所差异
2、常用双水相体系
（1）聚乙二醇(PEG)/葡聚糖；
（2）聚乙二醇(PEG)/盐相（硫酸盐或者磷酸盐）
发酵后，放在冰箱内低温熟成数小时，做好的纳 豆无论是外观还是口感都会更好。
（三）泡载分离技术
1、定义
又称泡沫分离或泡沫吸附分离，是以气泡为介 质，利用组分的表面活性差异进行分离的技术。
空气
2、原理
通过向溶液鼓泡形成泡沫层，表面活性物质 会聚集在泡沫层内，然后将泡沫层与液相主 体分离。
破沫器
泡沫 活性剂补充口 液体 泡沫液
表面活性剂：月桂酸或硬脂酰胺等
泡沫分离：1min除去90%细胞
10min除去99%细胞
思考题 1、名词解释
超临界流体 泡载分离技术
固定床
膨胀床
2、什么是固定床？流化床？膨胀床？并 简述它们之间的区别？
（二）膨胀床分离技术
1、膨胀床的定义
（1）固定床：又称填充床，填充的固体物通常呈 颗粒状，堆积成一定高度的床层。床层静止不动， 流体通过床层进行分离纯化。 （2）流化床：当流体通过床层的速度逐渐提高到 某值时，填料颗粒出现松动，颗粒间空隙增大，床 层体积出现膨胀，但是颗粒仍逗留在床层内而不被 流体带出。床层的这种状态和液体相似称为流化床
第四章 细胞破碎和分离提 取技术
发酵液或培养液 预处理 固液分离（离心或过滤）
固体沉淀：胞内产物
细胞破碎和细胞碎片分离
清液：胞外产物
目标产物
本章内容
目标产物
一、细胞破碎的主要阻力：细胞壁
细胞破碎的主要目的：破坏细胞壁和细胞膜， 使细胞内物质释放出来。
各种微生物细胞壁组成与结构
二、常用细胞破碎技术及原理
（5）柱床的再生和清洗
原因：非特异性吸附污染
试剂：0.5-1mol/L的NaOH（常用）
方法：控制流速，使柱床膨胀5倍，清洗3小时
4、膨胀床的操作（5个步骤）
（1）平衡 （2）进料吸附
（3）洗涤
（4）洗脱
（5）柱床再生和清洗
5、膨胀床的应用
纳豆激酶的分离提取
纳豆：大豆经纳豆菌发酵而成
降血压，抗癌 抗氧化，溶血栓
（四）生物法 1、酶溶法
（1）原理：利用酶溶解细胞壁，使细胞壁受到部分 或完全破坏； （2）常用的酶：溶菌酶、 β-1 ,3-葡聚糖酶、
β-1,6-葡聚糖酶、蛋白酶等。
其中溶菌酶主要用于细菌类，其他酶对酵母作用 较显著。
溶菌酶：能直接水解G+菌细胞壁，作用位 点是肽聚糖多肽链中的β-1，4糖甘键。
（一）机械法
（二）物理法
（三）化学法 （四）生物法 （五）超临界细胞破碎技术
（一）机械法
利用高压、研磨或超声波等手段使细胞受到挤 压，剪切和撞击作用 1、珠磨法 2、高压匀浆法 3、超声破碎法
1、珠磨法
珠磨法原理：细胞悬浮液与极细的玻璃小 珠、石英砂、氧化铝等研磨剂（直径小于 1mm）一起快速搅拌或研磨，研磨剂与细 胞之间的互相剪切、碰撞，使细胞破碎， 释放出内含物。