海地瓜蛋白水解物中ACE抑制肽的分离纯化及合成_赵元晖

Vol．33高等学校化学学报No．2
2012年2月CHEMICALJOURNALOFCHINESEUNIVERSITIES308～312

海地瓜蛋白水解物中ACE抑制肽的
分离纯化及合成

赵元晖1，李八方1，马敬军2，董士远1，刘尊英1，曾名湧
1
（1．中国海洋大学食品科学与工程学院，青岛266003；2．中国检验认证集团山东有限公司，青岛266071）

摘要采用SephadexG-25凝胶柱层析、SPSephadexC-25阳离子交换层析和反相高效液相色谱等方法对海
地瓜水解产物进行分离纯化，得到了一种新的强活性ACE抑制肽，其氨基酸序列为MEGAQEAQGD，IC50值
为15.9μmol/L．采用逐步缩合和片段缩合的方法对该抑制肽进行了设计合成．合成肽的纯度为
99.72%，
分子量与序列结构均与理论值相符．研究发现，抑制肽与胃蛋白酶和糜蛋白酶水解反应后，活性增强了
3.5
倍．动物实验结果表明，剂量为3μmol/kg的抑制肽对大鼠自发性高血压具有明显的降压效果
．
关键词海地瓜；ACE抑制肽；分离纯化
中图分类号O629.72文献标识码
ADOI：10．3969/j．issn．0251-0790．2012．02．017

收稿日期
：2011-02-23．
基金项目：国家自然科学基金（批准号：31000830）和山东省自然科学基金（批准号：ZR2010CQ001）资助
．
联系人简介：曾名湧，男，博士，教授，主要从事水产品高值化利用研究
．E-mail：mingyz@mail．ouc．edu．cn
赵元晖，男，博士，讲师，主要从事海洋生物活性物质研究
．E-mail：zhaoyuanhui@ouc．edu．cn

海地瓜（AcaudinamolpadioidesSemper）俗称香参，也称为海茄子，盛产于亚热带沙质海区，在日
本、菲律宾、印度尼西亚及我国山东到海南岛的海域均有分布，资源丰富．海地瓜含有丰富的氨基酸
和有益于人体的多种微量元素及维生素，这为进一步开发利用海地瓜资源提供了一定的科学依据．目
前，我国的高血压病发病率呈逐年上升趋势，已成为仅次于肿瘤的第二大疾病，不仅严重威胁人们的
生命安全，而且严重影响我国社会经济的发展．这就要求人们不仅要有高效的治疗药物，还要从预防
高血压做起
［1，2］．目前已有不少有关酶解食物蛋白制备具有ACE抑制活性肽的研究报道［3～5］
．
来自于

纯天然食物蛋白质的ACE抑制肽对正常血压无影响并且安全可靠
［6～8］
．本文利用凝胶柱层析、
阳离子

交换层析、反相高效液相色谱等纯化技术从海地瓜蛋白酶解物中分离出具有高活性的ACE抑制肽，应
用纳升电喷雾-四极杆-飞行时间串联质谱（Nano-ESI-Ms/Ms）技术，对活性肽进行结构鉴定，并采用逐
步缩合和片段缩合相结合的方法对该肽进行了设计合成．这不仅可以提高海地瓜的综合利用价值，还
可以通过对降压机理及肽结构的深入研究为提取或合成高血压治疗药物提供实验基础
．

1
实验部分

1．1
试剂与仪器

海地瓜购于青岛市天桥综合超市，冷冻制品，湿重平均每只25g，去除内脏洗净备用；雄性自发
性高血压大鼠（SHR，SPF），每只280～300g，购于上海斯莱克斯实验动物有限公司；马尿酰-组氨酰
-
亮氨酸、菠萝蛋白酶、ACE酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶和糜蛋白酶为Sigma公司产品；Alcalase2.4L酶
（丹麦诺维信公司）；SPSephadexC-25和SephadexG-25（Phamacia公司）；氨基酸Boc-Met-OH，Fmoc-
Glu（OtBu）-OH，Boc-Gly-OH，H-Ala-OBzl·ToSH，Fmoc-Gln（Trt）-OH和H-Asp（OBzl）2·ToSH，
缩合剂

DCC，EDC，HOAt和HOBt以及缚酸剂NMM均购自上海吉尔生化公司．
高效液相色谱仪（美国Agilent公司）；JNM-ECP600核磁共振谱仪（日本JEOL公司
）；Nexus670
型傅里叶变换红外/拉曼光谱仪（美国Nicolet公司）；HP5890-HP5971A色谱质谱联用仪（美国惠普公
司
）．
1．2
实验过程

1．2．1体壁蛋白的提取参照文献［9，10］方法并进行了改进．将海地瓜体壁加入蒸馏水打成碎块，
用8倍体积0.05mol/L的NaOH溶液搅拌过夜，去除NaOH溶液，残渣用蒸馏水冲洗至中性，加入蒸
馏水打浆，于45℃恒温搅拌抽提8h，离心（10000r/min，20min）分离得热水溶性蛋白溶液
．
1．2．2酶解液的制备以海地瓜蛋白（配制成浓度为0.01g/mL的溶液）为原料，
先采用菠萝蛋白酶

（45℃，pH=7.0，加酶量为海地瓜蛋白质量的1.0%）对其进行水解4h，再用Alcalase蛋白酶（55℃，
pH=7.4，加酶量为海地瓜蛋白质量的2.0%）水解2h．所得复合酶水解液经过2000分子量的膜超滤，
得到了分子量大于或小于2000的2种超滤组分
．
1．2．3ACE抑制肽活性的测定参照文献［11］方法测定ACE抑制肽的活性．
1．2．4ACE抑制肽的分离纯化将海地瓜酶解液（分子量小于2000）用SephadexG-25凝胶柱（1.6
cm×30cm）进行分离纯化．洗脱液为双蒸水，洗脱速度0.6mL/min，在220nm下收集各峰．
取活性最

高的组分用SPSephadexC-25阳离子交换柱（2.6cm×30cm）进一步分离纯化，平衡液为20mmol/L的
醋酸缓冲液（pH=4.0），用含NaCl（0～1mol/L）的醋酸缓冲液进行线性梯度洗脱，洗脱速度
0.6mL/
min，检测波长220nm．所得高活性组分用SephadexG-25凝胶柱（1.6cm×100cm）脱盐，
洗脱液为双

蒸水，洗脱速度0.6mL/min．将脱盐后的高活性样品用反相高效液相色谱C18半制备柱
（9.4mm×250
mm）纯化以体积分数为10%～30%的乙腈梯度洗脱30min，洗脱速度0.8mL/min，柱温30℃．在220
nm下收集主峰，检测活性，得到活性肽．
1．2．5ACE抑制肽结构的鉴定将纯化得到的ACE抑制肽用Q_TOF2电喷雾四极杆正交加速-
飞行

时间串联质谱（英国Micromass公司）进行测序
．
1．2．6ACE抑制肽的设计合成海地瓜ACE抑制肽（MEGAQEAQGD）
通过多步氨基酸及肽片段缩合

而成．将该十肽片段裂分为2个三肽片段QGD和QEA以及1个四肽片段MEGA，总体合成策略为
（3
+3+4）片段缩合．
将氨基酸或肽片段溶于有机溶剂体系中，冰浴降温后加入缚酸剂NMM，10min后依次加入氨基酸
或肽片段、复合缩合剂，先在冰浴下反应，再逐渐升至室温，反应过夜．加入乙酸乙酯（EtOAc）稀释反
应液，然后依次用10%柠檬酸、5%NaHCO3溶液、水及饱和食盐水洗涤，有机相经干燥减压浓缩后用
硅胶柱层析，得肽产物片段
．
将肽产物片段脱去N端或C端保护基进行下一步缩合反应，直到获得全保护十肽．全保护十肽经
Pd/C氢解脱除苄基，TFA/DCM脱除Boc和侧链保护基，再经液相纯化后得海地瓜ACE抑制肽．
1．2．7ACE对活性肽稳定性的影响将ACE抑制肽与ACE（50mU）溶解在硼酸缓冲液中，在37℃
水浴下反应3h，通过对比反应前后ACE抑制肽的活性（IC50）来判断ACE对活性肽稳定性的影响
．
1．2．8胃肠蛋白酶对活性肽稳定性的影响ACE抑制活性肽（1mg/mL）连续与胃蛋白酶（pH=2.5，
37℃，2.5h）、糜蛋白酶（pH=8.0，37℃，1h）和胰蛋白酶（pH=8.0，55℃，1h）进行反应，
通过测

定各阶段水解液ACE抑制活性来判断胃肠蛋白酶对活性肽稳定性的影响
．
1．2．9活性肽在自发性高血压大鼠体内的降压效果将大鼠随机分为给药组、阳性对照组（
卡托普

利）和阴性对照组（生理盐水）．给药组灌胃海地瓜ACE抑制活性肽（3μmol/kg），阳性对照组灌胃卡
托普利（3μmol/kg），阴性对照组灌胃生理盐水．分别在灌胃前和灌胃后的1～6h内检测每组中高血
压大鼠的收缩压
．
1．2．10统计学分析应用Statview统计处理软件进行统计分析，结果以平均值±标准偏差（Mean
values±SD）表示，采用方差分析（ANOVA）进行比较．实验设3～4个平行样．

2
结果与讨论

2．1ACE
抑制肽的分离纯化

经过超滤后，分子量小于2000的水解液显示出最强的ACE抑制活性（IC50值为0.615mg/mL）．该
水解液经SephadexG-25凝胶柱分离后，可得到5个峰［图1（A）中a～e峰］．相同蛋白浓度下峰c的抑

903
No．2赵元晖等：海地瓜蛋白水解物中ACE
抑制肽的分离纯化及合成
制率最大，收集峰c并浓缩，测得其IC50值为0.0934mg/mL．虽然5个峰已被凝胶柱完全分开，但每
个峰并不是单一物质．对峰c组分进一步采用SPSephadexC-25阳离子交换柱分离纯化，得到7个肽
峰［图1（B）］，其中第6个肽峰（Ⅵ）显示出最强的ACE抑制活性，其IC50值为0.05mg/mL．脱盐后的
峰Ⅵ采用反相高效液相色谱C18半制备柱继续纯化，得到活性肽P［图1（C）］，其IC50值为
0.0165mg/
mL．

Fig．1PurificationprofilesofACEinhibitorypeptide
（A）SephadexG-25elutionprofile；（B）SPSephadexC-25elutionprofile；（C）RP-HPLCprofileonaZorbaxC
18
semi-prepcolumn．

2．2ACE
抑制肽结构的鉴定

采用纳升电喷雾-四极杆-飞行时间串联质谱（Nano-ESI-Ms/Ms）对纯化肽P进行分析，经
MasSeq

Fig．2SequenceprofileofpurifiedfractionP
软件确认该肽的结构为
MEGAQEAQGD
（图2），精确分子量为1034.5444.经换算，
其IC50值为15.9μ
mol/L．
Cheung
等

［12］

研究了蝮蛇毒液肽及其类

似物的构效关系，认为肽C末端为酸性氨基
酸时，与ACE的亲和力最弱．事实上，在
ACE中有2个活性位点，
使其具有广泛的底

物和竞争性抑制剂
［13，14］
．一些C
末端为酸

性氨基酸的ACE抑制肽已被报道，如
IVVE［15］（IC50=315.3μmol/L），IAE
［15］
（IC50=34.7μmol/L）和MRWRD［16］（IC
50
=2.1μmol/L）．

Fig．3Massspectrumofsynthesizeddecapeptide
Theionatm/z1035.4designatedasamolecularcation（M+H）
+
Fig．4MS/MSspectrumofsynthesized

decapeptide

2．3
合成肽的分析鉴定

采用反相高效液相色谱C18分析柱测得终产物十肽的纯度为99.72%．纯化后的十肽经质谱分析
，
［M+H］
+
1035.4，同位素分子量为1036.5，计算其分子量为1034.4（图3），
序列结构为

MEGAQEAQGD（图4），均与理论值相符．

013
高等学校化学学报

Vol．33