海地瓜蛋白水解物中ACE抑制肽的分离纯化及合成_赵元晖

Vol．33

高等学校化学学报No．22012年2月CHEMICAL JOURNAL OF CHINESE UNIVERSITIES 308 312

海地瓜蛋白水解物中ACE 抑制肽的

分离纯化及合成

赵元晖1，李八方1，马敬军2，董士远1，刘尊英1，曾名湧

1（1．中国海洋大学食品科学与工程学院，青岛266003；2．中国检验认证集团山东有限公司，青岛266071）

摘要采用Sephadex G-

25凝胶柱层析、SP Sephadex C-25阳离子交换层析和反相高效液相色谱等方法对海地瓜水解产物进行分离纯化，得到了一种新的强活性ACE 抑制肽，其氨基酸序列为MEGAQEAQGD ，IC 50值为15.9μmol /L．采用逐步缩合和片段缩合的方法对该抑制肽进行了设计合成．合成肽的纯度为99.72%，分子量与序列结构均与理论值相符．研究发现，抑制肽与胃蛋白酶和糜蛋白酶水解反应后，活性增强了3.5倍．动物实验结果表明，剂量为3μmol /kg 的抑制肽对大鼠自发性高血压具有明显的降压效果．

关键词海地瓜；ACE 抑制肽；分离纯化

中图分类号

O629.72文献标识码A DOI ：10．3969/j．issn．0251-0790．2012．02．017收稿日期：2011-

02-23．基金项目：国家自然科学基金（批准号：31000830）和山东省自然科学基金（批准号：ZR2010CQ001）资助．

联系人简介：曾名湧，男，博士，教授，主要从事水产品高值化利用研究．E-

mail ：mingyz@mail．ouc．edu．cn 赵元晖，男，博士，讲师，主要从事海洋生物活性物质研究．E-

mail ：zhaoyuanhui@ouc．edu．cn 海地瓜（Acaudina molpadioides Semper ）俗称香参，也称为海茄子，盛产于亚热带沙质海区，在日本、菲律宾、印度尼西亚及我国山东到海南岛的海域均有分布，资源丰富．海地瓜含有丰富的氨基酸和有益于人体的多种微量元素及维生素，这为进一步开发利用海地瓜资源提供了一定的科学依据．目前，我国的高血压病发病率呈逐年上升趋势，已成为仅次于肿瘤的第二大疾病，不仅严重威胁人们的生命安全，而且严重影响我国社会经济的发展．这就要求人们不仅要有高效的治疗药物，还要从预防

高血压做起

［1，2］．目前已有不少有关酶解食物蛋白制备具有ACE 抑制活性肽的研究报道［3 5］．来自于纯天然食物蛋白质的ACE 抑制肽对正常血压无影响并且安全可靠

［6 8］．本文利用凝胶柱层析、阳离子交换层析、反相高效液相色谱等纯化技术从海地瓜蛋白酶解物中分离出具有高活性的ACE 抑制肽，应

用纳升电喷雾-四极杆-飞行时间串联质谱（Nano-

ESI-Ms /Ms ）技术，对活性肽进行结构鉴定，并采用逐步缩合和片段缩合相结合的方法对该肽进行了设计合成．这不仅可以提高海地瓜的综合利用价值，还可以通过对降压机理及肽结构的深入研究为提取或合成高血压治疗药物提供实验基础．

1

实验部分1．1试剂与仪器

海地瓜购于青岛市天桥综合超市，冷冻制品，湿重平均每只25g ，去除内脏洗净备用；雄性自发性高血压大鼠（SHR ，SPF ），每只280 300g ，购于上海斯莱克斯实验动物有限公司；马尿酰-组氨酰-亮氨酸、菠萝蛋白酶、ACE 酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶和糜蛋白酶为Sigma 公司产品；Alcalase 2.4L 酶（丹麦诺维信公司）；SP Sephadex C-25和Sephadex G-25（Phamacia 公司）；氨基酸Boc-Met-OH ，Fmoc-Glu （OtBu ）-OH ，Boc-Gly-OH ，H-Ala-OBzl ·ToSH ，Fmoc-Gln （Trt ）-OH 和H-Asp （OBzl ）2·ToSH ，缩合剂DCC ，EDC ，HOAt 和HOBt 以及缚酸剂NMM 均购自上海吉尔生化公司．

高效液相色谱仪（美国Agilent 公司）；JNM-

ECP 600核磁共振谱仪（日本JEOL 公司）；Nexus 670型傅里叶变换红外/拉曼光谱仪（美国Nicolet 公司）；HP5890-

HP5971A 色谱质谱联用仪（美国惠普公司）．

1．2

实验过程1．2．1体壁蛋白的提取参照文献［9，10］方法并进行了改进．将海地瓜体壁加入蒸馏水打成碎块，用8倍体积0.05mol /L 的NaOH 溶液搅拌过夜，去除NaOH 溶液，残渣用蒸馏水冲洗至中性，加入蒸

馏水打浆，于45ħ恒温搅拌抽提8h ，离心（10000r /min ，

20min ）分离得热水溶性蛋白溶液．1．2．2

酶解液的制备以海地瓜蛋白（配制成浓度为0.01g /mL 的溶液）为原料，先采用菠萝蛋白酶（45ħ，pH =7.0，加酶量为海地瓜蛋白质量的1.0%）对其进行水解4h ，再用Alcalase 蛋白酶（55ħ，pH =7.4，加酶量为海地瓜蛋白质量的2.0%）水解2h．所得复合酶水解液经过2000分子量的膜超滤，得到了分子量大于或小于2000的2种超滤组分．1．2．3ACE 抑制肽活性的测定

参照文献［11］方法测定ACE 抑制肽的活性．

1．2．4ACE 抑制肽的分离纯化将海地瓜酶解液（分子量小于2000）用Sephadex G-25凝胶柱（1.6cm ˑ30cm ）进行分离纯化．洗脱液为双蒸水，洗脱速度0.6mL /min ，在220nm 下收集各峰．取活性最

高的组分用SP Sephadex C-25阳离子交换柱（2.6cm ˑ30cm ）进一步分离纯化，平衡液为20mmol /L 的

醋酸缓冲液（pH =4.0），用含NaCl （0 1mol /L ）的醋酸缓冲液进行线性梯度洗脱，洗脱速度0.6mL /min ，检测波长220nm．所得高活性组分用Sephadex G-25凝胶柱（1.6cm ˑ100cm ）脱盐，洗脱液为双蒸水，洗脱速度0.6mL /min．将脱盐后的高活性样品用反相高效液相色谱C 18半制备柱（9.4mm ˑ250mm ）纯化以体积分数为10% 30%的乙腈梯度洗脱30min ，洗脱速度0.8mL /min ，柱温30ħ．在220nm 下收集主峰，检测活性，得到活性肽．

1．2．5

ACE 抑制肽结构的鉴定将纯化得到的ACE 抑制肽用Q_TOF2电喷雾四极杆正交加速-飞行时间串联质谱（英国Micromass 公司）进行测序．1．2．6ACE 抑制肽的设计合成海地瓜ACE 抑制肽（MEGAQEAQGD ）通过多步氨基酸及肽片段缩合而成．将该十肽片段裂分为2个三肽片段QGD 和QEA 以及1个四肽片段MEGA ，总体合成策略为（3+3+4）片段缩合．

将氨基酸或肽片段溶于有机溶剂体系中，冰浴降温后加入缚酸剂NMM ，

10min 后依次加入氨基酸或肽片段、复合缩合剂，先在冰浴下反应，再逐渐升至室温，反应过夜．加入乙酸乙酯（EtOAc ）稀释反

应液，然后依次用10%柠檬酸、

5%NaHCO 3溶液、水及饱和食盐水洗涤，有机相经干燥减压浓缩后用硅胶柱层析，得肽产物片段．

将肽产物片段脱去N 端或C 端保护基进行下一步缩合反应，直到获得全保护十肽．全保护十肽经Pd /C 氢解脱除苄基，TFA /DCM 脱除Boc 和侧链保护基，再经液相纯化后得海地瓜ACE 抑制肽．

1．2．7

ACE 对活性肽稳定性的影响将ACE 抑制肽与ACE （50mU ）溶解在硼酸缓冲液中，在37ħ水浴下反应3h ，通过对比反应前后ACE 抑制肽的活性（IC 50）来判断ACE 对活性肽稳定性的影响．1．2．8胃肠蛋白酶对活性肽稳定性的影响ACE 抑制活性肽（1mg /mL ）连续与胃蛋白酶（pH =2.5，37ħ，2.5h ）、糜蛋白酶（pH =8.0，37ħ，1h ）和胰蛋白酶（pH =8.0，55ħ，1h ）进行反应，通过测定各阶段水解液ACE 抑制活性来判断胃肠蛋白酶对活性肽稳定性的影响．

1．2．9活性肽在自发性高血压大鼠体内的降压效果将大鼠随机分为给药组、阳性对照组（卡托普利）和阴性对照组（生理盐水）．给药组灌胃海地瓜ACE 抑制活性肽（3μmol /kg ），阳性对照组灌胃卡托普利（3μmol /kg ），阴性对照组灌胃生理盐水．分别在灌胃前和灌胃后的1 6h 内检测每组中高血压大鼠的收缩压．

1．2．10统计学分析应用Statview 统计处理软件进行统计分析，结果以平均值ʃ标准偏差（Mean values ʃSD ）表示，采用方差分析（ANOVA ）进行比较．实验设3 4个平行样．

2

结果与讨论2．1ACE 抑制肽的分离纯化

经过超滤后，分子量小于2000的水解液显示出最强的ACE 抑制活性（IC 50值为0.615mg /mL ）．该

水解液经Sephadex G-25凝胶柱分离后，可得到5个峰［图1（A ）中a e 峰］

．相同蛋白浓度下峰c 的抑9

03No．2赵元晖等：海地瓜蛋白水解物中ACE 抑制肽的分离纯化及合成