第五章 工业微生物诱变育种诱变剂..
第五章引变育种及其他育种途径
太阳能育种
▪ 近年来研究的新课题。用聚焦阳光间歇地照射植物的种子、 幼苗、花粉、芽、或块茎等，可以促进植物生长发育，提 高产量，同时可诱发变异。有的国家称太阳能育种为“植 物光能学”。目前，以获得小麦、玉米、大豆、番茄等新 类型。照射过的黄瓜种子总产量可提高14%，早期产量可 提高17-20%，照射番茄种子获得的新品种产量比亲本高 30-50%，而且果实的质量好。
生命的基础和核心
非生命的基础和核心
辐 射 育 种
辐射育种成就
辐射育种发展很快，我国在粮食、油料、棉花、园 艺等多种作物上和家蚕、微生物等上育成100多个新品 种，并大面积推广应用。国际上也育成很多一流的品 种。辐射育种成为近代育种的重要手段。
你相信一株西红柿一次能结13000粒果吗？ 你见过能同时长3000多条黄瓜的黄瓜树吗？
➢ 生物学作用阶段 正常生物体内的平衡状态被打破，引起异常物质产 生，代谢环节失调，引起链锁反应，特别是当这种反应影响到细胞核 中染色体及核酸分子结构时，便可诱发可遗传的突变。
大量已研究表明：辐射诱发突变，既有纯粹机械力量（直接作用）， 也有复杂的化学过程（间接作用），两者的共同作用引起突变的产生。
辐射育种材料的选择
诱发“定向突变”困难，故要认真选择材料，选材原则：
▪ 根据育种目标选择亲本材料 亲本材料必须综合性状优良 而仅1-2个需要改进的缺点的品种、高世代品系作为诱变 材料，也可用F1代或杂种后代。选择材料避免单一化，可 用不同类型和品种
▪ 适当选用单倍体原生质体等作诱变材料 便于识别、选择 突变和突变选出后的固定及纯化。但辐射剂量要降低，且 需要对诱变材料提供好的营养和环境条件。
➢ 其他独特用途 如促进孤雌生殖；诱发染色体结构变异创造 不育性或无籽果实；诱发体细胞突变，创造果树及无性繁殖 植物的新品种等。
微生物育种ppt课件
出发菌株的纯化
纯种分离方法，常用划线分离法和稀释平板法。
在诱变育种中，出发菌株的纯化虽然是辅助手段，但 它是不可缺少的技术步骤，例如前面的例子中，灰黄 霉素变种B-53，经自然分离，获得的变株C-04的产 量比前者显著提高。 ▲
组织松,生长速度快
C-2 UV
C-3 NM C-4 X射线 C-7 UV+Lф C-8 UV C-15 NTG C-17 EMS C-19 NS C-20 EMS
213
548 829 1120 1610 2630 3028 3223 4000 8-11.5 7-8 6-8 4-5 4.5-5.2 8-9 8-9 乳白 柠檬黄 柠檬黄 柠檬黄 鹅黄 (边缘柠檬黄) 乳黄 粉玉色
一代诱变约需2～3个月
突变的机制
碱基置换（转换 颠换）
点突变 移码突位、倒位 突 变
自发突变
第一节 诱变育种
诱变育种：是以人工手段诱发微生物基因突变，改变其遗传 结构和功能，从中筛选出产量高、性状优良的突变株， 并 设计出适合该突变株最佳的培养基和条件，使其在最适的工 艺条件下最有效地合成产物。
当的知识和全面的了解。
2.
诱变育种工作量大，周期长，对一般周期为7～
10天的抗生素菌种来说，一代诱变需2～3月，因此 事先需作好充分准备，如全面了解菌种培养特征 和生化特征，以及有关培养条件对其影响等，最 后再进行严密设计，确定正确的选育程序和方法。
诱变育种的步骤 •出发菌株的选择与纯化 •单孢子（单细胞）悬液的制备 •诱变剂及诱变剂量的选择 •诱变处理方法 •高产菌株的分离
4、能诱变产生遗传性变异 5、产量高、收得率高
高产突变是一种数量遗传，是由多基因决定的，产量的提 高，需要通过多代诱发突变逐渐积累 诱变是不定向的，会产生各种突变体，从中筛选出复合要 求的菌种是诱变育种中一项重要而艰苦的工作
第五章 工业微生物诱变育种
株时，应选择多种遗传类型的菌株作为出发菌株比较
稳妥，容易在较短时期内达到育种目的。
8. 菌种代谢特点
了解菌种代谢特点有助于选择有效的出发菌株。 有人曾研究过肌苷酸产生菌的代谢特性，发现肌苷 酸的生物合成过程与肌苷、肌苷酸及核苷酸、磷酸 化酶的活性有关，如果从产生肌苷酸野生型的枯草 杆菌中筛选到降解酶活性低而磷酸化酶活性强的作 为诱变出发菌株，一般都能得到良好的诱变效果。
6. 药品和原材料质量
药品规格和原材料来源不同，都会影响菌种的质量。
四、了解菌种有效产物中的 各种组分在代谢 合成过程中与培养条件的关系
由棘孢小单孢菌(Micromonospora echinopora) 产生的庆大霉素，其中C1是有效的组分； C2是无效
的。在发酵过程中加入适量的磷或蛋白胨以及加大 通 风量都有利于C1的合成；反之，C2的比例就上升。
菌悬液由出发菌株的孢子或菌体细胞与生理盐水或 缓冲液制备而成。对菌悬液的制备有如下的要求：
1、供试菌株的孢子或菌体要年轻、健壮。
细胞要新培养的，细胞生理活性方面既要同步， 又要处在最旺盛的对数期，这样突变率高，重现性也 好。 霉菌孢子浓度约为：106ml-1，放线菌孢子浓度约 为：106~107ml-1。菌悬液通常采用生理盐水制备。如 果用化学诱变剂处理时，应采用相应的缓冲液配制， 以防处理过程中pH变化而影响诱变效果。
1. 对一般出发菌株的要求
（1）从自然界样品中分离筛选出来的野生菌株，虽 然产量较低，但对诱变因素敏感，变异幅度大，
正突变率高；
（2）在生产中使用的，具有一定生产能力，并且在 生产过程经过自然选育的菌株； （3）采用具有有利性状的菌株，如生长速度快、营 养要求低以及产生孢子早而多的菌株；
微生物诱变育种的基本过程
微生物诱变育种的基本过程
一、筛选目的菌株
在开始微生物诱变育种之前，首先要确定育种的目标，并从中筛选出具有潜在优良性状的目的菌株。
这一步通常需要利用各种生理生化实验和分子生物学技术，对大量菌株进行初步的筛选和鉴定。
二、诱变处理
在确定了目的菌株之后，接下来需要进行诱变处理。
诱变处理通常包括化学诱变和物理诱变两种方式。
化学诱变使用化学诱变剂处理菌株，而物理诱变则利用物理因素（如紫外线、X射线、中子等）处理菌株。
这些诱变因素可以引起菌株基因的突变，进而产生新的性状。
三、突变体的筛选
经过诱变处理后，大量菌株中会存在各种突变体。
为了获得具有优良性状的目标突变体，需要进行筛选。
这一步通常采用各种筛选方法，如单菌落挑取法、稀释涂布平板法等，将突变体从大量菌株中分离出来。
同时，需要通过各种生理生化实验和分子生物学技术，对突变体的性状进行鉴定和筛选。
四、遗传稳定性检测
在筛选出目标突变体后，需要对其遗传稳定性进行检测。
遗传稳定性是指突变体在繁殖过程中，是否能够保持其优良性状的稳定性。
这一步通常采用连续繁殖法和稳定性测定法等方法进行检测，以保证突变体的优良性状能够在后代中得到保留。
五、生产能力测定
最后一步是测定突变体的生产能力。
生产能力是指突变体在实际生产过程中，能否产生足够的产物并保持稳定的产量。
这一步通常采用发酵实验和产物分离纯化等方法进行测定，以保证突变体在实际生产中具有实用价值。
诱变育种方法在微生物育种中的应用概述
诱变育种方法在微生物育种中的应用概述摘要：在现代发酵工业中，诱变技术（无论是物理还是化学诱变）对于促进微生物发酵从而提高利用反应底物的能力和高产率仍然起着至关重要的作用。
本文主要从工业生产中对于微生物的诱变育种的方法（物理、化学诱变育种等）进行了综述，以及通过几种常见的诱变方式来介绍在微生物育种方面的相关研究进展。
关键词：微生物；诱变育种；物理诱变；化学诱变一、前言现代发酵工程技术的最终产物，一般都是由微生物生产得到的，且通过微生物的发酵生产所取得的效益已经得到了全世界的瞩目和认可。
对工业微生物菌种的优化选育是提高产量和质量的一条有效途径。
以突变和筛选为中心的传统育种技术在工业微生物发展到现在规模的过程中始终起着重要作用。
70年代以来，重组DNA技术和原生质体融合技术开始用于菌种选育。
各种外源基因在原核生物、真核细胞的克隆和表达研究取得了重大成果，使工业微生物育种技术进入了真正意义的分子水平育种时代[1]。
常规的诱变育种方法主要为物理诱变和化学诱变两种。
微生物的诱变育种，是以人工诱变手段诱发微生物基因突变，改变遗传结构和功能，通过筛选出产量高、性状优良的突变株，并找出这个突变株最佳培养基和培养条件，使其在最适条件下合成有效产物。
以人工诱发突变为基础的微生物诱变育种，具有速度快、收效大和方法简单等优点，是菌种选育的一个重要途径，在发酵工业菌种选育上具有卓越的成就，迄今为止，国内外发酵工业中所使用的生产菌种绝大部分是人工诱变选育出来的[2]。
理想的工业化菌种必须具备遗传性状稳定、纯净无污染、能产生许多繁殖单位、生长迅速、能于短时间内生产所要的产物、可以长期保存、能经诱变产生变异和遗传、生产能力具有再现性、具有高产量和高收率等特性。
而从自然界分离的野生菌种，不论是在产量上还是在质量上，均难适合工业化生产的要求。
但诱变筛选方法相对简便，是菌种选育的基本、常规和经典方法。
特别是对遗传背景不很清楚的对象，诱变育种更是必不可少。
第五章微生物的遗传变异与菌种选育复习题知识讲解
第五章微⽣物的遗传变异与菌种选育复习题知识讲解第五章微⽣物的遗传变异与菌种选育复习题⼀、名词解释1.遗传型（genotype）遗传型⼜称基因型，是指某⼀⽣物个体所含有的全部遗传因⼦（基因组）所携带的遗传信息。
它是⼀种内在的可能性或潜⼒，只有在适当的环境条件下，通过⾃⾝的代谢和发育，才可将遗传型转化成现实的表型。
2.表型（phenotype）表型是某⼀⽣物体所具有的⼀切外表特征和内在特性的总和。
它是遗传型在⼀定环境下通过⽣长和发育后得体现，故是⼀种现实性（具体性状）。
3.变异（variation）变异是⽣物体在某外因或内因的作⽤下所引起的遗传物质结构或数量的改变，亦即遗传型的改变，其特点是群体中，以极低的概率出现（约10-9-10-5），性状变化幅度⼤，且变化后的新性状是稳定的、可遗传的。
4.饰变（modification）饰变是⼀种不涉及遗传物质结构或数量变化，只发⽣在转录、转译⽔平上的表型变化。
其特点是整个群体中⼏乎每⼀个体都发⽣同样的变化；性状变化的幅度⼩；饰变后的性状是不遗传的。
5.基因（gene）基因是⽣物体内的最⼩遗传功能单位，其本质是⼀段核苷酸序列，它能编码多肽链（通过mRNA）、tRNA或Rrna.6.操纵⼦（operon）操纵⼦是原核⽣物特有的基因形式，由三种功能上密切相关的基因组成，包括结构基因、操纵基因和启动基因。
7.结构基因（structure gene）结构基因是决定某⼀多肽链⼀级结构的DNA模板，它通过转录和转译机制可指导多肽链的合成8.遗传密码（genetic code）DNA链上决定各具体氨基酸的特定核苷酸序列称为遗传密码，其信息单位是密码⼦（核苷酸三联体）9.质粒（plasmid）直⽴式⼀类游离于核基因组外，具有独⽴复制能⼒的⼩型共价闭合环状dsDNA分⼦（cccDNA）。
10．F质粒（F plasmid）F质粒⼜称F因⼦或致育因⼦。
是⼤肠杆菌等细菌决定其性别并有转移能⼒的质粒。
微生物的诱变育种
（五）突变株的筛选
1. 初筛（以量为主） 初筛（以量为主） 方法需简便、快速
2步 步
初筛 复筛
（1）利用形态变异：需预先测定形态与产量的相关性 利用形态变异： （2）根据平板颜色反应直接挑选 透明圈法（蛋白酶、脂肪酶、纤维素酶）； 透明圈法（蛋白酶、脂肪酶、纤维素酶）； 抑菌圈法（抗生素）； 抑菌圈法（抗生素）； 变色圈法（柠檬酸）、显色圈（氨基酸）； ）、显色圈 变色圈法（柠檬酸）、显色圈（氨基酸）； 沉淀圈法（外毒素） 沉淀圈法（外毒素） 透明圈直径（ 透明圈直径（H）/菌落直径（C）：产量高低（初筛指标） 菌落直径（ ）：产量高低（初筛指标） 产量高低 2. 复筛（以质为主，定量测定） 摇瓶培养，直接检测所需产物 复筛（以质为主，定量测定） 摇瓶培养，
诱变育种的基本原则： 诱变育种的基本原则：
选择简便有效的诱变剂； 选择简便有效的诱变剂； 挑选优良的出发菌株； 挑选优良的出发菌株； 处理单细胞或单孢子悬液； 处理单细胞或单孢子悬液； 选用最适的诱变剂量； 选用最适的诱变剂量； 充分利用复合处理的协同效应； 充分利用复合处理的协同效应； 利用和创造形态、生理与产量间的相关指标； 利用和创造形态、生理与产量间的相关指标； 设计高效筛选方案； 设计高效筛选方案； 创造新型筛选方法。 创造新型筛选方法。
（2）筛选步骤（5步） ）筛选步骤（ 步
诱变处理 中间培养 淘汰野生型 检出缺陷型 鉴定缺陷型
①中间培养 ②淘汰野生型
CM或SM培养基，培养过夜 克服表型延迟 克服表型延迟。 CM或SM培养基，培养过夜。克服表型延迟。 培养基 即浓缩缺陷型， 即浓缩缺陷型，以提高检出率
抗生素法（ 细菌：青霉素；酵母菌和霉菌：制霉菌素） 方法 抗生素法（G+细菌：青霉素；酵母菌和霉菌：制霉菌素） 菌丝过滤法（丝状真菌、放线菌） 菌丝过滤法（丝状真菌、放线菌） 饥饿培养（ 饥饿培养（无N）MM 6~12 h 12 2N培养(2N)MM 2N培养(2N)MM 培养(2 1~2 h 2 加抗生素(或菌丝过滤) 加抗生素(或菌丝过滤)，培养过夜
诱变育种相关知识点总结
诱变育种相关知识点总结1. 什么是诱变育种诱变育种是通过化学物质或辐射来诱发植物遗传变异，达到变异性状的目的，然后再通过选择和育种方法来固定和优化这些性状，从而获得具有新性状的植物种质资源。
诱变育种是一种以人为手段来诱发植物遗传变异的育种方法，与传统的育种方法相比，具有变异程度大、种质资源丰富、育种速度快等优点。
2. 诱变种类根据诱变的方法和途径不同，可以将诱变分为两种类型：化学诱变和辐射诱变。
化学诱变是利用化学物质来诱发植物遗传变异的方法。
这种方法主要是通过化学物质对植物体内生成物质代谢和遗传物质的变异，从而诱发植物的新性状。
具体的化学诱变剂包括EMS（乙基甲磺酸甲酯）、DEPC（二乙醇二氯甲烷）、MNU（N- 亚硝基-N-甲基脲）、DMC（二甲胺）等。
辐射诱变是利用辐射来诱发植物遗传变异的方法。
这种方法主要是通过辐射对植物细胞的核酸、酶系、蛋白质等生物大分子的损伤和变异，从而诱发植物的新性状。
具体的辐射诱变包括X射线、γ射线、紫外线、中子射线等。
3. 诱变方法诱变育种的主要方法包括传统育种方法、分子育种方法和生物技术育种方法。
传统育种方法是指通过遗传资源的收集、鉴定以及杂交和选育等方式来获得植物品种的育种方法。
这种方法主要是通过选择和育种的方式来固定和优化诱变得到的新性状，最终获得具有新性状的植物品种。
分子育种方法是指通过对植物基因组的解析和改良等方式来获得植物品种的育种方法。
这种方法主要是通过对植物基因组的修改和介入来获得具有新性状的植物品种。
生物技术育种方法是指通过生物技术手段来获得植物品种的育种方法。
这种方法主要是通过生物技术手段来获得具有新性状的植物品种。
4. 诱变机理诱变发生的机理主要包括两个方面：一是遗传物质的突变，二是染色体的不稳定性。
（1）遗传物质的突变：遗传物质的突变是指植物遗传物质DNA序列的变化。
这种变化可以通过点突变、基因缺失、重复序列、整个染色体的遗传变异等多种方式来实现，从而使植物出现新的性状。
第五章工业微生物育种诱变剂
突变的次要位点：鸟嘌呤的N3，腺嘌呤的N2、 腺嘌呤的N7、胞嘧啶N3
（二）烷化剂的性质
① 溶液烷化剂的性质比较活泼，不太稳定，在水溶 液中容易发生分解。
② 大部分半衰期很短，其长短与温度、溶液pH关系 很大。因此，化学诱变剂要现用现配还要避光。 配制烷化剂时，要采用合适的出缓冲液。
（6）稀释涂皿，后培养结束后，从中取一定量培养物，作不同稀释度，涂皿，并
且以未经紫外线照射过的菌悬液作对照，培养后，挑取菌落，以待筛选。
四、电离辐射
伦 琴 和
射 线
X
四川成都放60CO运输
河南杞县“杞人忧钴”
2. 电离辐射剂量
快中子：拉德（rad）；伦琴（R）
致死率达到50％～85％比较合适，诱变剂量大约在15～
1. UPF值是紫外线对未防护的皮肤的平均辐射量的比 值，UPF值越大，表明防紫外线性能越好。
2. 只有当UPF＞30时，并且UVA的透过率小于5％时，才 能称为防紫外线产品，防护等级标识为UPF30＋；
3. 而当UPF＞50时，则表明该产品的紫外线防护性能极 佳，防护等级标识为UPF50＋。
UPF范围 15－24 25－39
处理完毕后继续冰浴可降低或抑制修复酶的活性。
宇宙射线
五、近年来发展的新型诱变剂
1. 微波 微波对微生物的诱变效应有2个方面的因素，即
热效应和非热效应。 ① 热效应是指物料吸收微波能量，使温度升高从而 达到灭菌的效果； ② 非热效应则是在电磁波的作用下，生物体内不产 生明显的升温，却可以产生强烈的生物效应。
2-氨基嘌呤（AP）可以和胸腺嘧啶互配，但出 现亚氨基状态时，和胞嘧啶配对。
诱变育种概述
工业上遇到的霉菌大多数不产生有性孢子，没有典型的有性过程。
细胞杂交得到的分生孢子还是无性孢子，形态上无特殊变化。
准性循环（体细胞杂交）的三个连续过程
准性生殖：
霉菌杂交：指通过体细胞的核融合和遗传因子的重组， 即通过准性过程而不是通过性细胞的融合。
工业上遇到的霉菌大多数不产生有性孢子，没有典型的有性过程。
四、原生质体融合技术
原生质体：有时指去了壁的细胞，是生 活细胞内全部具有生命的物质的总称， 由原生质所构成。原生质体一般由细 胞膜、细胞质和细胞核三部分组成， 是细胞内各类代谢活动的主要场所。
四、原生质体融合技术
定义：将遗传性状不同的两种菌(包括种间、种内及属间)融合 为一个新细胞的技术。即实现遗传重组。
↓ ——观察单菌落形态并统计其形态变异率 挑取单菌落传种斜面
摇瓶初筛 ↓ ——对照组 挑出高产斜面 ↓ 菌种保藏（砂土管、冻干管或制备固体孢子） ↓ 传种斜面（或直接用固体孢子） 摇瓶复筛（复筛次数及摇瓶数以及培养基种类根据情况决定） ↓ ——对照组 挑出高产菌株 作稳定性试验和菌种特性考察 ↓ 放大试验罐、中试考察 ↓ 大型投产试验
菌悬液的细胞浓度一般控制为： 真菌孢子或酵母细胞106107个/ml，放线菌或细菌108个/ml。 菌悬液一般用生理盐水（0.85%NaCl）稀释。
诱变处理
诱变剂及诱变剂量选择
在诱变处理前，一般应预先做诱变剂用量对菌体死亡数量的致死曲 线，选择合适的处理剂量。
不同微生物，使用的剂量不同；诱变率随诱变剂剂量的增加而提高 。但达到一定剂量后，再加大剂量反而会使突变率下降。
乙基磺酸乙酯（EMS）、亚硝基胍、 亚硝酸、氮芥等。
生物诱变剂
噬菌体、转座因子
诱变育种
工业微生物育种全解
⼯业微⽣物育种全解1.⼯业微⽣物育种在发酵⼯业中的作⽤如何？其⽬的是什么？⼯业微⽣物育种建⽴在：（1）遗传和变异（微⽣物遗传学）的基础之上；（2）物理和化学诱变剂的发现和应⽤；（3）⼯业⾃动化（⾃动仪表装置和微机）。
⼯业微⽣物育种在发酵⼯业中占有重要地位，是决定该发酵产品能否具有⼯业化价值及发酵过程成败与否的关键。
2.⼯业微⽣物发展经历了哪⼏个阶段？1)⾃然选育阶段2)⼈⼯诱变选育阶段3)杂交育种阶段4)代谢控制育种阶段5)基因⼯程育种阶段3.⼯业微⽣物育种的核⼼指标有哪些？1)在遗传上必须是稳定的。
稳定性。
2)易于产⽣许多营养细胞、孢⼦或其它繁殖体。
3)必须是纯种，不应带有其他杂菌及噬菌体。
4)种⼦的⽣长必须旺盛、迅速。
5)产⽣所需要的产物时间短。
转化率。
6)⽐较容易分离提纯。
7)有⾃⾝保护机制，抵抗杂菌污染能⼒强。
8)能保持较长的良好经济性能。
产率。
9)菌株对诱变剂处理较敏感，从⽽可能选育出⾼产菌株。
10）在规定的时间内，菌株必须产⽣预期数量的⽬的产物，并保持相对地稳定。
4.⾰兰⽒阳性和阴性菌的细胞壁结构有何差异？它们对溶菌酶和青霉素的敏感有何不同？5.缺壁细菌有哪些类型和异同？制备缺壁细菌主要有哪些途径？原⽣质体：G+菌经溶菌酶或青霉素处理；球状体：G-菌，残留部分细胞壁。
是研究遗传规律和进⾏原⽣质体育种的良好实验材料。
L型细菌：⾃发突变形成细胞壁缺陷菌株；6.原⽣质体制备时，为什么不同微⽣物要选择不同的酶？举例说明。
酶在原⽣质体制备中主要⽤来酶解细胞壁的，不同的微⽣物其细胞壁成分及含量可能不同，所以要⽤不同的酶。
酵母菌的细胞壁主要成分有葡聚糖、⽢露聚糖蛋⽩质、⼏丁质。
霉菌的细胞壁：主要成分是纤维素、⼏丁质、葡聚糖等。
藻类的细胞壁：主要成分有纤维素构成结构⾻架。
7.基因组、基因、密码⼦、简并、同义密码⼦的概念是什么？⼀、基因组1. 原核⽣物就是它的整个染⾊体，原核⽣物的基因组较⼩，DNA的含量低，如E.coli的DNA分⼦质量为2.4×109Da，相当于4.2×106bp，含有3000-4000个基因，SV40病毒仅5个基因。
现代工业微生物育种
现代工业微生物育种一、诱变育种诱变育种是通过使用物理或化学方法，如紫外线、X射线、化学诱变剂等，诱导微生物发生基因突变，从而产生具有新性状的菌株。
这种方法可以大幅度提高微生物的变异频率，为育种工作提供了丰富的材料。
二、基因工程育种基因工程育种是通过人工构建基因表达载体，将其导入到微生物中，从而实现基因的转移和表达。
这种方法可以定向地改造微生物的遗传物质，使其表达出所需的性状。
基因工程育种具有高度定向性和可预测性，是现代工业微生物育种的重要手段之一。
三、代谢工程育种代谢工程育种是通过改变微生物的代谢途径，提高其代谢产物的产量或改变代谢产物的性质，从而获得所需的菌株。
这种方法需要对微生物的代谢过程有深入的了解，并能够精确地调控其代谢网络。
代谢工程育种在现代工业微生物育种中具有重要的应用价值。
四、组合生物合成育种组合生物合成育种是通过构建多个基因的组合文库，并筛选出具有所需性状的菌株。
这种方法类似于基因工程育种，但具有更高的遗传复杂性，可以创造出更丰富的变异类型。
组合生物合成育种在现代工业微生物育种中已经成为一种重要的策略。
五、定向进化育种定向进化育种是一种模拟自然进化过程的育种方法。
它通过对大量随机突变体进行筛选和选择，以实现所需性状的定向进化和优化。
定向进化育种可以在短时间内获得高度适应特定条件的优良菌株，具有很高的应用价值。
六、菌种保藏与复壮菌种保藏与复壮是工业微生物育种的重要环节。
通过科学的保藏方法，可以保持菌种的活力和遗传稳定性；而复壮则是通过一定的手段使保藏的菌种恢复活力，以保证其用于生产的性能。
七、基因组编辑育种基因组编辑育种是利用基因编辑技术对微生物基因组进行精确的编辑和改造，以实现定向改良和创造新品种的目的。
目前常用的基因组编辑技术包括CRISPR-Cas9系统、ZFNs和TALENs等。
基因组编辑育种具有高度精确性和可控性，为现代工业微生物育种提供了强有力的工具。
工业微生物育种学5
介绍几种烷化剂 及其诱变处理方法
Ⅰ亚硝基胍
亚硝基胍的结构式
亚硝基胍的性质
亚硝基胍是1-甲基-3-硝基-1-亚硝基胍的简称， 简写成NTG、NG或MNNG。
亚硝基胍为黄色结晶状物质，性质稳定，遇光易 分解，放出NO，颜色由黄变绿，诱变效应降低。 NTG不溶于水，须加助溶剂（甲酰胺或丙酮）
碱基类似物诱变的具体机制
正常的碱基存在着同分异构体，碱基类似物也 一样有同分异构现象，它是由电子结构改变引 起的。在嘧啶分子中异构现象以酮式和烯醇式 两种形式存在，在嘌呤分子中异构现象以氨基 和亚氨基两种形式存在。 一般互变异构现象在碱基类似物中比正常DNA 四种碱基中出现的频率高。而不同的异构体对 应的互补碱基是不同，由此造成基因的突变。
①取新鲜、年轻的斜面，用pH值一定的磷酸 缓冲液或tris缓冲液洗下细菌做成菌悬液。如 果细菌细胞或丝状菌孢子需进行前培养的，可 用有关培养基代替缓冲液，培养结束后离心洗 净，用同一种缓冲液做成菌悬液，浓度约控制 在106~107个/mL。 这一步的主要目的是使材料处于生长代谢的旺 盛期，有利于诱变。
脱氨基作用
脱氨基作用主要有三种变化： 腺嘌呤（A）变为次黄嘌呤（H）； 胞嘧啶（C）变为尿嘧啶（U）； 鸟嘌呤（G）变为黄嘌呤（X）。
腺嘌呤→次黄嘌呤
A→H时，第一次DNA 复制后次黄嘌呤不与 胸腺嘧啶（T）配对， 而与胞嘧啶配对，第 二次复制后，A：T就 变成了G：C。 脱氨基后碱基转换。
本节主要内容
介绍几种主要的化学诱变剂
二、化学诱变剂的种类
化学诱变剂种类
碱基类似物 烷化剂 脱氨剂 移码诱变剂 羟化剂 金属盐类 其他诱变剂
（一）碱基类似物
工业微生物育种复习题解析
工业微生物育种复习题解析第一章绪论1.什么是工业微生物？作为工业微生物应具备哪些特征？答：工业微生物：对自然环境中的微生物经过改造，用于发酵工业生产的微生物。
具备特征：(1)菌种要纯(2)遗传稳定且对诱变剂敏感(3)成长快，易繁殖(4)抗杂菌和噬菌体的能力强(5)生产目的产物的时间短且产量高(6)目的产物易分离提纯2.工业微生物育种的基础是什么？答：工业微生物育种的基础是遗传和变异。
3.常用的工业微生物育种技术有哪些？答：常用技术：(1)自然选育【选择育种】(2)诱变育种(3)代谢控制育种(4)杂交育种(5)基因工程育种第二章微生物育种的遗传基础1.基因突变的类型有哪些？答：有碱基突变，染色体畸变2.叙述紫外线诱变的原理？答：原理：紫外线对微生物诱变作用，主要引起DNA的分子结构发生改变（同链DNA的相邻嘧啶间形成共价结合的胸腺嘧啶二聚体），从而引起菌体遗传性变异。
3.基因修复的种类有哪些？答：种类：(1)光复活修复(2)切除修复(3)重组修复(4)SOS修复4.真核微生物基因重组的方式有哪些？答：方式：(1)有性杂交(2)准性生殖(3)原生质体融合第三章出发菌株的分离与筛选1.什么是富集培养？答：富集培养：指在目的微生物含量较少时，根据微生物的生理特点，设计一种选择性培养基，创造有利的生长条件，使目的微生物在最适的环境下迅速地生长繁殖，数量增加，由原来自然条件下的劣势种变成人工环境中的优势种，以利于分离到所需要的菌株。
2.哪些分离方法能达到“菌落纯”？哪些分离方法能达到“细胞纯（菌株纯）”？答：菌落纯：稀释分离法、划线法、组织法细胞纯：单细胞或单孢子的分离法3.分离好氧微生物常用的方法有哪些？答：(1)稀释涂布法(2)划线分离法(3)平皿生化反应分离法4.平皿生化反应分离法有哪些？分别用来筛选哪些菌？各自原理如何？答：(1)透明圈法原理：在平板培养基中加入溶解性较差的底物，使培养基混浊，能分解底物的微生物便会在菌落周围产生透明圈，圈的大小可以放映该菌株利用底物的能力。
工业微生物菌种的选育——诱变选育(1)
工业微生物菌种的选育——诱变选育（1）工业微生物菌种的选育——诱变选育（1）诱变选育诱变育种是指利用各种诱变剂的物理因素和化学因素处理微生物细胞，提高基因突变频率，再通过适当的筛选方法获得所需的高产优质菌种的育种方法。
诱变育种具有速度快、方法简便等优点，是当前菌种选育的一种主要方法，使用普遍。
诱变育种的理论基础是基因突变，所谓突变是指由于染色体和基因本身的变化而产生的遗传性状的变异。
诱变育种的步骤与方法（一）、工业育种的一般步骤（图）（二）、诱变育种方案设计诱变育种方案包括突变的诱发、突变株的筛选和突变高产基因的表现。
1、出发菌株的选择工业上用来进行诱变处理的菌株，称为出发菌株。
出发菌株选择目前主要依据实际经验，总结如下：①以单倍体纯种为出发菌株；②采用具有优良性状的菌株；③选择对诱变剂敏感的菌株；④许多高产突变往往要经过逐步累积的过程，才变得明显，所以有必要多挑选一些已经过诱变的菌株为出发菌株，进行多步育种，确保高产菌株的获得。
2、出发菌株的纯化为什么要对出发菌株进行纯化呢？这是因为微生物容易发生变异和染菌，同时一般丝状菌的野生菌株多为异核体。
生产菌在不断移代过程中，菌丝间接触、吻合后，易产生异核体、部分结合子、杂合二倍体及自然突变株等。
这些都会造成细胞内遗传物质的异质化，使遗传性状不稳定。
通过纯种分离，从中挑选所需的优良菌株。
常用划线分离和稀释分离法，并结合显微镜操纵器分离单孢子。
3、单孢子悬液的制备诱变育种要求所处理的细胞必须是处于对数生长期同步生长的细胞，并且是均匀状态的单细胞悬液。
首先是细胞的生理状态对诱变处理也会产生很大的影响，如细菌在对数期诱变处理效果较好；霉菌或放线菌的分生孢子一般都处于休眠状态，所以培养时间的长短对孢子影响不大，但稍加萌发后的孢子则可提高诱变效率。
其次是分散状态的细胞可以均匀地接触诱变剂，又可避免长出不纯菌落。
由于在许多微生物的细胞内同时含有几个核，所以即使用单细胞悬浮液处理，还是容易出现不纯的菌落。
04诱变育种
交流】抛砖引玉－－谈谈微生物诱变育种由于微生物自身的自然诱变几率非常低，所以我们在工业微生物育种时，会采用一些人工的诱变剂，物理类的象紫外线，X射线，快中子，微波，超声波，电磁波，激光射线和宇宙线等，其中对微生物诱变效果较好的，应用较广的是紫外线，X射线，快中子。
近年来，诱变育种仍备受育种工作者的欢迎，而且还开发了一些新型诱变剂，用于工业微生物育种。
象微波，红外射线，激光，高能电子流，离子注入。
其中离子注入法做为一种新的生物诱变技术已经引起国内外学者的极大关注。
离子注入是20世纪80年代兴起的一种材料表面处理的高新技术，主要用于金属材料表面的改性。
1986年在中国科学院等离子体物理研究所被用于农作物育种，之后又被用于工业微生物的诱变育种，成果显著。
附上文章一篇－－－离子束应用于生物品种改良的研究进展..CAJ离子束应用于生物品种改良的研究进展..CAJ (210.15k)这一段时间我正在思考这个问题，在这方面非常愿意和战友们讨论。
请教popstar 战友，有无近10年的关于诱变育种的国外文献。
谢谢国内有关微生物诱变方法的文献非常多。
大体包括：物理诱变剂方面：紫外线，X射线、γ射线、中子、β粒子、α粒子，微波、红外射线、激光、高能电子流、离子注入等；化学诱变剂方面：碱基类似物、烷化剂、脱氨剂、移码诱变剂、羟化剂、金属盐类等。
生物诱变剂方面（其实这就是基因工程育种，在这里姑且叫作生物诱变剂）：噬菌体和基因诱变剂。
正如你所说国内关于诱变的文章很多，很可惜我现在还没有精力收集国外的文章，国内的文献已经足够我参考了，要是太分心大老板会有想法的，毕竟工厂还是讲效益的地方。
还是那句话“抛砖引玉”。
希望我这张帖子能够吸引更多的同行进来参加讨论，能分享到更多的好见解，微生物版更要越做越好。
现有的关于菌株诱变方法的文章，可以说都是报道了一个操作方法，实验结果中都会说产量提高了多少多少，而无机理的深入探讨。
这样的实验没有一点重复性，也许这种文章每天都可以编一篇，这样的文章有参考价值？！你说的很有道理，不排除有的文章一天可以编一篇，但你也不能完全否认国内文章的质量，毕竟不是每个人的文章都是编的；毕竟有的厂筛到了好的菌种，真的赚钱了。
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（五）脱氨剂-亚硝类诱变剂作用原理
作用：通过氧化脱氨基造成的。胞嘧啶 (C)经氧化脱氨后成为尿嘧啶(U)、腺嘌 呤(A)经脱氨后成为次黄嘌呤(H)，鸟嘌 呤(G)脱氨成为黄嘌呤(X)。
遗传变异：能遗传
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4.2 生理方面的表现
生理方面的表现 酶活性的变化
POD（过氧化物酶）、 SOD 、CAT （过氧
化氢酶）、核酸酶 相关物质含量的变化 蛋白质、氨基酸、核苷酸 生长素、ABA（天然脱落酸）
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4.3 遗传方面的表现
细胞核方面的表现: 细胞核扩大、松散（膨松 puffing） 微核细胞，微核细胞率与辐射剂量成正比 微核细胞率是评价遗传损伤的指标 染色体方面的表现: 断裂，形成染色体断片、环、桥等。 染色体畸变率与辐射剂量成正比 染色体畸变率是评价遗传损伤的指标
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4、生物学阶段
持续时间长（甚至几个世代）,并可通过繁殖传递。 烷化自由基(R.)与生物大分子发生一系列反应，引 起生理和遗传损伤。 4.1 形态方面的表现 损伤：造成死亡，死亡率与辐射剂量成正比 生长：抑制生长等，与辐射剂量成正比 形态变异：菌落（体）、色泽大小变化。
生理变异：不能遗传，逐渐消失。
包括紫外光、x射线、γ射线、快中子、α射线、
β射线和超声波等。其中紫外光沿用最广，诱变
抗生素高产突变株有很优异的效果。
非电离辐射：电子级能提高，但不产生离子。
电离辐射:能击中电子并产生正离子
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（一）物理诱变剂的生物学效应
直接作用 击中DNA或其它生物结构引起的能量吸收 间接作用 环境中其它分子 激发和电离分子 重排
6-巯基嘌呤(6—MP)为黄色无臭结晶粉末，熔点
313-314℃(当即分解)，在空气中或见光会发黑变 质，溶于乙醇，碱性溶液和稀硫酸，几乎不溶于 水、丙酮、氯仿和醚。
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使用方法 1）将待处理的细菌于液体培养基中培养到对数
期，离心去培养液。
2）饥饿培养：生理盐水8-10小时
诱变育种的特点
（1）提高突变率、扩大突变谱。
（2）改良单一性状比较有效，同时改良多
个性状较困难.
（3）性状稳定快，育种年限短。
（4）诱发突变的方向和性质尚难掌握。
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一、物理诱变剂
物理诱变主要是由于高能辐射导致生物系统损伤， 继而发生遗传变异的一系列复杂的连锁反应过程。 常可以分为物理、物理-化学、化学、生物学阶段 (p35)。
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羟胺和细胞内其它物质也能发生作用，生成 过氧化氢。过氧化氢是非专一性诱变剂。
C* A C G C* A T A C G
C G HA
C* G
对于噬菌体或离体DNA，羟胺是专一性很强的 诱变剂，但对细菌、真菌和放线菌等微生物， 诱变效果不理想
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当溶液pH在8.0以上时，NTG会分解产生重 氮甲烷，对核酸其烷化作用； 当溶液pH6.0时，NTG本身DNA其烷化反应 而导致突变。
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!NG使用注意事项﹗
a、根据处理菌体特性，选用一定范围pH值的缓冲
液制备菌体或孢子悬液。再离心洗涤，除去培
养液，然后用缓冲液制备孢子液。 b、NG试剂要保存在冰箱内，使用时要特别注意 安全﹗ ﹗ ﹗ 操作要在通风柜内，带上橡皮手 套，穿上工作服，也不得将NG直接放在纸上暴
注意：操作和培养时必需避免可见光直射液面， 最好在黄色或红色灯光下操作。 后培养：1.5-2小时；
稀释涂皿
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（四）、电离辐射
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（五）新型诱变剂
微波:电磁波
红外线：0.75～1000μm 激光：光量子流
高能电子流：强电离辐射
航天育种：利用返回式卫星进行农作
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4、操作方法
出发菌株 前培养；培养基丰富营养、细菌培养到 对数期、真菌孢子刚成熟； 制备菌悬液：处理液均用生理盐水制 备。细菌调节菌液浓度到108个/ml，真 菌约为106—107 /ml，放线菌则为l07— 108/ml.
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照射
设备：紫外灯、磁力搅拌器、暗室、培养皿等 ; 紫外灯：波长为253.7nm,功率是15W; 处理时的照射距离：20cm — 30cm; 样品：要直接暴露在紫外灯下，厚度不能超过 3mm,照射时，要用磁力搅拌器搅拌。
物新品种的选育的一种方法。
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航椒1号
航茄2号
航 天 葫 芦
6、低能离子注入 过程：能量沉积、动量传递、离子注入和电荷 交换 时间：10－19－10－13s中间时发生。
特征：具有Y射线能量沉积引起机体损伤的； 动能交换产生的级联损伤，表现为遗传物质 原子转移、重排或基因的缺失；慢化离子、 移位原子和本底元素复合反应造成的化学损 伤以及电荷交换引起的生物分子电子转移造 成的损伤。
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常用离子：通常采用N+、H+、Ar＋。 生物学效应：相当于物理和化学诱变两者相 结合的复合诱变效应
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二、化学诱变剂
化学诱变剂是一些能和DNA起作用，改变
其结构，并引起遗传变异的化学物质。
碱基类似物
烷化剂 种类 移码突变剂 其他类
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亚硝基胍（NG、NTG）
黄色结晶、性质不稳定，遇光分解。是一种特别 强的诱变剂，有超诱变剂的称号。还能诱发邻近 的基因同时发生突变，即并发突变。且易诱发复 制叉附近并发突变。有微弱移码作用,适于诱变营 养缺陷型突变株(10%营养缺陷型)。
NO CH3 N C NH
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NHNO2
NTG在水溶液中随着不同pH将产生不同的 分解物，从而影响诱变效用. 当溶液pH低于5.5时，NTG分解成亚硝酸；
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2、烷化剂作用机理
EMS引起碱基转换
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烷化剂
一般认为甲基化比乙基化造成能造成更多的断裂和 缺失，所以MMS的毒性大于EMS。
O
甲基黄磺酸乙酯 EMS
CH3
S O O
OC2H5
甲基黄磺酸甲酯 MMS
CH3
S O
OCH3
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3、常用烷化剂及其使用方法
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(三) 移码诱变剂
能和DNA分子结合，并造成其碱基对增多或缺 失，从而诱发突变的化合物。包括压吖啶类杂 环染料以及一些烷化剂和吖啶类相结合的化合物，
总称为ICR类化合物。
使用方法：用pH7.0磷酸缓冲液将吖啶黄配制成
浓度为0.2%溶液，在28℃振荡3—4小时使其完
全溶解。直接加入孢子液接触处理或加入培养基 内。如为生长过程处理，平皿内浓度一般为1050µ g／ml的吖啶黄，处理时避光操作。
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DNA方面的表现: DNA断裂、分解，形成单链结构 DNA非按时合成 存在自我损伤修复机制，提前进行DNA合成， 进行DNA损伤修复 生长素类物质促进DNA损伤修复 咖啡因、EDTA等拟制DNA损伤修复
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（二）影响辐射效应的因子
①菌种的遗传背景和生理状态； ②可见光； ③水分； ④电离辐射诱变剂在氧气或空气中使用时，其辐
射效应一般要比在真空中或在惰性气体中时要
高；
⑤温度对电离辐射效应也有影响，主要是能改变
氧与自由基，或自由基相互间的作用程度。
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（三）非电离辐射——紫外线
1、性质和来源 波长在40一390nm之间。由于DNA分子的紫外
光吸收值为260nm，因而波长在200-300nm的
紫外光才有诱变作用。紫外光源一般要求为发
3) 把 5-Bu或5-Fu（一般剂量为5-300µ g／ml，细
菌25-40 µ g／ml）加到培养基中，做平板。 4）涂皿菌体涂布在含一定浓度的碱基类似物的培 养基平皿上，适温培养，挑取菌落筛选。
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(二) 烷化剂
烷化剂是一种常见的诱变剂，这类诱变剂 具有一个或多个活性烷基，他们容易取代 DNA分子中的活泼氢原子，直接和一个或 多个碱基起烷化反应。
杀菌率：90.0%-99.9%
时间：芽孢菌10min；
小芽孢杆菌营养缺陷型1-3min； 一般营养体3-5min； 无芽孢菌和革兰氏阳性菌0.5-2min。
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3、诱变机理
嘧啶二聚体
DNA链的断裂 胞嘧啶与尿嘧啶的水和作用 DNA与蛋白质交联
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射光谱集中在260nm附近的紫外光灯，灯管内
装有氖气的低压放电灯是较理想的光源，国内 一般采用30瓦的紫外光灯，光谱分布范围广， 诱变效率差。 特点：能量较低；对组织穿透力强.
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2、紫外光的剂量
单位:尔格能量/mm2 (灯具发射强度随使用时间延长而下降。)
实际应用-相对剂量：照射时间、杀菌率来表示
（一）碱基类似物
1、种类
胸 腺 嘧 啶 的 结 构 类 似 物 常 用
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腺嘌呤的结构类似物
常 用
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鸟嘌呤的结构类似物
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2、碱基类似物作用机制
5-溴尿嘧啶（5-BU）是胸腺嘧啶的结构类似物也 是一种强诱变剂。它渗入到DNA中，会发生酮 式和烯醇式互变，不仅和原来的碱基配对而且和 其它碱基配对。
物 理