易错PCR在酶的非理性设计改造中的应用

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PCR常见问题、原因分析及其对策

镁离子浓度不当
总结词
镁离子是PCR反应的重要成分，对PCR的效率和产物质量有重要影响。
详细描述
镁离子浓度过高可能导致非特异性扩增和产物稳定性下降；镁离子浓度过低则可能影响DNA聚合酶的活性，导致PCR失败或扩增效率低下。因此，需要根据实验条件和试剂盒推荐，选择合适的镁离子浓度。
03
pcr问题对策
详细描述
模板质量的好坏直接影响到pcr的扩增效果，因此需要确保模板的纯度和浓度，避免使用降解严重的模板，以提高pcr的产量和特异性。
优化pcr循环参数
总结词
pcr循环参数的优化可以显著提高pcr的效率和特异性。
详细描述
通过调整变性、退火、延伸等温度和时间，可以优化pcr循环参数，提高pcr的效率和特异性。同时，合理设置预变性时间和循环数，可以有效避免非特异性扩增和产物积累。
优化引物设计
总结词
引物设计是pcr反应的关键，优化引物设计可以显著提高pcr的特异性和效率。
详细描述
引物设计时需考虑特异性、长度、GC含量、引物二聚体和发夹结构等因素，通过合理设计引物，可以避免非特异性扩增和引物二聚体形成，提高pcr的特异性。
提高模板质量
总结词
模板质量对pcr结果的影响不容忽视，提高模板质量可以提高pcr的产量和特异性。
模板质量差
总结词
模板质量的好坏直接影响到PCR的效率和产物质量。
详细描述
模板中可能含有抑制剂、DNA聚合酶抑制剂或DNA聚合酶竞争性抑制剂等物质，这些物质会影响DNA聚合酶的活性，导致PCR失败或扩增效率低下。此外，模板的浓度过低或过高也可能影响PCR结果。
pcr循环参数不当
总结词
PCR循环参数包括变性、退火、延伸等步骤，这些步骤的温度和时间设置对PCR结果有重要影响。

理性和非理性蛋白质设计策略在酶工程中应用

表１酶工程中常用的定向进化方法Ｔａｂｌｅ１ｄｉｒｅｃｔｅｄｅｖｏｌｕｔｉｏｎｓｔｒａｔｅｇｉｅｓｕｓｕａｌｌｙｕｓｅｄｉｎｅｎｚｙｍｅｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ
定向进化方法易错ＰＣＲ（ｅｒｒｏｒ－ｐｒｏｎｅＰＣＲ，ｅｐ－ＰＣＲ）致突变菌株产生随机突变（ｒａｎｄｏｍｍｕｔａｔｉｏｎｂｙｍｕｔａｔｏｒｓｔｒａｉｎ）ＤＮＡ改组（ＤＮＡｓｈｕｆｆｌｉｎｇ）ＤＮＡ同源改组（ＤＮＡｆａｍｉｌｙｓｈｕｆｆｌｉｎｇ）外显子改组（ｅｘｏｎｓｈｕｆｆｌｉｎｇ）体外随机引发重组（ｒａｎｄｏｍ－ｐｒｉｍｉｎｇｉｎｖｉｔｒｏｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ，ＲＰＲ）交错延伸（ｓｔａｇｇｅｒｅｄｅｘｔｅｎｓｉｏｎｐｒｏｃｅｓｓ，ＳｔＥＰ）过渡模板随机嵌合生长（ｒａｎｄｏｍｃｈｉｍｅｒａｇｅｎｅｓｉｓｏｎｔｒａｎｓｉｅｎｔｔｅｍｐｌａｒｉｅｓｅｎｈａｎｃｅｄｂｙｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｉｎｙｅａｓｔ，ＣＬＥＲＹ）渐增切割法产生杂和酶（ｉｎｃｒｅｍｅｎｔａｌｔｒｕｎｃａｔｉｏｎｆｏｒｔｈｅｃｒｅａｔｉｏｎｏｆｈｙｂｒｉｄｅｎｚｙｍｅｓ，ＩＴＣＨＹ）不依赖序列同源性的蛋白质重组（ｓｑｕｅｎｃｅｈｏｍｏｌｏｇｙ－ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔｐｒｏｔｅｉｎｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ，ＳＨＩＰＲＥＣ）ＳＣＲＡＴＣＨ技术合成改组（ｓｙｎｔｈｅｔｉｃｓｈｕｆｆｌｉｎｇ）简并同质双链重组（ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅｈｏｍｏｄｕｐｌｅｘｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ，ＤＨＲ）短片断上的重组延伸（ｒｅｃｏｍｂｉｎｅｄｅｘｔｅｎｓｉｏｎｏｎｔｒｕｎｃａｔｅｄｔｅｍｐｌａｔｅｓ，ＲＥＴＴ）以寡核苷酸为基础的随机化过程（ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ－ｄｉｒｅｃｔｅｄｒａｎｄｏｍｉｚａｔｉｏｎＭＡＸｒａｎｄｏｍｉｚａｔｉｏｎ）密码子改组（ｃｏｄｏｎｓｈｕｆｆｌｉｎｇ）序列饱和突变（ｓｅｑｕｅｎｃｅｓａｔｕｒａｔｉｏｎｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ，ＳｅＳａＭ）设计的寡核苷酸的装配（ａｓｓｅｍｂｌｙｏｆｄｅｓｉｇｎｅｄｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，ＡＤＯ）依赖重组的指数扩增ＰＣＲ（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎＰＣＲ，ＲＤＡ－ＰＣＲ）突变和单一方向的装配（ｍｕｔａｇｅｎｉｃａｎｄｕｎｉｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌｒｅａｓｓｅｍｂｌｙ，ＭＵＲＡ）不依赖序列的定点装配（ｓｅｑｕｅｎｃｅ－ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔｓｉｔｅ－ｄｉｒｅｃｔｅｄｃｈｉｍｅｒａｇｅｎｅｓｉｓ，ＳＩＳＤＣ）以结构为基础的重组蛋白工程（ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ－ｂａｓｅｄｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌｐｒｏｔｅｉｎｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ＳＣＯＰＥ））提高交叉的ＳＣＲＡＴＣＨ技术（ｅｎｈａｎｃｅｄｃｒｏｓｓｏｖｅｒＳＣＲＡＴＣＨＹ）

易错PCR技术在淀粉酶定向进化中的应用

易错PCR技术应用于酶体外进化的研究进展沈思军1*，马春萍2，哈杰提2，马全磊1(1. 石河子大学动物科技学院，新疆，石河子，832003；2. 新疆西部牧业股份有限公司，新疆，石河子，832000)摘要：易错PCR技术是通过调整PCR反应条件，产生随机错配而引入多个突变。

由于该技术操作简单易行，广泛应用于酶工程改造研究中。

本文介绍了易错PCR技术的影响因素及近几年在酶工程改造中的应用进展。

关键词：易错PCR技术；影响因素；酶工程改造在体外进行酶分子改造的常用采用分子体外定向进化技术。

常用的方法有易错PCR （error-prone PCR）、DNA重排（DNA shuffling）、交错延伸法（staggered extension process, StEP）、随机引物体外重组（random-priming in vitro recombination, RPR）、易错滚环扩增法（error-prone rolling circle amplification, EP-RCA）、序列饱和诱变（sequence saturation mutagenesis, SeSaM）、随机插入/删除的链交换突变（random insertion/deletion strand exchange mutagenesis, RAISE）等[1]。

基本原理都是通过导入突变获得大量含有不同突变的酶，在不同环境条件下定向筛选有益突变菌株。

易错PCR是通过改变PCR条件，提高扩增产物的三大错配率，从而获得与原来不同的DNA序列或基因[2]，其操作简便易行，成为体外酶工程应用较为广泛的技术之一。

本文就易错PCR 过程中影响突变率的因素和易错PCR技术在酶分子进化中的应用这两个方面，综述国内近几年的研究进展。

1. 影响易错PCR突变率的因素易错PCR技术是结合随机突变与定向筛选，利用Taq DNA 多聚酶不具有3`→5`校对功能的特点，在PCR反应中通过调节离子浓度等方法引入随机突变，在特定培养基或培养条件下定向选择所需酶的方法。

酶的定向进化及其应用_孙志浩

易错 PCR 是指在扩增目的基因的同时引入碱基错配, 导致目的基因随机突变。然而, 经一次突变
的基因很难获得满意的结果, 由此发展出连续易错 PCR( sequential error- prone PCR) 策略。即将一次 PCR 扩增得到的有用突变基因作为下一次 PCR 扩增的模板, 连续反复地进行随机诱变, 使每一次获得的小突变累积而产生重要的有益突变。Chen( 陈克勤) 等人用此策略使在非水相( 二甲基甲酰胺, DMF) 溶液中定向进化枯草杆菌蛋白酶 E 的活性获得成功, 所得突变体 PC3 在 60% 的 DMF 中, 催化效率比野生酶高 471 倍[ 14, 15] 。
随着酶分子定向进化的发展, 在常规的定向进化方法的基础上, 又相继开发出了一些定向进化的新方法, 如体外随机引发重组( random priming in vitro recombination, RPR) [ 20] 、不依赖于同源性的蛋白质重组方法( sequence homology- independent protein recomb-i nation, SHIPREC) [ 21] 、交错延伸( stagger extension process, StEP) [22] 、过渡模板随机嵌合生长( random ch-i meragenesis on transient templates, RACHITT ) 、渐增切割产杂合酶方法( incremental truncation for the creation of hybrid enzymes, ITCHY) [23] 以及酶法体外随机- 定位诱变 ( random-site- directed mutagenesis) [ 24~ 26] 等方法,

酶工程选择题全部

第一章1.（C）证明了酶的本质是蛋白质A 施旺 B巴斯德 C 萨姆纳 D 芬恩 E 桑格2.1960年（A）提出操纵子学说。

A.Jacob和MonodB. Payen和PersonzC.Sumner和SangerD.Cech和Altmanard和Hans3.1个酶活力单位是指（B）A. 在特定条件（0℃，其它为最适条件）下，在1分钟内能转化1微摩尔底物的酶量B. 在特定条件（25℃，其它为最适条件）下，在1分钟内能转化1微摩尔底物的酶量C. 在特定条件（25℃，其它为最适条件）下，在1秒钟内能转化1微摩尔底物的酶量D. 在特定条件（25℃，其它为最适条件）下，在1分钟内能转化1摩尔底物的酶量E. 在特定条件（0℃，其它为最适条件）下，在1秒钟内能转化1摩尔底物的酶量4.酶促反映的初速度不受那个因素的影响（D）A.[S]B.[E]C.pHD.时间E.温度5.关于米氏方程常数Km，哪个是对的的（D）A.饱和底物浓度时的速度B.在一定酶的浓度下，最大速度的一半C.饱和底物浓度的一半D.速度达最大速度半数时的底物浓度E.减少一半速度时的克制剂浓度6.下面关于酶的描述，哪一项不对的？（A）A.所有的蛋白质都是酶B.酶是生物催化剂C.酶是在细胞内合成的，但是可以再细胞外发挥催化功能D.酶具有专一性E.酶在强碱、强酸条件下会失活7.下列哪一项不是Km值的功能（E）A.Km值是酶的特性物理常数，可用于鉴定不同的酶B.Km值可以表达酶与底物之间的亲和力，Km值越小、亲和力越大C.Km值可以预见系列反映中哪一步是限速反映D.用Km值可以选择酶的最适底物E.比较Km值可以估计不同酶促反映速度8.酶的活性中心是指（C）A.酶分子上的几个必须基团B.酶分子与底物结合的部位C.酶分子结合底物并发挥催化作用的关键性三维结构区D.酶分子中心部位的一种特殊结构E.酶分子催化底物变成产物的部位9.在一定温度范围内，反映速度随温度升高而加快，一般来说，温度每升高（D），反映速度大约增长一倍？A.1℃B.2℃C.5℃D.10℃E.15℃1.酶的催化特点（ABCD）A.极高的催化效率B.高度的专一性C.活性的可调节性D.活性的不稳定性E.活性的稳定性2.酶的专一性分为哪两个(BC)A.底物作用的专一性B.结构专一性C.立体异构专一性D.温度选择的专一性E.PH专一性3.酶的催化作用受哪些因素的影响？ABCDEA.底物浓度B.产物浓度C.酶浓度D.温度E.pH第四章1，下列关于酶应用过程中的一些缺陷错误的是（C）A酶的稳定性较差B酶的一次性使用C不溶于水，易于与底物、产物分离D产物的分离纯化较困难2，下列关于酶应用过程中的优点,错误的是（A）：A；酶的自水解作用B可反复使用；C可连续化生产；D稳定性好。

简述pcr的基本原理及应用

简述PCR的基本原理及应用PCR(聚合酶链式反应)的基本原理PCR是一种常用的分子生物学技术，可在体外迅速扩增目标DNA片段，并生成足够量供其他实验使用。

PCR基于DNA的双链结构，通过一系列的循环反应，在特定温度条件下，通过DNA模板、引物和聚合酶来扩增目标DNA。

具体而言，PCR反应通常包括三个主要步骤：变性、退火和延伸。

在变性步骤中，PCR反应混合物被加热至95°C，使DNA的双链解开成两条单链。

然后，温度下降至40-60°C，通过引物与目标DNA序列互补配对，进行退火。

最后，混合物中的聚合酶以37-75°C的活性温度将目标DNA序列延伸，并在每个循环中重复这个过程。

PCR的应用PCR已被广泛应用于许多领域，包括医学、农业、环境等。

以下是PCR在不同领域的常见应用：1. 疾病诊断PCR可用于疾病的早期诊断，尤其是感染性疾病的检测。

通过针对特定病原体的DNA或RNA进行扩增，可以快速、准确地检测疾病的存在。

例如，PCR在艾滋病、乙肝、流感等疾病的诊断中得到广泛应用。

2. 法医学分析PCR技术在法医学中发挥着重要作用，可以对DNA样本进行扩增，从而帮助识别犯罪嫌疑人、确定亲子关系等。

通过PCR，可以从血液、唾液、头发等样本中提取足够的DNA，进行比对和分析。

3. 基因工程和基因组学研究PCR技术是基因工程和基因组学研究中不可或缺的工具。

通过PCR可以扩增目标基因、片段或整个基因组，用于插入到质粒中进行基因克隆或检测。

4. 遗传病的筛查与检测PCR可以用于检测遗传病的突变或多态性位点，帮助确定个体对于某种疾病的易感性。

这对于家族遗传病的筛查、产前诊断和个体化医疗方面都具有重要意义。

5. 肿瘤分析PCR技术在肿瘤学研究中起着重要的作用。

利用PCR可以检测肿瘤细胞特异性基因、肿瘤相关突变等，帮助确定肿瘤类型、进展和治疗方案。

6. 生物多样性研究PCR可以用于研究不同生物物种的DNA序列，从而用于生物多样性的评估和鉴定。

易错PCR的基本原理、发展历程及运用前景简述-分子生物学论文-生物学论文

易错PCR的基本原理、发展历程及运用前景简述-分子生物学论文-生物学论文——文章均为WORD文档，下载后可直接编辑使用亦可打印——PCR 是一种DNA 片段体外复制技术，但常有一定的碱基错配发生，一般错配率为10- 6~ 10- 5.碱基错配虽然降低了DNA 序列复制的保真性，但对获得新DNA 序列提供了一种可利用的突破口。

于是，便出现了易错PCR 技术（Error-prone PCR,epPCR）.易错PCR 是通过改变PCR 条件，提高扩增产物的碱基错配率，从而获得与原来不同的DNA 序列或基因。

易错PCR 作为一种简便、有效地获得DNA 序列变异的技术，主要是针对特定的基因，这在遗传和基因改良研究中具有巨大的应用前景，但是目前尚无系统的归纳总结。

为此，本文综述了易错PCR 的概念、原理、方法、研究进展、应用情况以及存在的问题，以期为基因体外变工作者提供参考。

1 易错PCR 的概念和基本原理1. 1 易错PCR 的概念易错PCR,意为易错条件下的PCR,即容易使复制出的DNA 序列出现错误的PCR 技术，又称错配PCR 或倾向错误PCR,是指通过利用低保真度TaqDNA 聚合酶和改变PCR 反应条件，降低DNA 复制的保真度，在新DNA 链合成过程中增加碱基错配，从而使扩增产物出现较多点突变的一种体外导DNA 序列变异的方法。

在20 世纪50 ~ 80 年代，随着DNA 体外合成、复制理论和技术的逐渐成熟，很多人对DNA 体外合成、复制过程中发生碱基代换的诸多影响因素进行研究，以提高基因体外合成的精确性；同时，还有很多研究者在积极寻求能够导基因产生各种可能变异的有效方法，来模仿自然界核酸、蛋白质的进化过程。

Leung等受以上两个不同研究方向的启示，提出了基因在易错PCR 条件下产生变异，可以构建突变体库的观点，并建立了易错PCR 技术体系。

该体系于1992 年经Cadwell 和Joyce进一步发展得到了完善，目前广泛应用的易错PCR 技术多是参照他们的做法。

2022年高考生物二轮复习核心素养串讲课5 科学探究之PCR

【解析】(1)PCR技术是在体外模拟体内DNA复制过程，利用DNA的热变性原理，替代原有的解旋酶的作用，通过控制温度来控制DNA的解聚(解旋)与结合。 (2)利用PCR技术扩增DNA的过程中还需增加耐高温的DNA聚合酶，DNA聚合酶发挥作用需要提供现成的引物，引物序列和目的基因的两端的碱基互补配对。所用引物Ⅰ为：5'—GTTA—OH，与一段DNA序列中3'—CAATTGGAATC—5' 的3'端互补，故引物Ⅱ要与一段DNA序列中5'—GTTAACCTTAG—3'的3'端互补，故引物Ⅱ为：5'—CTAA—OH。
2.(不定项选择)(2021·潍坊三模)聚合酶链式反应(PCR)是一种用于扩增特定DNA 片段的分子生物学技术。下列关于PCR引物的叙述正确的是 ( ) A.为保证模板链与引物结合的效率，两种引物之间尽量避免存在互补序列 B.为了便于将扩增的DNA片段与载体连接，可在引物的3'端加上限制酶识别序列 C.在两种引物上设计加入不同的限制酶识别序列，主要目的是使目的基因定向插入载体并可避免目的基因自身环化 D.复性所需的温度、时长和延伸所需的温度、时长均与引物有关
【解析】选B。新型冠状病毒为RNA病毒，由RNA与蛋白质构成，RT-PCR技术利用病毒RNA进行逆转录获得cDNA，该过程以RNA为模板，脱氧核苷酸为原料，需要逆转录酶进行催化。新型冠状病毒为RNA病毒，遗传物质为RNA，其中含有尿嘧啶核糖核苷酸，A正确；检测过程含有RNA的逆转录与DNA的复制，原料均为脱氧核苷酸，不需要核糖核苷酸，B错误；RT-PCR反应过程中包括 RNA的逆转录与DNA的复制，需要逆转录酶与DNA聚合酶，C正确；相同反应时间内，病毒含量越高，逆转录复制后获得的DNA含量越多，D正确。

PCR技术的原理及其应用

③引物的延伸：在TaqDNA聚合酶的最适温度（72℃）下，以dNTP为原料，按碱基配对与半保留复制原理，从引物的 5’→3’方向延伸，合成DNA新链。重复循环变性--退火-延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。
PCR反应五要素：
即参加PCR反应的五种主要物质：引物、酶、dNTP、模板和Mg2+。
利用反向PCR可对未知序列扩增后进行分析，探索邻接已知DNA片段的序列，并可将仅知部分序列的全长cDNA进行分子克隆，建立全长的DNA探针。适用于基因游走、转位因子和已知序列DNA旁侧病毒整合位点分析等研究。
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
反向PCR原理示意图
反向PCR的不足：
①需要从许多酶中选择限制酶，或者说必须选择一种合适的酶进行酶切才能得到合理大小的DNA片段。这种选择不能在非酶切位点切断靶DNA；
免疫-PCR：
免疫-PCR(immuno-PCR)是新近建立的一种灵敏、特异的抗原检测系统。它利用抗原-抗体反应的特异性和PCR扩增反应的极高灵敏性来检测抗原，尤其适用于极微量抗原的检测。
免疫-PCR试验的主要步骤有三个：①抗原-抗体反应，②与嵌合连接分子结合，③PCR扩增嵌合连接分子中的DNA(一般为质粒DNA)。该技术的关键环节是嵌合连接分子的制备。在免疫-PCR中，嵌合连接分子起着桥梁作用，它有两个结
多重PCR的特点有：
①高效性，在同一PCR反应管内同时检出多种病原微生物，或对有多个型别的目的基因进行分型，特别是用一滴血就可检测多种病原体；
②系统性，多重PCR很适宜于成组病原体的检测，如肝炎病毒，肠道致病性细菌，性病，无芽胞厌氧菌，战伤感染细菌及细菌战剂的同时侦检；

易错PCR技术的原理和应用

易错PCR技术的原理和应用1. 引言易错PCR（Error-Prone PCR）是一种特殊的聚合酶链式反应（PCR）技术，通过引入随机错误来增加PCR扩增产物的多样性。

该技术有着广泛的应用领域，包括进化实验、蛋白质工程和药物研发等。

本文将介绍易错PCR技术的原理及其在不同领域中的应用。

2. 易错PCR技术的原理易错PCR技术的原理是通过在PCR扩增过程中引入缺陷的DNA聚合酶或高浓度的二硫键还原剂来增加随机错误的发生率。

这些错误包括碱基插入、缺失和替换等，从而使得PCR扩增产物具有更大的多样性。

易错PCR技术的原理如下：•步骤1：将DNA模板与引物、聚合酶和核苷酸混合。

•步骤2：在PCR反应中，引入易错聚合酶或高浓度的二硫键还原剂。

•步骤3：进行PCR扩增。

•步骤4：获得易错PCR产物，具有更高的多样性和变异性。

3. 易错PCR技术的应用易错PCR技术在许多领域中都有着重要的应用，下面将分别介绍其在进化实验、蛋白质工程和药物研发中的应用。

3.1 进化实验易错PCR技术在进化实验中扮演着重要的角色。

通过引入随机错误，易错PCR 可以产生具有更高随机变异率的DNA序列，从而加速在实验室中模拟自然进化的过程。

这种技术可以用于研究蛋白质功能、酶活性和受体配体结合等方面的变化。

3.2 蛋白质工程易错PCR技术在蛋白质工程中也有着重要的应用。

通过引入随机错误，易错PCR可以生成大量的蛋白质变体。

这些变异体可以用于筛选具有特定功能的蛋白质，包括增强酶活性、改变抗原特异性和提高稳定性等。

3.3 药物研发易错PCR技术在药物研发中也扮演着重要的角色。

通过引入随机错误，易错PCR可以生成多种药物候选分子，进而进行高通量筛选，以寻找具有更好药效和减轻副作用的化合物。

此外，易错PCR还可以用于研究药物耐药性的机制和变异。

4. 总结易错PCR技术通过引入随机错误来增加PCR扩增产物的多样性，其原理简单而有效。

该技术在进化实验、蛋白质工程和药物研发等领域中都有着广泛的应用。

易错pcr的原理及应用

易错pcr的原理及应用1. 引言PCR（Polymerase Chain Reaction）是一种常用的核酸扩增技术，通过体外复制DNA序列，从而在短时间内大量产生目标DNA片段。

然而，PCR技术在特定条件下可能产生一些错误，易错PCR技术的出现就是为了解决这一问题。

本文将介绍易错PCR的原理及其在实际应用中的意义。

2. 易错PCR的原理易错PCR技术在PCR扩增过程中引入了特殊的PCR缺陷识别酶，可以识别并纠正扩增过程中出现的错误。

其原理主要包括以下几个方面：2.1 错误识别易错PCR技术引入了PCR缺陷识别酶，该酶在扩增过程中可以识别常见的扩增错误，如碱基替换、碱基插入和碱基缺失等。

通过与目标DNA序列的比较，识别出可能引入了错误的扩增产物。

2.2 识别酶的修复作用一旦PCR缺陷识别酶识别出错误，它会寻找并修复这些错误。

识别酶能够识别错误对应的位置，然后发挥其具有修复功能的特性，修复出正确的DNA序列。

2.3 扩增环节优化易错PCR技术还在扩增的各个环节中引入了一些优化措施，以减少错误的产生。

例如，优化了引物的设计，对模板DNA进行预处理等。

通过这些优化措施，能够降低错误的概率，提高扩增的准确性。

3. 易错PCR的应用易错PCR技术具有识别和纠正PCR扩增错误的能力，在实际应用中具有广泛的应用前景。

3.1 分子诊断易错PCR技术可以用于分子诊断，通过扩增特定基因片段来筛查与某些疾病相关的突变。

通过纠正扩增过程中的错误，可以提高基因检测的准确性和可靠性。

3.2 法医学应用易错PCR技术在法医学中也具有重要意义。

通过扩增DNA样本，可以从微量的样本中提取足够的DNA用于分析。

易错PCR技术的高准确性和灵敏度使其成为犯罪侦查、亲子鉴定等领域的重要工具。

3.3 进化研究易错PCR技术在进化研究中也发挥着重要作用。

通过对不同物种的DNA进行扩增并纠正错误，可以更精确地研究物种间的进化关系和遗传变异。

3.4 无创产前检测易错PCR技术在无创产前检测中也有应用前景。

PCR应用问题及对策

总结词
PCR假阴性结果是指应该被扩增的DNA序列没有被扩增出来，导致实验结果出现偏差。
详细描述
PCR假阴性问题通常是由于引物设计不当、退火温度不合适、模板浓度过低等原因引起的。为了解决这个问题，需要优化引物设计和退火温度，同时提高模板浓度，以确保PCR实验的准确性和可靠性。
交叉污染问题
总结词
PCR交叉污染是指在实验过程中，一个样品中的DNA序列污染到了另一个样品中，导致实验结果出现偏差。
详细描述
PCR交叉污染问题通常是由于操作不规范、实验室环境不洁净等原因引起的。为了解决这个问题，需要采取一系列措施，如加强实验室管理、规范操作流程、定期对实验室进
行清洁和消毒等。
引物二聚体问题
要点一
总结词
PCR引物二聚体是指引物自身结合形成的二聚体结构，影响PCR扩增效率。
要点二
详细描述
PCR引物二聚体问题通常是由于引物设计不当、引物浓度过高、退火温度不合适等原因引起的。为了解决这个问题，需要优化引物设计和退火温度，同时控制引物浓度，以确保PCR实验的准确性和可靠性。
详细描述
巢式pcr技术通过设置两对引物，先进行外引物扩增，再进行内引物扩增，可以增加特异性，减少非特异性扩增，提高pcr检测的准确性。
建立多重pcr技术
总结词
建立多重pcr技术可以提高pcr检测的效率和特异性。
详细描述
多重pcr技术可以在同一管中同时进行多个基因的扩增，不仅可以节省时间和成本，还可以通过同时检测多个基因来提高检测的特异性和可靠性。
设计特异性更好的引物
总结词
设计特异性更好的引物是解决pcr技术应用问题的重要对策之一。
详细描述
通过合理设计引物，特别是退火温度和引物长度等参数，可以提高引物的特异性，减少

易错PCR技术改造扩展青霉脂肪酶

易错PCR技术改造扩展青霉脂肪酶施碧红;李强;陈明;吴伟斌;施巧琴;吴松刚【摘要】A random mutated lipase gene library was constructed by error prone PCR technique.4000 strains of GS115 containing random mutant lipases were primary screened.300 strains were secondary screened based on lipase activity,thermostability and acid resistance,one mutant strain named ep3 was finally selected by flask fermentation.The optimum pH and optimum working temperature of ep3 lipase was pH 9.4 and35℃,respectively,which was the same as that of the wild type rec ombinant lipase（PEL-GS）,and the specific activity of the lipase at pH 9.4 and 35℃ was 3 440 U/mg,which was 17% higher than that of the wild type lipase.%利用易错PCR技术,建立脂肪酶基因随机突变文库,将随机突变脂肪酶基因转化毕赤酵母GS115,初步筛选了4000株突变菌株,对300株较优突变株进行酶的活力、耐热性、耐酸性的摇管复筛,进一步摇瓶复筛后获得优良突变株ep3,所产突变脂肪酶（ep3-GS）的适宜pH为9.4,适宜作用温度为35℃,与野生重组脂肪酶（PEL-GS）一致,该温度下酶的比活为3440 U/mg,比野生型脂肪酶提高17%。

易错pcr原理

易错pcr原理易错PCR（Polymerase Chain Reaction）是一种常用的分子生物学技术，用于扩增和检测特定的DNA序列。

本文将介绍易错PCR 的原理和应用。

易错PCR是一种特殊的PCR方法，旨在解决PCR过程中的错误扩增问题。

在常规PCR中，由于DNA聚合酶的错误复制，以及模板DNA上的突变或污染，会导致PCR产物中出现错误的碱基序列。

这些错误的PCR产物可能会影响后续的研究结果和数据分析，因此需要采取措施来减少这些错误。

易错PCR的原理是通过引入特殊的DNA聚合酶和核苷酸补体来纠正PCR过程中的错误。

首先，易错PCR使用具有高度校正活性的DNA聚合酶，例如Pfu聚合酶。

与常规聚合酶相比，Pfu聚合酶具有更高的准确性和较低的错误率。

这可以有效降低PCR过程中错误复制的风险。

在易错PCR中引入了易错核苷酸补体，例如dUTP和dITP。

这些易错核苷酸补体可以替代常规的dATP、dCTP、dGTP和dTTP，并与DNA聚合酶一起使用。

这些易错核苷酸补体相比常规核苷酸具有更高的容错性，可以纠正PCR过程中的错误，并减少错误扩增的风险。

易错PCR的步骤与常规PCR相似，包括变性、退火和扩增。

在变性步骤中，DNA模板被加热至高温，使其两条链分离。

然后，在退火步骤中，引物与模板DNA相结合，形成引物-模板复合物。

在扩增步骤中，DNA聚合酶在适当的温度下，以引物为起点，从引物的3'端开始合成新的DNA链。

这样，通过多次循环变性、退火和扩增，可以扩增特定的DNA序列。

易错PCR的应用非常广泛。

首先，易错PCR常用于基因表达分析。

通过减少错误扩增，易错PCR可以提高测量基因表达水平的准确性。

其次，易错PCR可用于检测DNA突变。

通过引入易错核苷酸补体，易错PCR可以纠正突变引起的错误，并减少突变检测的假阳性和假阴性结果。

此外，易错PCR还可用于DNA克隆、基因突变和DNA测序等实验。

易错PCR是一种通过引入高准确性的DNA聚合酶和易错核苷酸补体来纠正PCR过程中错误扩增的方法。

酶的定向进化方法

摘要酶的体外定向进化是蛋白质工程的新策略. 不需事先了解酶的空间结构和催化机制, 而是通过模拟自然进化机制，以改进的诱变技术结合确定进化方向的选择方法，在体外改造酶基因，定向选择有价值的非天然酶. 短期内可以在试管中完成自然界需要几百万年的进化过程，因此可能是发现新型酶和新的生理生化反应的重要途径.关键词蛋白质工程模拟定向进化-------------------------------------------------------------理论上，蛋白质分子蕴藏着很大的进化潜力，很多功能有待于开发，这是酶的体外定向进化的基本先决条件. 所谓酶的体外定向进化（directed evolution of enzyme in vitro）, 又称实验分子进化（experimentally molecular evolution）, 属于蛋白质的非合理设计（irrational design），它不需事先了解酶的空间结构和催化机制〔1〕，通过人为地创造特殊的条件，模拟自然进化机制（随机突变、重组和自然选择），在体外改造酶基因, 并定向选择出所需性质的突变酶. 酶的体外定向进化技术极大地拓展了蛋白质工程学的研究和应用范围，特别是能够解决合理设计所不能解决的问题，为酶的结构与功能研究开辟了崭新的途径，并且正在工业、农业和医药等领域逐渐显示其生命力.------------------------------------------------------------- 1 定向进化的原理在待进化酶基因的PCR扩增反应中, 利用Taq DNA多聚酶不具有3′→5′校对功能的性质, 配合适当条件, 以很低的比率向目的基因中随机引入突变, 构建突变库, 凭借定向的选择方法, 选出所需性质的优化酶（或蛋白质）, 从而排除其他突变体. 定向进化的基本规则是,“获取你所筛选的突变体”〔2〕. 简言之, 定向进化=随机突变+选择. 与自然进化不同, 前者是人为引发的, 后者虽相当于环境, 但只作用于突变后的分子群, 起着选择某一方向的进化而排除其他方向突变的作用，整个进化过程完全是在人为控制下进行的.------------------------------------------------------------- 2 随机突变的策略2.1 易错PCR易错PCR（error-prone PCR）〔3，4〕是指在扩增目的基因的同时引入碱基错配, 导致目的基因随机突变. 然而，经一次突变的基因很难获得满意的结果，由此发展出连续易错PCR（sequential error-prone PCR ）策略. 即将一次PCR扩增得到的有用突变基因作为下一次PCR扩增的模板, 连续反复地进行随机诱变,使每一次获得的小突变累积而产生重要的有益突变. Chen等人〔5，6〕用此策略使在非水相（二甲基甲酰铵, DMF）溶液中定向进化枯草杆菌蛋白酶E的活性获得成功，所得突变体PC3在60%和85%的DMF中, 催化效率kcat /Km分别是野生酶的256和131倍, 比活性提高了157倍. 将PC3再进行两个循环的定向进化〔2〕, 产生的突变体13M的kcat /Km比PC3高3倍(在60%DMF中), 比野生酶高471倍.在该方法中，遗传变化只发生在单一分子内部, 故属于无性进化（asexual evolution）. 它较为费力、耗时，一般适用于较小的基因片段（<800 bp）. 此外, 使用该方法易出现同型碱基转换.2.2 DNA改组和外显子改组DNA改组（DNA shuffling）〔7，8〕又称有性PCR(sexual PCR)，原理如图1所示. 该策略的目的是创造将亲本基因群中的突变尽可能组合的机会, 导致更大的变异, 最终获取最佳突变组合的酶. 在理论和实践上, 它都优于“重复寡核苷酸引导的诱变”和“连续易错PCR”. 通过DNA改组, 不仅可加速积累有益突变〔9〕, 而且可使酶的2个或更多的已优化性质合为一体〔10～15〕.外显子改组（exon shuffling）〔16，17〕类似于DNA改组，两者都是在各自含突变的片段间进行交换，前者尤其适用于真核生物. 在自然界中, 不同分子的内含子间发生同源重组, 导致不同外显子的结合, 是产生新蛋白质的有效途径之一. 与DNA改组不同,外显子改组是靠同一种分子间内含子的同源性带动, 而DNA改组不受任何限制, 发生在整个基因片段上. 外显子改组可用于获得各种大小的随机肽库.2.3 杂合酶杂合酶（hybrid enzyme）〔18〕是把来自不同酶分子中的结构单元（二级结构、三级结构、功能域）或整个酶分子进行组合或交换, 以产生具有所需性质的优化酶杂合体. 有许多途径可以产生杂合酶，如定位诱变、DNA改组、不同分子间交换功能域，甚至整个分子融合. 杂合酶可用于改变酶学或非酶学性质, 是了解酶的结构-功能关系、以及相关酶的结构特征的有力工具，不仅如此，它还可以扩大天然酶的潜在应用，甚至可以产生催化自然界不存在的反应的新酶分子. 杂合酶方法的有效性和实用性已得到了实验的证实〔19～25〕.2.4 体外随机引发重组体外随机引发重组（random\|priming \%in vitro\% recombination, RPR）〔26〕以单链DNA为模板, 配合一套随机序列引物, 先产生大量互补于模板不同位点的短DNA片段, 由于碱基的错配和错误引发, 这些短DNA片段中也会有少量的点突变，在随后的PCR反应中, 它们互为引物进行合成, 伴随组合, 再组装成完整的基因长度. 如果需要, 可反复进行上述过程,直到获得满意的进化酶性质（图2）.该法优于DNA改组法的特点在于：（1） RPR可以利用单链DNA为模板, 故可10～20倍地降低亲本DNA量; （2）在DNA改组中, 片段重新组装前必须彻底除去DNase Ⅰ, 故RPR方法更简单; （3）合成的随机引物具有同样长度, 无顺序倾向性. 在理论上，PCR扩增时模板上每个碱基都应被复制或以相似的频率发生突变; （4）随机引发的DNA合成不受DNA 模板长度的限制.2.5 交错延伸交错延伸（stagger extension process, StEP）〔27〕原理的核心是, 在PCR反应中把常规的退火和延伸合并为一步, 并大大缩短其反应时间(55℃, 5 s), 从而只能合成出非常短的新生链, 经变性的新生链再作为引物与体系内同时存在的不同模板退火而继续延伸. 此过程反复进行, 直到产生完整的基因长度, 结果产生间隔的含不同模板序列的新生DNA 分子(图3).StEP法重组发生在单一试管中, 不需分离亲本DNA和产生的重组DNA. 它采用的是变换模板机制, 这正是逆转录病毒所采用的进化过程〔28〕. 该法简便且有效, 为酶的体外定向进化提供了又一强有力的工具.2.6 酶法体外随机-定位诱变为解决空间结构未知酶的蛋白质工程问题, 我们曾以类胰岛素样人参多肽基因和天冬氨酸酶基因为模型, 探索了一种酶体外诱变的新途径, 即酶法体外随机-定位诱变(random-site-directed mutagenesis)〔29～32〕. 该方法的内涵与酶的体外定向进化类似, 对目的基因既采用随机突变增加突变位点, 以快速产生优质酶,又让其突变受到一定限制, 以减少筛选突变体的工作量. 实际上, 该法也是体外模拟自然进化. 不同点在于，通过控制DNA合成的底物种类和浓度比例实现碱基对的错配.从上述策略不难看出,随着分子生物学技术的发展, 可以更灵活、快速和简便地改造目的基因. 从功能出发, 先获得某优化的突变体, 一方面可快速将其推向应用, 另一方面将对蛋白质的理论研究起到更大的推动作用.-------------------------------------------------------------图1 DNA改组原理图2 体外随机引发重组原理图3 交错延伸原理------------------------------------------------------------- 3 定向进化的选择策略尽管用上述方法可向人类提供新的有价值酶,但酶的功能突变常常被埋没在众多的中性突变和不利突变群中. 采用回交（back-crossing）法，将已进化的子代突变酶基因与野生酶基因重组〔33〕, 可排除这种干扰. 这样, 出现中性突变的频率只是50%, 可全部去除不利突变. 在定向进化中, 尽管突变具有随机性, 但通过选择特定方向的突变限定了进化趋势, 加之控制实验条件, 限定突变种类, 降低突变率, 缩小突变库的容量，这不仅减少了工作量, 更重要的是加快了酶在某一方向的进化速度.通常, 筛选方法必须灵敏,至少与目的性质相关〔34，35〕. Venekei等人〔36〕报道了快速、有效地筛选蛋白水解酶突变体的方法和最佳筛选条件, 主要是利用蛋白酶选择平板初选, 再配合活性染色（activity staining）和X-光片消化分析（X-ray film digestion assay）加以验证, 并检测其活力, 快速筛选了44 000个突变株.Roberts等人〔37〕用嗜菌体表面呈现技术筛选与嗜中性酯酶结合力更强的抑制剂. 从含有4 900个突变体的基因库中，获得与该酶的结合能力高于野生蛋白质3.6×106倍的突变体, 比已报道的任何一个相应的抑制剂高50倍〔38〕.另有一些其他的筛选方法〔39，40〕, 如加入能产生可见光信号的底物〔17〕或利用绿色荧光蛋白的荧光性质〔41〕等. 总之, 选择在酶的体外定向进化中至关重要,直接关系到其成败.------------------------------------------------------------- 4 定向进化的优势、现状和未来较之蛋白质分子的合理设计, 酶的体外定向进化属于非合理设计（irrational design）. 其突出的优点是, 不需事先了解酶的空间结构和催化机制. 它适宜于任何蛋白质分子, 大大地拓宽了蛋白质工程学的研究和应用范围. 特别是它能够解决合理设计所不能解决的问题〔11，42～44〕，使我们能较快、较多地了解蛋白质结构与功能之间的关系，为指导应用（如药物设计等）奠定理论基础.此外,该技术简便、快速、耗资低且有实效. 总之, 酶的体外定向进化是非常有效的更接近于自然进化的蛋白质工程研究的新策略. 它不仅能使酶进化出非天然特性, 还能定向进化某一代谢途径; 不仅能进化出具有单一优良特性的酶, 还可能使已分别优化的酶的两个或多个特性叠加, 产生具有多项优化功能的酶，进而发展和丰富酶类资源; 完全在试管中进行的酶（或蛋白质）的体外定向进化使在自然界需要几百万年的进化过程缩短至几年〔10〕，这无疑是蛋白质工程技术发展的一大飞跃. 目前，对一些酶（或蛋白质）(表1）、砷酸盐解毒途径〔45〕、抗辐射性〔46〕、生物合成途径〔47〕、对映体选择性〔48〕、抗体库〔49〕以及DNA结合位点定向进化〔50〕的可喜成果令众多的相关科学家为之振奋. 可见, 进化能发生在自然界, 也能发生在试管中，它与合理设计互补, 将会使分子生物学家更加得心应手地设计和剪裁酶（或蛋白质）分子, 将使蛋白质工程学更加显示出强大的威力和诱人的前景.表1 酶的体外定向进化应用实例应强调的是, 为了提高酶体外定向进化的成功率, 需注意以下几个关键问题:（1）确定目的酶在所需功能方面的进化程度和潜力; （2）选择一个最接近人们需要的酶分子作为起点（包括用作下一循环的起始突变体），这涉及将酶引入单一的进化途径，如果选择失误, 便可能中途“夭折”; （3）若用于理论研究, 应控制较低的突变率，只有选择最佳进化策略，保证库中所有克隆只含有单一氨基酸取代(每代只有一个氨基酸变化), 那么从一代到另一代的功能变化便能与突变表型一一对应起来; （4）建立有效且灵敏的选择方法, 确保检测出由单一氨基酸取代而引起的功能变化.目前, 已建立了一些酶（或蛋白质）的体外定向进化的有效方法, 但还应探索扩展定向进化潜力的最佳途径和提高对突变的控制能力. 选择方法尚待开发与完善, 有必要发展小型化分析和高度自动化的大规模选择模式, 特别是对那些无明显可借鉴表型的突变体的选择, 可能是今后该领域科学家切实努力的目标.-------------------------------------------------------------。

PCR技术的原理与应用(二)

模板最容易出现的问题
①模板中含有杂蛋白质，②模板中含有Taq酶抑制剂，③模板中蛋白质没有消化除净，特别是染色体中的组蛋白，④在提取制备模板时丢失过多，或吸入酚。⑤模板核酸变性不彻底。在酶和引物质量好时，不出现扩增带，极有可能是标本的消化处理，模板核酸提取过程出了毛病，因而要配制有效而稳定的消化处理液，其程序亦应固定不宜随意更改。
非特异性扩增带出现的对策（三）
嵌套式和半嵌套式PCR对于减少或消除不需要的产物同时提高灵敏度经常是很成功的。首先在常规调价下用第一套跨越目的DNA片段的引物扩增，假象产物经常会与引物中的一条或两条配对，但其内部却是无关序列。接着对一部分反应物－产物混合物进行新一轮扩增，采用的引物与第一对引物内侧的序列配对，在这一轮扩增中只有真正的产物被扩增。这种办法即使在目的产物开始用EB染色检测不到而且有假象带时也常常获得成功。半嵌套式PCR，只第二条引物在目的片段一端的内侧，也同样有效。在基因步行或企图进行5‘或3’端RACE时，由于只有一条引物内部的序列是已知的，经常需要作这种变动。采用嵌套式PCR方法，第一、二轮扩增在第20个循环左右终止而不是象通常的在第30－35个循环终止会获得更好的结果，这样做减少了产生不需要的高分子量带和成片产物的机会。嵌套式PCR极端敏感，在106基因组DNA背景中一个拷贝的病毒基因也能检测到。第二种形式的假象，即所谓的跳跃PCR，可能不能用嵌套式PCR消除。一些延伸不完全的产物可能偶尔与相邻的DNA片段，也许是相似的基因成分重新配对，这样会产生不需要的产物。在这种情况下，一条或两条引物内侧的序列仍旧存在，但扩增产物的大小不同。
PCR引物常见的问题
引物：引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称，是PCR失败或扩增条带不理想、容易弥散的常见原因。有些批号的引物合成质量有问题，两条引物一条浓度高，一条浓度低，造成低效率的不对称扩增，对策为：①选定一个好的引物合成单位。②引物的浓度不仅要看OD值，更要注重引物原液做琼脂糖凝胶电泳，一定要有引物条带出现，而且两引物带的亮度应大体一致，如一条引物有条带，一条引物无条带，此时做PCR有可能失败，应和引物合成单位协商解决。如一条引物亮度高，一条亮度低，在稀释引物时要平衡其浓度。③引物应高浓度小量分装保存，防止多次冻融或长期放冰箱冷藏部分，导致引物变质降解失效。④ 引物设计不合理，如引物长度不够，引物之间形成二聚体等。

脂肪酶的生物学改造

脂肪酶的生物学改造叶纯1，2，王玉娟1*（1.中国科学院合肥物质科学研究院强磁场中心，合肥 230031；2.中国科学技术大学生命科学学院，合肥 230036）摘要：脂肪酶作为重要的生物催化剂，由于其反应条件温和、绿色环保被广泛应用于能源、食品、生物医药等领域，但适用于大型工业生产的经济型脂肪酶仍然有限，如何改造、开发出更多适用于工业生产中的理想型脂肪酶成为近年来研究热点。

综述了脂肪酶结构、催化机理，以及近年来脂肪酶改造的相关技术。

以期给相关科研工作者的未来研究工作以启发。

关键字：油脂；脂肪酶；改造；生物技术The biological modification of lipases and its applicationin oil industryYE Chun1,2,WANG Yujuan1*(1. High Magnetic Field Laboratory, Chinese Academy of Sciences, Hefei 230031, China; 2.School of Life Sciences, University of Science and Technology of China, Hefei 230026, China.) 随着绿色工业概念的提出，以酶作为催化剂的生物催化以其底物的高度选择性、专一性以及产物环境友好型的特点，逐渐成为工业生产中被广泛应用的催化手段。

脂肪酶是工业生产中重要的酶制剂[1]，具有催化特异性高、反应条件温和、副产物少以及环境友好等特点，被广泛应用于工业生产中，但是脂肪酶制剂造价高、酶与底物难分离、多余游离脂肪酶难回收等问题制约了天然脂肪酶的工业应用。

近年来，大量研究致力于对脂肪酶进行改造，生物技术的飞速发展更为为改造出更多适用于工业生产的理想脂肪酶制剂提供了有利的技术支持。

本文将综述脂肪酶的结构、催化机理及利用生物学技术对其进行改造的研究现状，对比各种技术优缺点。