PCR技术介绍和常用方法
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Store:纯化引物在25％乙腈溶液中4℃； 冻干引物于-20℃可保存1-2年，液体状 态于-20℃可保存6个月。不用时应-20℃ 保存。
buffer 10-50mmol/L Tris-HCl(pH8.3-8.8, 20℃)。 Mg2+：for Taq polymerase activity conc.:Low:low activity
专利官司 1987年美国专利局专利授权 1989年，DuPont异议，大小公司对簿公堂，将决定 谁将获得诺贝尔奖。DuPont理由是，1971年PCR•的 雏ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ已由Khorana一系列文章阐明，并公布于众，应 当是公共产权。斯坦福大学Kornberg（研究DNA聚 合酶获诺贝尔奖）也认为，任何具备生物技术知识的 人都可以从Khorana等的文章中推知如何操作PCR。
high: non-specific amplification
dNTPs： 贮备dNTP液：1 mol/L NaOH 调pH至中性。 贮备浓度为5-10mmol/L，终浓度为20-200umol/L， 分装-20℃保存。 4种dNTP浓度应相同。
modified (6) specificity:less than 70% homology with non-specific amplification sequence, or 8bp continuous complementary base
Primer designed with the help of computer
Primer design
Most imp.
(1)length: 20～30bp (2)G+C contents:ATCG random distributed (3)primers : no complementary sequence (4)3‘end of the primer: no modification (5)5‘end of the primer:product length，can be
DNA database conservative region comparision primers or blast
PCR reaction components and their functions
template：ssDNA, dsDNA mRNA needed to be RT as cDNA
原理
类似于DNA的体内复制。首先待扩增 DNA•模板加热变性解链，随之将反应混合物 冷却至某一温度，这一温度可使引物与它的靶
序列发生退火，再将温度升高使退火引物在 DNA聚合酶作用下得以延伸。 这种热变性-复 性-延伸的过程就是一个PCR循环，PCR就是 在合适条件下的这种循环的不断重复。
procedures
美国专利局驳回DuPont异议，地方法院判属Cetus Cetus获胜后马上反诉，指出DuPont已侵犯另一项与 PCR有关的专利并要求对方赔偿以及不再销售与PCR 有关试剂和仪器
PCR发展速度
惊人，没有一种技术能与之相比
引用论文最多、应用范围十分广泛
1993•年度诺贝尔化学奖：Mullis，与开 创了“寡核苷酸基因定点诱变”加拿大 籍英国科学家Michael Smith共获
enzyme
历史
60s-70s：基因的体外分离技术。 Khorana（1971）：美国MIT教授、1968年 诺贝 尔医学奖得主 “经过DNA变性，与合适引物 杂交，用DNA聚合酶延伸引物，并不断重复 该过程便可克隆tRNA基因”。 核酸体外扩增最早设想遗忘:
当时很难进行测序和合成寡核苷酸引物； 当时(1970)Smith等发现了内切酶，体外克 隆基因成为可能
primes
If the PCR product is to be cloned, it is sensible to
include the sequence of unique restriction
enzyme sites within the 5’-ends of the primers.
Can amplify fragments over 10kb in length
samples：from blood,sperm or any other tissue,from older forensic specimens, from ancient biological samples or in the lab. From bacterial colonies or phage plaques. DNA：very stable
PCR 技术介绍和常用方法
PCR(Polymerase Chain Reaction)
Three steps: denaturation, primer annealing, polymerization.
The PCR cycle
95C step to denature the duplex DNA, An annealing step of around 55C to allow the primers to bind, 72C polymerization step. Mg2+,dNTPs are required in addition to template,primers,buffer and
template(DNA or RNA),
primers, Taq enzyme, 10×PCR buffer, Mg++, 5mmol/L dNTPs
pre-denaturation-denature completely
Denaturation annealing Elongation cycles:25-30
Kary Mullis(1985)
发明过程 Mullis 在“偶然想出的聚合酶链反应”一文中写到:
“这种简单得令人惊奇，可以无限量地拷贝DNA 片段的方法是在不可想象的情况下， 即驾车行驶在 月色下的加利福尼亚山间公路上时想出来的”。
发展过程： 开始使用大肠杆菌 DNA聚合酶Klenow片段，
该酶不耐热，每次加热变性DNA后都要重新补加。 耗时、费力、易出错。耐热DNA聚合酶的应用使得 自动化。
buffer 10-50mmol/L Tris-HCl(pH8.3-8.8, 20℃)。 Mg2+：for Taq polymerase activity conc.:Low:low activity
专利官司 1987年美国专利局专利授权 1989年，DuPont异议，大小公司对簿公堂，将决定 谁将获得诺贝尔奖。DuPont理由是，1971年PCR•的 雏ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ已由Khorana一系列文章阐明，并公布于众，应 当是公共产权。斯坦福大学Kornberg（研究DNA聚 合酶获诺贝尔奖）也认为，任何具备生物技术知识的 人都可以从Khorana等的文章中推知如何操作PCR。
high: non-specific amplification
dNTPs： 贮备dNTP液：1 mol/L NaOH 调pH至中性。 贮备浓度为5-10mmol/L，终浓度为20-200umol/L， 分装-20℃保存。 4种dNTP浓度应相同。
modified (6) specificity:less than 70% homology with non-specific amplification sequence, or 8bp continuous complementary base
Primer designed with the help of computer
Primer design
Most imp.
(1)length: 20～30bp (2)G+C contents:ATCG random distributed (3)primers : no complementary sequence (4)3‘end of the primer: no modification (5)5‘end of the primer:product length，can be
DNA database conservative region comparision primers or blast
PCR reaction components and their functions
template：ssDNA, dsDNA mRNA needed to be RT as cDNA
原理
类似于DNA的体内复制。首先待扩增 DNA•模板加热变性解链，随之将反应混合物 冷却至某一温度，这一温度可使引物与它的靶
序列发生退火，再将温度升高使退火引物在 DNA聚合酶作用下得以延伸。 这种热变性-复 性-延伸的过程就是一个PCR循环，PCR就是 在合适条件下的这种循环的不断重复。
procedures
美国专利局驳回DuPont异议，地方法院判属Cetus Cetus获胜后马上反诉，指出DuPont已侵犯另一项与 PCR有关的专利并要求对方赔偿以及不再销售与PCR 有关试剂和仪器
PCR发展速度
惊人，没有一种技术能与之相比
引用论文最多、应用范围十分广泛
1993•年度诺贝尔化学奖：Mullis，与开 创了“寡核苷酸基因定点诱变”加拿大 籍英国科学家Michael Smith共获
enzyme
历史
60s-70s：基因的体外分离技术。 Khorana（1971）：美国MIT教授、1968年 诺贝 尔医学奖得主 “经过DNA变性，与合适引物 杂交，用DNA聚合酶延伸引物，并不断重复 该过程便可克隆tRNA基因”。 核酸体外扩增最早设想遗忘:
当时很难进行测序和合成寡核苷酸引物； 当时(1970)Smith等发现了内切酶，体外克 隆基因成为可能
primes
If the PCR product is to be cloned, it is sensible to
include the sequence of unique restriction
enzyme sites within the 5’-ends of the primers.
Can amplify fragments over 10kb in length
samples：from blood,sperm or any other tissue,from older forensic specimens, from ancient biological samples or in the lab. From bacterial colonies or phage plaques. DNA：very stable
PCR 技术介绍和常用方法
PCR(Polymerase Chain Reaction)
Three steps: denaturation, primer annealing, polymerization.
The PCR cycle
95C step to denature the duplex DNA, An annealing step of around 55C to allow the primers to bind, 72C polymerization step. Mg2+,dNTPs are required in addition to template,primers,buffer and
template(DNA or RNA),
primers, Taq enzyme, 10×PCR buffer, Mg++, 5mmol/L dNTPs
pre-denaturation-denature completely
Denaturation annealing Elongation cycles:25-30
Kary Mullis(1985)
发明过程 Mullis 在“偶然想出的聚合酶链反应”一文中写到:
“这种简单得令人惊奇，可以无限量地拷贝DNA 片段的方法是在不可想象的情况下， 即驾车行驶在 月色下的加利福尼亚山间公路上时想出来的”。
发展过程： 开始使用大肠杆菌 DNA聚合酶Klenow片段，
该酶不耐热，每次加热变性DNA后都要重新补加。 耗时、费力、易出错。耐热DNA聚合酶的应用使得 自动化。