仪器分析10-高效液相色谱

(4) 高灵敏度：高效液相色谱已广泛采用高灵敏度 的检测器，进一步提高了分析的灵敏度。如荧光 检测器灵敏度可达10-11g。另外，用样量小，一般 几个微升。 (5) 适应范围宽：只要求试样能制成溶液，而不需 要气化，因此不受试样挥发性的限制。对于高沸 点、热稳定性差、相对分子量大的有机物 （75% ～ 80% ）原则上都可应用高效液相色谱法 来进行分离、分析。
2.常用固定相与流动相
(1) 常用固定相及其选择 固定相基本要求:
颗粒细而均匀，传质快，机械强度高， 耐高压，化学稳定性好不发生反应。
2.常用固定相与流动相
1）液-固吸附色谱固定相 常用: 硅胶、氧化铝、高分子多孔微球 其次： 分子筛、聚酰胺 • 无定型全多孔微粒硅胶YWG φ5～10μm n:5～2万/米 • 球型全多孔微粒硅胶YQG φ3～10μm n:～8万/米 分离对象：溶于有机溶剂的极性至弱极性的分子型化 合物。 • 高分子多孔微球（有机胶）YSG 分离对象：芳烃、杂环、生物碱、脂溶性生物等
HPLC有以下特点：
(1) 高压：液相色谱法以液体为流动相（称为载液）， 液体流经色谱柱，受到阻力较大，为了迅速地通过 色谱柱，必须对载液施加高压。一般可达150～ 350×105Pa。 (2) 高速：流动相在柱内的流速较经典色谱快得多， 一般可达1～10ml/min。高效液相色谱法所需的分析 时间较之经典液相色谱法少得多，一般少于 1h 。 (3) 高效：近来研究出许多新型固定相，使分离效率 大大提高。
利用组分在极性键合固定相与弱极性或 非极性流动相之间分配系数不同而分离，流 动相极性增大，保留值降低 。
1. 高效液相色谱法类型
极性键合相主要有氰基(-CN)、氨基(-NH2) 键合相。极性键合相常用作正相色谱，基于极 性键合基团与溶质分子间的氢键作用，极性强 的组分保留值较大。 主要靠范德华作用力的定向作用力、诱导 作用力或氢键作用力。
1. 高效液相色谱法类型
（2）按分离机制
按分离机制分，高效液相有吸附色谱 法、分配色谱法、键合相色谱法、离子交 换色谱法、体积排阻色谱法等。其中以键 和色谱法为主。键合色谱法又因固定相的 极性、功能不同又可分为不同类型。
1. 高效液相色谱法类型
1）正相键合相色谱法 固定相的极性大于流动相的极性。
1. 高效液相色谱法类型
除与反相色谱法有相同的影响因素外，主要还 受流动相的pH值的影响。 对于弱酸，当流动相的pH值小于它的pKa值时， 组分以分子形式为主，K值增大，tR 增大；反之， 当pH＜pKa时，组分以离子形式为主，K值变小， tR 减小。对于弱碱，情况相反。 在进行离子抑制色谱法时，流动相的pH需在 2～8之间，超出此范围可能使键合基团脱落。
2.常用固定相与流动相
③ 键合相的优点 柱效高：传质速度比一般液体固定相快； 稳定性：耐溶剂冲洗，耐高温，无固定液流失， 从而提高了色谱柱的稳定性和使用寿命； 应用范围广：改变键合有机分子的结构和基团 的类型，能灵活地改变分离的选择性，适用于分 离几乎所有类型的化合物；且能用各种溶剂作流 动相（梯度洗脱）。
3.高效液相色谱仪
色谱柱的性能除了与固定相性能有关外，还 与填充技术有关。在正常条件下，填料粒度＞ 20µ m时，干法填充制备柱较为合适；颗粒＜ 20µ m时，湿法填充较为理想。
一般说来色谱柱不能反冲，流动相的方向与 柱的填充方向一致，否则反冲会迅速降低柱效。
3.高效液相色谱仪
② 保护柱 为了保护分析柱，常在进样器与分析柱之 间安装保护柱。保护柱是一种消耗性的柱子， 它的长度比较短。虽然保护柱的柱填料与分析 柱一样，但粒径要大得多，这样便于装填它。 保护柱应该经常更换以保持它的良好状态而使 分析柱不被污染。
3.高效液相色谱仪
④ 脱气装臵 HPLC的流动相必须预先脱气，否则容易在系统 内逸出气泡，影响泵的工作及检测结果。 在线脱气
离线脱气
3.高效液相色谱仪
2) 进样系统 进样系统包括进样口、注射器、六通阀和 定量管等，它的作用是把样品有效地送入色谱 柱。进样装臵常见的有隔膜注射进样器、停流 进样器、六通进样阀和自动进样器。
3.高效液相色谱仪
（2）主要部件及功能
• 输液系统
• 进样系统
• 分离系统 • 检测系统
3.高效液相色谱仪
1) 输液系统 ① 高压输液泵 HPLC利用高压输液泵输送流动相通过整 个色谱系统，泵的性能好坏直接影响到整个系 统的质量和分析结果的可靠性，高压输液泵应 具备如下性能： • 压力稳定，能连续工作，无脉冲； • 流量调节准确，范围宽； • 密封性能好、耐腐蚀、耐磨、维修方便等。
3.高效液相色谱仪
高压泵按输液特性分，可分为恒流泵和恒压泵。
恒流泵 主要优点是始终输送恒定流量的液体，与柱压 力的大小和压力的变化无关，因此，保留值的重复 性好，并且基线稳定，能满足高精度分析和梯度洗 脱要求。恒流泵可分为注射泵和往复泵。 恒压泵 能保持输出压力恒定，但其流量则随色谱系统 阻力而变化，故保留时间的重视性差。
1. 高效液相色谱法类型
6）亲和色谱法
是一种利用固定相的结合特性来分离分子 的色谱方法。亲和色谱在凝胶过滤色谱柱上连 接与待分离的物质有一定结合能力的分子，并 且它们的结合是可逆的，在改变流动相条件时 二者还能相互分离。亲和色谱可以用来从混合 物中纯化或浓缩某一分子，也可以用来去除或 减少混合物中某一分子的含量。
2.常用固定相与流动相
(2) 常用流动相及其选择
• 惰性，对样品有较大的溶解度
• 粘度小，扩散系数要大，以减少传质阻力
• 纯度高，成本低 • 沸点低，毒性小
• 对稳定性好，系统适应性好，所选用的检 测器没有干扰
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3.高效液相色谱仪
（1）高效液相色谱仪的组成 HPLC系统一般由高压输液泵、进样装臵、 色谱柱 、检测器、数据记录及处理系统等组成。 其中高压输液泵、色谱柱、检测器是关键部件。 有的仪器还有梯度洗脱装臵、在线脱气机、自动 进样器、预柱或保护柱、柱温控制器等，现代 HPLC仪还有微机控制系统，进行自动化仪器控 制和数据处理。制备型HPLC仪还备有自动馏分 收集装臵。
3.高效液相色谱仪
3.高效液相色谱仪
② 自动进样器 自动进样器可通过计算机自动控制。一批 可以自动进样几十个或上百个，可连续调节， 重复性较高，用于大量样品的常规分析。
3.高效液相色谱仪
3) 分离系统 色谱分离系统包括色谱柱、恒温装臵、保护 柱和连接阀等。分离系统性能的好坏是色谱分析 的关键。采用最佳的色谱分离系统，充分发挥系 统的分离效能是色谱工作中重要的一环。 其中，色谱柱担负分离作用，是色谱系统的 心脏。对色谱柱的要求是柱效高、选择性好、分 析速度快等。
1. 高效液相色谱法类型
（1）按实验目的 分析型色谱和制备型色谱 分析型是用来做样品定性，纯度检测的。
制备型是用来快速分离和纯化产品的。
分析型的样品通量很小，而制备型的通量是分析 型的几百倍上千倍，为了达到这个效果，制备型选用 的是大流速的泵，粗粒径填料，粗管径的色谱柱，以 提高柱子的载样量，同时牺牲的是分离效率，制备型 一次可以制备毫克级的样品，甚至大型的专用制备仪 器可以制备克级的样品
1. 高效液相色谱法类型
5）手性色谱法 手性色谱法分离药物对映体分为间接法和 直接法两种,前者又称手性试剂衍生化法后者 可分为手性流动相添加剂法和手性固定相法， 二者都以现代色谱分离技术为基础,引入不对 称中心,使药物对映体间呈现理化特性的差异, 从而达到拆分的目的。
1. 高效液相色谱法类型
近年来,随着研究的不断深入,手性色谱技 术在拆分、定量药物对映体方面有了迅速发展, 尤其是在分离生物体液中的药物对映体及其药 代动力学中发挥了重要的作用。
2.常用固定相与流动相
2）键合相色谱固定相 ① 化学键合相类型 Si-O-Si-C型
② 性能指标
覆盖率、含碳量
表面覆盖度：参加反应的硅醇基数目，占硅胶表面硅醇基总数 的比例。 作用：决定了键合相是分配还是吸附占主导
封尾：为了减少残余的硅醇基，一般在键合反应后，用三甲 基氯硅烷等小分子进行钝化处理。
1. 高效液相色谱法类型
4）反相离子对色谱法 反相离子对色谱法是把离子对试剂加入极 性流动相中，被分析的样品离子在流动相中与 离子对试剂的反离子生成不带荷电的中性离子 对，从而增加了样品离子在非极性固定相中的 溶解度，使分配系数增加，改善分离效果。
1. 高效液相色谱法类型
该法使反相色谱法得以用于有机酸、碱、 盐的分离，而且可以避免用普通的HPLC仪器 长期进行离子色谱时，流动相（酸、碱）对泵 与流路的腐蚀。这种方法在药物分析中应用很 广，如生物碱、有机酸、磺胺类药物、某些抗 生素与维生素等。
3）反相离子抑制色谱法 在反相色谱法中，通过调节流动相的pH 值，抑制样品组分的解离，增加它在固定相中 的溶解度，以达到分离有机弱酸、弱碱的目的， 这种技术称为离子抑制色谱法。
1. 高效液相色谱法类型
适用范围 适用于3.0≤pKa≤7.0的弱酸及7.0≤pKa≤8.0的弱 碱。对于pKa＜3.0的酸及pKa＞8.0的碱，应采用离 子对色谱法或离子交换色谱法。 抑制剂通过向流动相中加入少量弱酸（常用醋 酸）、弱碱（常用氨水）或缓冲盐（常用磷酸及醋 酸盐）为抑制剂，调节pH值，抑制样品组分的解离， 增加中性分子在流动相中存在的几率。
第10章 高效液相色谱法
主要内容
1
2 3 4 5 高效液相色谱法类型 常用固定相和流动相
高效液相色谱仪
高效液相色谱条件选择 应用与示例
高效液相色谱法概述
高效液相色谱法(high performance liquid chromatography，HPLC)是1964~1965年开始发展 起来的一项新颖快速的分离分析技术。它是在经 典液相色谱法的基础上，引入了气相色谱的理论， 在技术上采用了高压、高效固定相和高灵敏度检 测器，使之发展成为高分离速度、高分辨率、高 效率、高检测灵敏度的液相色谱法，也称为现代 液相色谱法。