酶工程-05电泳

SDS-凝胶电泳原理




聚丙烯酰胺凝胶系统中加入SDS，P电泳迁移 率取决于其分子量，而与形状及所带电荷无关。 加入SDS和巯基乙醇后，巯基乙醇使P二硫键 还原，SDS使氢键、疏水键打开，并结合到P 分子上，形成P-SDS，带上相同密度负电荷， 形状为长椭圆形，短轴一定，长轴长度正比于 P分子量。 分离测定： 测分子量（与标准蛋白比较） 鉴定样品纯度（条带数目） 测定样品P含量：扫描定量（比色）

将支持物与缓冲液调制成适当厚度的薄层进行 电泳。 常用支持物：淀粉、琼脂、纤维素粉、硅胶等 操作： 1 缓冲液选择 离子强度较高的缓冲液 2 支持物处理 精制品 3 薄层板制作 4加样：挖沟、混合样品、填埋 5 电泳 6分析：印染法
五 凝胶电泳



支持物：多孔凝胶 聚丙烯酰胺凝胶、琼脂糖凝胶等 具有电泳和分子筛的双重作用，分辨力高 最常用聚丙烯酰胺凝胶，原因： 机械强度好，透明有弹性，稳定，无吸附作用 和电渗作用，可制成不同孔径的凝胶。 分类：垂直管型盘状电泳、垂直板型电泳； 连续、不连续、梯度、SDS凝胶电泳
二 纸电泳






以滤纸为支持体的电泳技术 操作要点： 1 选择缓冲液 对显色剂和紫外光吸收等观察区带的方法无影 响 A 分离蛋白质，pI≈ 5，选pH8.6的缓冲液 （巴比妥缓冲液pH8.6、硼酸pH8.6、磷酸 pH7.4) B 分离氨基酸：邻苯二甲酸氢钠、磷酸—醋 酸，pH5.9 C 分离核苷酸巴比妥－醋酸pH2.5，柠檬酸 pH2~3 D 分离糖类：HAC-NaAC, pH3~5
③ 可以直接测定天然状态蛋白质的分子量而不需要解离为 亚基，因此这一方法可以与SDS-PAGE测定分子量的方法互 为补充。梯度凝胶电泳主要适用于测定球蛋白的分子量， 而对纤维蛋白将产生较大的误差。 由于分子量的测定必须是在未知和标准蛋白质分子到达完 全被阻止迁移的孔径时才能成立，因此电泳时要使用较高 的电压，例如平板凝胶为0.5mm厚，使用600V电压， 50mA 电流，电泳时间约需2小时。
凝胶电泳的操作要点



1 凝胶制备 2 电极缓冲液 3 样品处理及加样 4 电泳 5 染色与固定 6 脱色 7 分析
烟曲霉菌中抗真菌活性肽类物质的分离与纯化
六 等电点聚焦电泳


电泳系统中加进两性电解质载体，当通已直流 电时，两性电解质载体即形成一个由阳极到阴 极连续增高的pH梯度。P进入时，不同的P移 动到与其等电点相当的pH位置上，从而使不 同等电点的P得以分离。 优点：分辨率高，区带清晰、窄，加样部位自 由，重现性好，可测定P或多肽的等电点。 缺点：需无盐溶液，不适用于在等电点不溶解 或发生变性的P。
梯度凝胶电泳也通常采用聚丙烯酰胺凝胶，但不是在单一浓 度（孔径）的凝胶上进行，而是形成梯度凝胶。从凝胶顶部 到底部丙烯酰胺的浓度呈梯度变化，如通常顶部凝胶浓度为 5％，底部凝胶浓度为25％。 凝胶梯度是通过梯度混合器形成的，高浓度的丙烯酰胺溶液 首先加入到玻璃平板中，而后溶液浓度呈梯度下降，因此在 凝胶的顶部孔径较大，而在凝胶的底部孔径较小。梯度凝胶 电泳也通常加入SDS，并有浓缩胶。电泳过程与SDS－聚丙 烯酰胺凝胶电泳基本类似。与单一浓度的凝胶相比，梯度凝 胶有几个优点：

一 电泳的基本原理
电泳分离： 移动方向：带电性质决定 泳动度：带电颗粒在单位电场强度下的移动速 度。 μ ＝v/E=(d/t)/(V/l)=(dl)/Vt 影响μ的因素： 1颗粒本身：带电、大小、形状 2 外界因素：电场强度E、pH、离子强度I、电 渗、缓冲液粘度及温度等。

电泳技术
1 电泳：带电粒子在电场中向着与其本身电荷 相反的电极移动的过程。 2 电泳技术优点：快速、准确、重现性好 3 电泳方法分类 按电场分：常压（<500V，适用大分子）、高 压（>500V，适用小分子） 支持体分：自由电泳、区带电泳 仪器装置分：水平式、垂直式、悬架式 4 电泳条件：水溶液（缓冲液）、支持物（区 带电泳）、电场（电泳仪、电泳槽）



1 稳定的pH梯度的形成 2 两性电解质载体 要求： 由多乙烯多胺与丙烯酸加成制备（有不同pH 范围的商品两性电解质载体） 3 支持pH梯度的介质 密度梯度溶液（用于自由电泳） 凝胶（如聚丙烯酰胺凝胶） 4 操作要点 pH梯度支持介质的制备 聚焦电泳 检测 两性电解质载体的除去
梯度凝胶电泳
2 滤纸的选择与处理 层析用滤纸，纸宽2～3cm/样品组分，长短影响电场 强度。 3 点样 点圆点（量少）、点条状（一般），点中间（未知样 品）、点一边（已知样品） 干法、湿法 4 电泳 电桥水平、加盖、电压稳定、注意时间 5 显色及分析 蛋白：溴酚兰、氨黑10B、偶氮胭脂红B Aa：茚三酮、靛红 核酸：紫外光下观察 一般洗脱定量

2 不连续电泳中样品压缩成层的原理 不连续电泳含两层或三层不同孔径的凝 胶，用不同pH值的缓冲液： 样品胶：大孔径，pH6.7～6.8Tris-HCl缓 冲液 浓缩胶：与样品胶相同 分离胶：小孔径，pH8.8～8.9 Tris-HCl 缓冲液


样品压缩成层原理：
电极缓冲液：pH8.3Tris-甘氨酸 HCl→ (解离） →Cl － ， Cl －泳动速度最快（快离子） CH2(NH2)COOH → (样品胶、浓缩胶pH6.7~6.8） → CH2(NH2)COO－（0.1％～1.0％）泳动速度最慢（慢 离子） 蛋白质（P）泳动速度介于快慢离子之间 电泳时， Cl －超过P走在最前面，其后形成一个离子 浓度较低的低电导区→较高电位梯度→P和慢离子加 速移动→P压缩成层 样品进入分离胶后，pH为9.5（电泳过程实测）， CH2(NH2)COO－增加，泳动速度增大，很快超过P， P 在均一的电位梯度和pH条件下分离
电泳技术思考题


1名词解释 电泳、电泳分离技术、泳动度、电渗、区带电 泳、相对迁移率、不连续凝胶电泳 2 影响泳动度的主要因素有哪些？ 3 区带电泳的操作步骤一般有哪些？ 4 如何制备聚丙烯酰胺凝胶？ 5 不连续电泳样品压缩成层原理。 6 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳原理。 7 采用电泳技术如何测定蛋白质分子量？如何 测定蛋白质等电点？
② 另一个优点是梯度凝胶可以分辨分子量相差较小，在单一 浓度凝胶中不能分辨的蛋白质。电泳过程中，蛋白质在梯度 凝胶中迁移，经过的孔径越来越小，直到凝胶的孔径不能通 透，这样电泳过程中蛋白质就被浓缩，集中在一个很窄的区 带中。而分子量略小的蛋白质可以迁移得更靠前一些，被集 中在略前面的区带中。由于梯度凝胶孔径逐步变小，在蛋白 质不能通透的孔径附近对蛋白有浓缩作用，所以电泳后形成 很窄的区带，可以分辨出分子量相差较小的蛋白质。对于太 稀的样品，在电泳过程中可以将样品分几次加样，大小不同 的蛋白质分子最终都会滞留在其相应的凝胶孔径中而得到分 离。
①首先，梯度凝胶比单一浓度凝胶的分离范围更宽，可以 同时分离较大范围分子量的蛋白质。单一凝胶电泳对于分 子量超过其分离范围的蛋白质，过大或过小，都不能分离。 而梯度凝胶孔径范围比单一凝胶大，分子量较大的蛋白质 可以在凝胶顶部大孔径部分得到分离，而分子量较小的蛋 白质可以在凝胶底部小孔径部分得到分离，所以分子量较 大和较小的蛋白质可以同时得到分离。例如用4％～30％ 的梯度胶可以分离分子量5万～200万的蛋白质。



1 聚丙烯酰胺凝胶的制备 丙稀酰胺（单体）＋N,N-甲叉双丙稀酰胺 （交联剂）→（催化剂） →聚合 催化剂： （1）过硫酸铵＋四甲基乙二胺（TEMED） （2）核黄素（VitB2）＋光 改变单体浓度可改变凝胶孔径 交联剂对孔径有影响：5％最小 根据要分离物质的相对分子质量选择合适 的单体浓度。

三 薄膜电泳

支持体：薄膜 优点：分辨力较高、简便、快速、区带清晰、 易于定量、便于保存 广泛应用于蛋白质和同工酶等的分离分析 操作 1 薄膜的处理与放置 2 点样 平衡 3 电泳：E 10~25V/cm，0.5～2h 4 显色
Hale Waihona Puke Baidu
四 薄层电泳