大蒜病毒的快速检测
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收 稿 日期 ： ２ ０ ｌ ２一Ｏ ６—２ ５
作者简介： 王采炜 （ １ ９ ８ ７一 ） ， 女， 重庆人， 硕士生， 研究方 向为植物学
４ ２
淮北 师 范大 学 学报 （ 自然科 学版 ）
２ ０ １ ３年
大蒜 新 型 病 毒 上 游 引物 Ｎ Ｔ １ ： Ｃ ｃ ｔ Ｇ ｅ ｔ Ａ ａ ｇ Ｃ ｔ ａ Ｔ ａ ｔ Ｇ ｃ ｔ Ｇ ａ和下 游 引物 Ｎ Ｔ ２ ： Ｇ ｔ ａ Ａ ｇ ｔ Ｔ ｔ ａ Ｇ ｃ ｇ Ａ ｔ ａ Ｔ ｃ ａ Ａ ｃ ．
供技 术 支持 ． 关键词： 大蒜； 病毒检测； Ｒ Ｔ—Ｐ Ｃ Ｒ 中 图 分 类号 ： Ｓ ６ ３ ３ ． ４ 文 献标 识码 ： Ａ 文章编号： ２ ０ ９ ５— ０ ６ ９ １ （ ２ ０ １ ３ ） ０ １ —０ ０ ４ １ — ０ ５
大蒜 （ Ａ ｌ ｌ ｉ ｕ ｍ ｓ ａ ｔ ｉ ｖ ｕ ｍ Ｌ ． ） 属 于 百合 科 （ １ ｉ ｌ ｉ ａ ｃ ｅ ｎ ｅ ） 中的葱 属 （ Ａ ｌ ｌ ｉ ｕ ｍ ｓ Ｐ Ｐ ． ） ， 多年生 草本 植物 ． 大 蒜是 一 种 花
分析我国大蒜的主要病毒 类型， 在此基础上优化 Ｒ Ｔ—Ｐ Ｃ Ｒ方法， 建立大蒜病毒 的快速检测方法． 传统 Ｒ Ｔ— Ｐ Ｃ Ｒ扩增
到的序列经测序分析表明我 国大蒜 主要病毒类 型为大蒜潜 隐病毒 Ｇ Ｌ Ｖ、 马铃薯 Ｙ型病毒和大蒜新型病毒， 通过优化 Ｒ Ｔ—Ｐ Ｃ Ｒ方法 、 扩增模板 、 反应体 系和循环次数， 结果表 明采用 两步法 Ｒ Ｔ—Ｐ Ｃ Ｒ方法 ， 直接 以 Ｒ Ｎ Ａ酶 Ａ处 理的大蒜 叶片 Ｔ ｒ ｉ ｚ ｏ ｌ 裂解液为模板 ， 经过 ４ ０— ４ ５轮扩增循环， 可 以扩增到我 国主要 ３种大蒜病毒， 这为大蒜病毒的快速诊断提
道 的方法 ．
１ 材 料 与方 法
１ ． １ 材料
植物材料： 大蒜一共 ４ 个样品， 分别购 自贵州、 陕西、 四川 、 重庆． 引物 、 酶和试剂： 用于马铃薯 Ｙ型病毒
扩增上游引物 Ｐ Ｔ Ｉ ： Ａ ａ ｇ Ａ ｇ ｔ Ｃ ａ ａ Ｃ ａ ｃ Ｔ ｔ ａ Ｇ ｔ ｔ Ｔ ｇ 和下游引物 Ｐ Ｔ ２ ： Ｇ ｇ ｔ Ｃ ｔ ｃ Ａ ａ ｔ Ｃ ｃ ｔ Ａ ｇ ｃ Ｔ ａ ｇ Ｔ ｃ ． 扩增大蒜 潜 隐 病 毒上 游 引 物 Ｃ Ｔ Ｉ ： Ａ ｇ ａ Ｇ ｃ ｔ Ａ ａ ｇ Ａ ｇ ｔ Ａ ｔ ｔ Ｇ ｇ ｔ Ａ ｇ和下 游 引 物 Ｃ Ｔ ２ ： Ｇ ｇ ｇ Ｔ ｔ ｔ Ｃ ａ ｃ Ａｔ ｔ Ｇ ｔ ｔ Ａ ｃ ａ Ｃ ｃ ． 扩 增
第３ ４卷第 １ 期
２ ０ １ ３年 ３月
淮北 师 范大学 学报 （ 自然科 学版 ）
Ｊ ｏ ｕ ｎａ ｒ ｌ ｏ ｆ Ｈ ｕ ａ ｉ ｂ ｅ ｉ Ｎ ｏ ｒ ｍ ａ ｌ Ｕ ｎ ｉ ｖ ｅ ｒ ｓ ｉ ｔ ｙ（ Ｎ ａ ｔ ｕ ｒ ａ ｌ Ｓ ｃ ｉ ｅ ｎ ｃ ｅ ）
粉败育型植物， 主要利用鳞茎进行无性繁殖， 因鳞茎母体带病毒 ， 以垂直传染方式传给后代， 致使大蒜体 内 病毒 浓度逐代累积增高， 产量及 品质逐年降低 ． 目前侵染大蒜的病毒主要有： 马铃薯 Ｙ病毒属 、 香石竹潜隐 病毒属 、 青葱 ｘ病毒属成员． 中国报道的主要大蒜病毒种类有： 韭葱黄条斑病毒 （ Ｌ Ｙ Ｓ Ｖ ） ， 洋葱螨传潜隐病毒 （ Ｏ Ｍ ｂ Ｆ Ｖ ） 和洋葱黄矮病毒 （ Ｏ Ｙ Ｄ Ｖ ） ， 大蒜普通潜隐病毒 （ Ｇ Ｃ Ｌ Ｖ ）和青葱潜隐病毒（ Ｓ Ｌ Ｖ ） ｎ １ ． 多数未经选择的
商 品蒜感 染两 种甚 至两 种 以上 病毒 ， 并 且病 毒侵 染后 其症 状也 不 易 区分 ． 例 如大蒜 普 通潜 隐病 毒 Ｇ Ｃ Ｌ Ｖ单
独侵染大蒜后多不表现症状， 若与马铃薯 Ｙ病毒复合侵染时则表现 出严 重黄化， 花叶症状…． Ｇ Ｃ Ｌ Ｖ不仅侵 染大蒜还侵染其他葱属植物 １ ， 日本、 荷兰 、 德国、 韩国、 印度尼西亚都有报道【 ５ － ８ 】 ． 目前国内针对植物病毒 的检疫方法主要有： 鉴别寄主反应 、 电镜观察 、 血清学试验和分子生物学检测手 段【 ９ 】 ． 聚合 酶链 式 反应 是一 种 特 异性 扩增 Ｄ Ｎ Ａ或 Ｒ Ｎ Ａ 片段 的方 法 ， 因其 具 有快 速 、 特异性 高 、 灵 敏度 高 等 诸 多 优 点， 已被 广 泛 应用 于植 物 病 毒 的诊 断和 检测 ［ １ Ｏ １ ． Ｓ ａ ｉ ｋ ｉ 等于 １ ９ ９ ８年 首创 反转 录 一聚 合 酶链 式 反 应 技 术， 先将 ｍ Ｒ Ｎ Ａ逆反转录为 ｃ Ｄ Ｎ Ａ ， 再做 Ｐ Ｃ Ｒ扩增， 经 电泳即可得到待检测的 Ｄ Ｎ Ａ片段． 常规 Ｐ Ｃ Ｒ只能检测 植物 Ｄ Ｎ Ａ病毒， Ｒ Ｔ — Ｐ Ｃ Ｒ可检测植物 Ｒ Ｎ Ａ病毒， 已经成功地运用到不 同植 物的病毒检测 中【 ¨ ． Ｔ ｈ ｏ ｒ 等 人应用此技术鉴定了巴西产区大蒜上的马铃薯 Ｙ病毒属和香石竹潜隐病毒属的几种病毒【 １ ３ １ ， Ｔ ａ ｋ ａ ｋ ｉ 等人对 洋 葱 黄 矮病 毒进 行 了 Ｒ Ｔ— Ｐ Ｃ Ｒ全序 列 扩增 ｎ ． 本 实 验先 运 用 传 统 的 Ｒ Ｔ—Ｐ Ｃ Ｒ法 检 测到 了 ３种 大蒜 病 毒 ， 在 此基 础 上进 行实 验方 法 的改 进 和 优化 ， 建立 一套 快速 检 测 大蒜 病毒 的方法 ， 在操 作 上 、
Ｍａ ｒ ． ２ ０１ ３
大蒜病毒 的快速检测
王采炜 ， 孙 浩
（ 淮北师范大学 生命科学学 院 资源植物生物学安徽省重点实验室， 安徽 淮北 ２ ３ ５ ０ ０ ０ ）
摘 要： 为建立一种快速便捷 的检测 大蒜病毒的方法， 首先 以 ４个大蒜 产区的蒜种为材料采用传统的 Ｒ Ｔ—Ｐ Ｃ Ｒ方法
作者简介： 王采炜 （ １ ９ ８ ７一 ） ， 女， 重庆人， 硕士生， 研究方 向为植物学
４ ２
淮北 师 范大 学 学报 （ 自然科 学版 ）
２ ０ １ ３年
大蒜 新 型 病 毒 上 游 引物 Ｎ Ｔ １ ： Ｃ ｃ ｔ Ｇ ｅ ｔ Ａ ａ ｇ Ｃ ｔ ａ Ｔ ａ ｔ Ｇ ｃ ｔ Ｇ ａ和下 游 引物 Ｎ Ｔ ２ ： Ｇ ｔ ａ Ａ ｇ ｔ Ｔ ｔ ａ Ｇ ｃ ｇ Ａ ｔ ａ Ｔ ｃ ａ Ａ ｃ ．
供技 术 支持 ． 关键词： 大蒜； 病毒检测； Ｒ Ｔ—Ｐ Ｃ Ｒ 中 图 分 类号 ： Ｓ ６ ３ ３ ． ４ 文 献标 识码 ： Ａ 文章编号： ２ ０ ９ ５— ０ ６ ９ １ （ ２ ０ １ ３ ） ０ １ —０ ０ ４ １ — ０ ５
大蒜 （ Ａ ｌ ｌ ｉ ｕ ｍ ｓ ａ ｔ ｉ ｖ ｕ ｍ Ｌ ． ） 属 于 百合 科 （ １ ｉ ｌ ｉ ａ ｃ ｅ ｎ ｅ ） 中的葱 属 （ Ａ ｌ ｌ ｉ ｕ ｍ ｓ Ｐ Ｐ ． ） ， 多年生 草本 植物 ． 大 蒜是 一 种 花
分析我国大蒜的主要病毒 类型， 在此基础上优化 Ｒ Ｔ—Ｐ Ｃ Ｒ方法， 建立大蒜病毒 的快速检测方法． 传统 Ｒ Ｔ— Ｐ Ｃ Ｒ扩增
到的序列经测序分析表明我 国大蒜 主要病毒类 型为大蒜潜 隐病毒 Ｇ Ｌ Ｖ、 马铃薯 Ｙ型病毒和大蒜新型病毒， 通过优化 Ｒ Ｔ—Ｐ Ｃ Ｒ方法 、 扩增模板 、 反应体 系和循环次数， 结果表 明采用 两步法 Ｒ Ｔ—Ｐ Ｃ Ｒ方法 ， 直接 以 Ｒ Ｎ Ａ酶 Ａ处 理的大蒜 叶片 Ｔ ｒ ｉ ｚ ｏ ｌ 裂解液为模板 ， 经过 ４ ０— ４ ５轮扩增循环， 可 以扩增到我 国主要 ３种大蒜病毒， 这为大蒜病毒的快速诊断提
道 的方法 ．
１ 材 料 与方 法
１ ． １ 材料
植物材料： 大蒜一共 ４ 个样品， 分别购 自贵州、 陕西、 四川 、 重庆． 引物 、 酶和试剂： 用于马铃薯 Ｙ型病毒
扩增上游引物 Ｐ Ｔ Ｉ ： Ａ ａ ｇ Ａ ｇ ｔ Ｃ ａ ａ Ｃ ａ ｃ Ｔ ｔ ａ Ｇ ｔ ｔ Ｔ ｇ 和下游引物 Ｐ Ｔ ２ ： Ｇ ｇ ｔ Ｃ ｔ ｃ Ａ ａ ｔ Ｃ ｃ ｔ Ａ ｇ ｃ Ｔ ａ ｇ Ｔ ｃ ． 扩增大蒜 潜 隐 病 毒上 游 引 物 Ｃ Ｔ Ｉ ： Ａ ｇ ａ Ｇ ｃ ｔ Ａ ａ ｇ Ａ ｇ ｔ Ａ ｔ ｔ Ｇ ｇ ｔ Ａ ｇ和下 游 引 物 Ｃ Ｔ ２ ： Ｇ ｇ ｇ Ｔ ｔ ｔ Ｃ ａ ｃ Ａｔ ｔ Ｇ ｔ ｔ Ａ ｃ ａ Ｃ ｃ ． 扩 增
第３ ４卷第 １ 期
２ ０ １ ３年 ３月
淮北 师 范大学 学报 （ 自然科 学版 ）
Ｊ ｏ ｕ ｎａ ｒ ｌ ｏ ｆ Ｈ ｕ ａ ｉ ｂ ｅ ｉ Ｎ ｏ ｒ ｍ ａ ｌ Ｕ ｎ ｉ ｖ ｅ ｒ ｓ ｉ ｔ ｙ（ Ｎ ａ ｔ ｕ ｒ ａ ｌ Ｓ ｃ ｉ ｅ ｎ ｃ ｅ ）
粉败育型植物， 主要利用鳞茎进行无性繁殖， 因鳞茎母体带病毒 ， 以垂直传染方式传给后代， 致使大蒜体 内 病毒 浓度逐代累积增高， 产量及 品质逐年降低 ． 目前侵染大蒜的病毒主要有： 马铃薯 Ｙ病毒属 、 香石竹潜隐 病毒属 、 青葱 ｘ病毒属成员． 中国报道的主要大蒜病毒种类有： 韭葱黄条斑病毒 （ Ｌ Ｙ Ｓ Ｖ ） ， 洋葱螨传潜隐病毒 （ Ｏ Ｍ ｂ Ｆ Ｖ ） 和洋葱黄矮病毒 （ Ｏ Ｙ Ｄ Ｖ ） ， 大蒜普通潜隐病毒 （ Ｇ Ｃ Ｌ Ｖ ）和青葱潜隐病毒（ Ｓ Ｌ Ｖ ） ｎ １ ． 多数未经选择的
商 品蒜感 染两 种甚 至两 种 以上 病毒 ， 并 且病 毒侵 染后 其症 状也 不 易 区分 ． 例 如大蒜 普 通潜 隐病 毒 Ｇ Ｃ Ｌ Ｖ单
独侵染大蒜后多不表现症状， 若与马铃薯 Ｙ病毒复合侵染时则表现 出严 重黄化， 花叶症状…． Ｇ Ｃ Ｌ Ｖ不仅侵 染大蒜还侵染其他葱属植物 １ ， 日本、 荷兰 、 德国、 韩国、 印度尼西亚都有报道【 ５ － ８ 】 ． 目前国内针对植物病毒 的检疫方法主要有： 鉴别寄主反应 、 电镜观察 、 血清学试验和分子生物学检测手 段【 ９ 】 ． 聚合 酶链 式 反应 是一 种 特 异性 扩增 Ｄ Ｎ Ａ或 Ｒ Ｎ Ａ 片段 的方 法 ， 因其 具 有快 速 、 特异性 高 、 灵 敏度 高 等 诸 多 优 点， 已被 广 泛 应用 于植 物 病 毒 的诊 断和 检测 ［ １ Ｏ １ ． Ｓ ａ ｉ ｋ ｉ 等于 １ ９ ９ ８年 首创 反转 录 一聚 合 酶链 式 反 应 技 术， 先将 ｍ Ｒ Ｎ Ａ逆反转录为 ｃ Ｄ Ｎ Ａ ， 再做 Ｐ Ｃ Ｒ扩增， 经 电泳即可得到待检测的 Ｄ Ｎ Ａ片段． 常规 Ｐ Ｃ Ｒ只能检测 植物 Ｄ Ｎ Ａ病毒， Ｒ Ｔ — Ｐ Ｃ Ｒ可检测植物 Ｒ Ｎ Ａ病毒， 已经成功地运用到不 同植 物的病毒检测 中【 ¨ ． Ｔ ｈ ｏ ｒ 等 人应用此技术鉴定了巴西产区大蒜上的马铃薯 Ｙ病毒属和香石竹潜隐病毒属的几种病毒【 １ ３ １ ， Ｔ ａ ｋ ａ ｋ ｉ 等人对 洋 葱 黄 矮病 毒进 行 了 Ｒ Ｔ— Ｐ Ｃ Ｒ全序 列 扩增 ｎ ． 本 实 验先 运 用 传 统 的 Ｒ Ｔ—Ｐ Ｃ Ｒ法 检 测到 了 ３种 大蒜 病 毒 ， 在 此基 础 上进 行实 验方 法 的改 进 和 优化 ， 建立 一套 快速 检 测 大蒜 病毒 的方法 ， 在操 作 上 、
Ｍａ ｒ ． ２ ０１ ３
大蒜病毒 的快速检测
王采炜 ， 孙 浩
（ 淮北师范大学 生命科学学 院 资源植物生物学安徽省重点实验室， 安徽 淮北 ２ ３ ５ ０ ０ ０ ）
摘 要： 为建立一种快速便捷 的检测 大蒜病毒的方法， 首先 以 ４个大蒜 产区的蒜种为材料采用传统的 Ｒ Ｔ—Ｐ Ｃ Ｒ方法