SDS-聚丙烯酰胺凝胶pH对黄瓜蛋白质双向电泳图谱的影响
(免费共享)SDS-PEGA聚丙烯酰胺凝胶电泳常见问题及分析
常见问题及分析1. 配胶缓冲液系统对电泳的影响？在SDS－PAGE不连续电泳中，制胶缓冲液使用的是Tris－HCL缓冲系统，浓缩胶是pH6.7，分离胶pH8.9；而电泳缓冲液使用的Tris－甘氨酸缓冲系统。
在浓缩胶中，其pH 环境呈弱酸性，因此甘氨酸解离很少，其在电场的作用下，泳动效率低；而CL离子却很高，两者之间形成导电性较低的区带，蛋白分子就介于二者之间泳动。
由于导电性与电场强度成反比，这一区带便形成了较高的电压梯度，压着蛋白质分子聚集到一起，浓缩为一狭窄的区带。
当样品进入分离胶后，由于胶中pH的增加，呈碱性，甘氨酸大量解离，泳动速率增加，直接紧随氯离子之后，同时由于分离胶孔径的缩小，在电场的作用下，蛋白分子根据其固有的带电性和分子大小进行分离。
所以，pH对整个反应体系的影响是至关重要的，实验中在排除其他因素之后仍不能很好解决问题的情况，应首要考虑该因素。
2. 样品如何处理？根据样品分离目的不同，主要有三种处理方法：还原SDS处理、非还原SDS处理、带有烷基化作用的还原SDS处理。
1) 还原SDS处理：在上样buffer中加入SDS和DTT（或Beta巯基乙醇）后，蛋白质构象被解离，电荷被中和，形成SDS与蛋白相结合的分子，在电泳中，只根据分子量来分离。
一般电泳均按这种方式处理，样品稀释适当浓度，加入上样Buffer，离心，沸水煮5min，再离心加样。
2) 带有烷基化作用的还原SDS处理：碘乙酸胺的烷基化作用可以很好的并经久牢固的保护SH基团，得到较窄的谱带；另碘乙酸胺可捕集过量的DTT，而防止银染时的纹理现象。
100ul样品缓冲液中10ul 20%的碘乙酸胺，并在室温保温30min。
3) 非还原SDS处理：生理体液、血清、尿素等样品，一般只用1%SDS沸水中煮3min，未加还原剂，因而蛋白折叠未被破坏，不可作为测定分子量来使用。
3. SDS-PAGE电泳凝胶中各主要成分的作用？聚丙烯酰胺的作用：丙烯酰胺与为蛋白质电泳提供载体，其凝固的好坏直接关系到电泳成功与否，与促凝剂及环境密切相关；制胶缓冲液：浓缩胶选择pH6.7，分离胶选择pH8.9，选择tris－HCL系统，TEMED 与AP：AP提供自由基，TEMED是催化剂，催化自由基引起的聚合反应进行；十二烷基磺酸钠（SDS）：阴离子去污剂，作用有四：去蛋白质电荷、解离蛋白质之间的氢键、取消蛋白分子内的疏水作用、去多肽折叠。
聚丙烯酰胺凝胶电泳操作复杂的原因
聚丙烯酰胺凝胶电泳操作复杂的原因
聚丙烯酰胺凝胶电泳操作复杂的原因主要有：
1.聚丙烯酰胺凝胶是一种高分子聚合物，其制备和操作需要精细的化学反应条件。
制备过程中，凝胶的浓度、交联剂的用量、反应温度和时间等都需要精确控制，以确保凝胶的质量和稳定性。
2.聚丙烯酰胺凝胶电泳过程中，蛋白质的迁移速度受到凝胶孔径大小、电荷、缓冲液pH值和离子浓度等多种因素的影响。
这些因素需要精确控制，以确保蛋白质的正确分离和鉴定。
3.聚丙烯酰胺凝胶电泳通常需要进行染色或检测，以便观察和鉴定蛋白质。
这些检测方法需要特定的试剂和设备，并且需要进行精确的操作，以确保结果的准确性和可靠性。
4.聚丙烯酰胺凝胶电泳的实验操作需要高度的技术水平和经验。
操作者需要了解凝胶电泳的原理和操作方法，并能够正确地操作凝胶电泳仪、添加样品、进行染色或检测等步骤。
因此，聚丙烯酰胺凝胶电泳的操作相对复杂，需要操作者具备较高的技术水平和丰富的经验。
同时，为了获得准确的结果，操作者还需要对实验条件和操作过程进行严格的控制和管理。
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质的相对分子质量解析
【实验步骤及操作方法】
1.安装垂直板电泳槽 将密封胶条放在平直玻璃板上，将凹形
玻璃板与 平直玻璃板重叠。 用手将两块玻璃板夹住，放入电泳槽内。 用蒸馏水检漏
2.电泳缓冲液（Tris-甘氨酸缓冲液，pH=8.3）：取 Tris6.0g，甘氨酸28.8g，SDS1.0g，用去离子水 溶解后定容至1L。
3.样品溶解液（用于溶解标准蛋白质及样品蛋白 质）：取SDS0.1g，巯基乙醇0.1mL，甘油 1.0mL，溴酚蓝28.8g，0.2mol/L磷酸缓冲液 0.5mL，加重蒸馏水至10mL。
【试剂配制】
4. 染 色 液 ： 0.25g 考 马 斯 亮 蓝 R-250 ， 加 入 454mL50%甲醇溶液和46mL冰乙酸。
5.脱色液：75mL冰乙酸，875mL水与50mL甲醇 6.10% 过 硫 酸 钠 、 10%SDS 、 1% 四 甲 基 乙 二 胺
（TEMED）
【实验材料及预处理】
蛋白质相对分子质量的测定 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法
【实验目的】
• 理解电泳法测定蛋白质分子量的原理。 • 掌握SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法的基本操
作 • 学会绘制标准曲线。
【实验原理】
聚丙烯酰胺凝胶由丙烯酰胺（Acr）和N，N-甲叉双 丙烯酰胺（Bis）聚合而成，是一种具有交叉网状结构的 凝胶，可以产生分子筛效应，其孔径大小可以通过配置 药品的浓度来控制，常用作电泳的载体。
因此，我们可以测定标准蛋白质的迁移率，通过标 准蛋白质相对迁移率的对数对相对分子量作图，得到标 准曲线，根据标准曲线计算出未知蛋白质的相对分子质 量。
SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳技术在蛋白质分析中的应用
SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳技术在蛋白质分析中的应用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）是一种常用的蛋白质分析技术，广泛应用于生物化学和分子生物学研究领域。
本文将介绍SDS-PAGE技术的原理、步骤和在蛋白质分析中的应用。
一、SDS-PAGE技术原理SDS-PAGE是一种基于凝胶电泳的蛋白质分离方法。
其原理主要包括以下几个方面：1. 阳极和阴极：SDS-PAGE通常使用一根阳极和一根阴极来建立电场。
蛋白质在电场中受到电荷的作用向阳极（正极）方向迁移。
2. 胶状物质：SDS-PAGE通常使用聚丙烯酰胺凝胶作为载体。
这种凝胶具有延展性和孔隙性，可用于分离不同大小的蛋白质。
3. SDS：SDS（十二烷基硫酸钠）是SDS-PAGE中使用的表面活性剂。
SDS与蛋白质结合形成带负电荷的复合物，使蛋白质在电场中获得了净负电荷。
4. 分子量标记物：SDS-PAGE通常在凝胶中加入已知分子量的蛋白质标准，用于推断待测蛋白质的分子量。
二、SDS-PAGE技术步骤SDS-PAGE技术一般包括以下步骤：1. 样品制备：将待测的蛋白质样品进行处理，如加入SDS和还原剂（如二巯基乙醇）使蛋白质变为线性形式。
2. 凝胶制备：制备聚丙烯酰胺凝胶，一般使用垂直凝胶电泳系统。
将聚丙烯酰胺溶液与启动聚合剂和TEMED混合，然后注入凝胶封闭装置。
3. 样品加载：将样品加入凝胶孔洞中，一般使用微量移液器逐孔加入，并同时加入已知分子量的蛋白质标准。
4. 电泳：将装有样品的凝胶装置放入电泳槽中，将电源接通，设定合适的电压和电流。
经过一段时间的电泳，蛋白质将根据其分子量迁移至不同的位置。
5. 凝胶染色和分析：将电泳结束的凝胶用染色剂（如Coomassie蓝）染色，可使蛋白质呈现出明显的蓝色条带。
通过比较标准品条带与待测蛋白质的条带位置，可以推断出待测蛋白质的分子量。
三、SDS-PAGE技术在蛋白质分析中的应用SDS-PAGE技术在蛋白质分析中具有广泛的应用，包括以下几个方面：1. 分离和纯化：SDS-PAGE可以将复杂混合物中的蛋白质分离出来，并可根据其迁移位置进行纯化。
sds-聚丙烯酰胺凝胶电泳实验报告.
sds-聚丙烯酰胺凝胶电泳实验报告.
实验目的：通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳技术，分离蛋白质并测定分子量。
实验原理：SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳是一种分离蛋白质的标准方法，可对不同来源和大小的蛋白质进行分离和鉴定。
在本实验中，通过将蛋白质溶解于含有SDS和2-巯基乙醇等条件下的试样缓冲液中，以使蛋白质带有几乎相同的负电荷，通过电泳使蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中以大小不同的分子量在电场作用下移动，最终被染色，进行分离鉴定。
实验步骤：
1.准备实验材料：SDS-PAGE电泳装置、试样缓冲液、聚丙烯酰胺凝胶、蛋白质样品、电泳缓冲液等。
2.制备SDS-PAGE电泳凝胶：按照说明书，将聚丙烯酰胺凝胶拆封并放置在实验室温度下一段时间，使其柔软。
3.制备电泳缓冲液：按照说明书，取适量的Tris、glycine和SDS等物质，配制电泳缓冲液，使其达到所需浓度。
4.制备试样缓冲液：按照说明书，取适量的Tris、SDS和2-巯基乙醇等物质，配制试样缓冲液。
5.制备样品：取适量的蛋白质样品，在试样缓冲液中煮沸一段时间，使蛋白质分子展开。
6.装样：将制备好的样品加入聚丙烯酰胺凝胶电泳装置样品槽中。
7.电泳：按照说明书，调整电泳缓冲液pH值和电泳电压等条件，开启电泳装置，进行电泳操作。
8.染色：将电泳板取出，进行荧光染色或银染色法。
9.图像处理：使用图像分析系统或其他软件，进行蛋白质条带的分析和图像处理。
实验结果：经过SDS-PAGE电泳后，样品中的蛋白质在凝胶中呈现出大小不同的分子量条带，通过荧光染色或银染色可以清晰地看到分离的蛋白质条带。
根据蛋白质的分子量大小，可以判断样品中含有哪些蛋白质。
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳
做标准曲线
以标准蛋白的迁பைடு நூலகம்率为横坐标，以其对应的相对分子质 量的对数为纵坐标 ，制作标准曲线，
图2：标准曲线
样品蛋白相对分子质量的确定：
根据未知样品迁移率，利用标准曲线计算样品相对 分子质量。
表2：样品蛋白的迁移率及相对分子质量
样品蛋白 移动距离cm 溴酚蓝指示剂前 沿距离cm 相对迁移率 LgMr Mr 1 2 3 4 5
注意： 染色可以重复使用，染色完成以后回收入试剂瓶，染色 后准备配制漂洗液。每组150mL。
结果
图1：电泳图谱
计算迁移率
精确测量溴酚蓝染料 和各种标准蛋白移动的距 离，根据公式，计算各种 蛋白质的相对迁移率。
迁移率= 蛋白质样品的移动距离(cm) 染料的移动距离(cm)
表1：标准蛋白的迁移率(Rf值)
当蛋白质的分子量在15～200KD之间时，电泳迁移率与分子量的对 数呈直线关系，符合下列方程式
其中：MW为蛋白质分子量，Mr为相对迁移率，b为斜率，k为截距。在条 件一定时，b和K均为常数。 Mr=
lgMW=-b· Mr+K
蛋白质样品的迁移距离(cm) 染料的迁移距离(cm) 若将已知分子量的标准蛋白质 的迁移率对分子量的对数作图， 可获得一条标准曲线。未知蛋 白质的相同条件下进行电泳， 根据它的电泳迁移率即可在标 准曲线上求得分子量。
分离胶和浓缩胶
浓缩胶和分离胶的配制
组分 蒸馏水/ml 分离胶(下层胶)缓冲溶液(pH8.8)/mL 浓缩胶(上层胶)缓冲溶液(pH6.8)/mL 凝胶贮备液/mL TEMED/mL 10%过硫酸胺/mL 总体积、ml 12.5%分离胶 5.3 4.0 － 6.7 0.002 0.2 16 5%浓缩胶 2.95 － 1.25 0.8 0.001 0.1 5
(完整版)SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳实验报告
分子生物学实验报告实验名称：SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳班级：生工xxx姓名：xxx同组人：xxx学号：xxxx日期：xxxxSDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳1 引言SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）是目前分离蛋白质亚基并测定其分子量的常用方法，为检测电泳后凝胶中的蛋白质，一般使用考马斯亮蓝（CBB）染色[1]。
本次实验的目的在于学习聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理，并掌握聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳分离蛋白质的操作技术。
2 材料和方法2.1实验原理2.1.1 聚丙烯酰胺凝胶的性能及制备原理2.1.1.1 性能聚丙烯酰胺凝胶的机械性能好，有弹性，透明，相对地化学稳定，对pH和温度变化比较稳定，在很多溶剂中不溶，是非离子型的，没有吸附和电渗作用。
通过改变浓度和交联度，可以控制孔径在广泛的范围内变动，并且制备凝胶的重复性好。
由于纯度高和不溶性，因此还适于少量样品的制备，不致污染样品。
2.1.1.2 制备原理聚丙烯酰胺凝胶是用丙烯酰胺（Acr）和交联剂甲叉双丙烯酰胺（Bis）在催化剂的作用下聚合而成。
聚丙烯酰胺凝胶聚合的催化系统有化学聚合和光聚合两种。
本实验是用化学聚合。
化学聚合的催化剂通常多采用过硫酸铵（AP）或过硫酸钾，此外还需要一种脂肪族叔胺作加速剂，最有效的加速剂是N,N,N’,N’-四甲基乙二胺（TEMED）。
在叔胺的催化下，由过硫酸铵形成氧的自由基，后者又使单体形成自由基，从而引发聚合反应。
叔胺要处于自由碱基状态下才有效，所以在低pH时，常会延长聚合时间；分子氧阻止链的延长，妨碍聚合作用；一些金属也能抑制聚合；冷却可以使聚合速度变慢。
通常控制这些因素使聚合在1小时内完成，以便使凝胶的性质稳定。
聚丙烯酰胺凝胶电泳和SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳有两种系统，即只有分离胶的连续系统和有浓缩胶与分离胶的不连续系统，不连续系统中最典型、国内外均广泛使用的是著名的Ornstein-Davis高pH碱性不连续系统，其浓缩胶丙烯酰胺浓度为4％，pH = 6.8，分离胶的丙烯酰胺浓度为12.5％，pH = 8.8。
实验十 聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离蛋白质
实验十聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离蛋白质【实验目的】1. 了解和掌握聚丙烯酰胺凝胶电泳的技术和原理；2. 掌握用此法分离蛋白质组分的操作方法。
【实验原理】在生物化学、分子生物学和基因（遗传）工程实验中，常常要进行蛋白质和核酸的分离工作。
聚丙烯酰胺凝胶电泳（Polyacrylamide Gel Electrophoresis, PAGE）是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质进行蛋白质或核酸分离的一种电泳方法。
聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺单体（acrylamide，简称ACR）和交联剂N，N-甲叉双丙烯酰胺（N,N-methylene bisacrylsmide 简称BIS）在催化剂的作用下聚合交联而成的三维网状结构的凝胶。
通过改变单体浓度与交联剂的比例，可以得到不同孔径的凝胶，用于分离分子量大小不同的物质。
聚丙烯酰胺凝胶聚合的催化体系有两种：（1）化学聚合：催化剂采用过硫酸铵，加速剂为N,N,N,N－四甲基乙二胺（简称TEMED）。
通常控制这二种溶液的用量，使聚合在1小时内完成。
（2）光聚合：通常用核黄素为催化剂，通过控制光照时间、强度控制聚合时间，也可加入TEMED 加速反应。
聚丙烯酰胺凝电泳常分为二大类：第一类为连续的凝胶（仅有分离胶）电泳；第二类为不连续的凝胶（浓缩胶和分离胶）电泳。
一般地，不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳有三种效应：①电荷效应（电泳物所带电荷的差异性）；②凝胶的分子筛效应（凝胶的网状结构及电泳物的大小形状不同所致）。
③浓缩效应（浓缩胶与分离胶中聚丙烯酰胺的浓度及pH的不同，即不连续性所致）。
因此，样品分离效果好，分辨率高。
SDS即十二烷基硫酸钠（Sodium Dodecyl Sulfate，简称SDS）是阴离子表面活性剂，它能以一定比例和蛋白质结合，形成一种SDS-蛋白质复合物。
这时，蛋白质即带有大量的负电荷，并远远超过了其原来的电荷，从而使天然蛋白质分子间的电荷差别降低仍至消除。
sds-page蛋白凝胶电泳原理
在进行SDS-PAGE蛋白凝胶电泳原理的讨论之前，我们首先需要了解蛋白质和电泳技术的基本概念。
蛋白质是生物体内功能最丰富的大分子化合物，它们参与了生命的方方面面，包括结构、酶活性、信号传导等。
而电泳技术则是一种基于电场作用将带电粒子分离的方法，它在生命科学研究中有着广泛的应用。
SDS-PAGE蛋白凝胶电泳原理是一种常用于分离和鉴定蛋白质的技术，其原理基于蛋白质在电场中的迁移速度与其分子质量成反比的关系。
现在让我们深入探讨SDS-PAGE蛋白凝胶电泳的原理和相关细节。
1. SDS-PAGE蛋白凝胶电泳的基本步骤在进行SDS-PAGE蛋白凝胶电泳实验时，首先需要将待测样品中的蛋白质在含有SDS（十二烷基硫酸钠）的缓冲液中进行变性处理，使得蛋白质呈线性结构并且带有负电荷。
之后，将处理过的蛋白样品加载到聚丙烯酰胺凝胶中，并施加电场使得蛋白质开始迁移。
根据蛋白质的分子质量，它们将在凝胶中以不同的速率迁移，最终实现分离。
2. SDS的作用原理SDS是一种带有负电荷的表面活性剂，它的主要作用是使得蛋白质呈线性构象，并且使得蛋白质的带电量与其分子质量成正比。
这样一来，不同分子质量的蛋白质在电场中受到的阻力相对应也会不同，从而实现蛋白质的分离。
3. 凝胶电泳的原理凝胶电泳是利用凝胶作为分离介质的电泳方法。
凝胶可以是聚丙烯酰胺凝胶、琼脂糖凝胶或者琼脂糖琼脂糖凝胶。
在SDS-PAGE蛋白凝胶电泳中，聚丙烯酰胺凝胶是最常用的分离介质。
它的基本原理是利用凝胶的孔隙大小来实现对蛋白质的分离，分子质量较大的蛋白质会受到较大的阻力从而迁移较慢，分子质量较小的蛋白质则会迁移得更快。
4. 电泳条件的影响在进行SDS-PAGE蛋白凝胶电泳实验时，电泳条件的设定对分离结果有着重要影响。
电场强度的大小、电泳时间的长短、凝胶浓度等都会影响蛋白质的迁移速度和分离效果。
总结而言，SDS-PAGE蛋白凝胶电泳原理基于蛋白质在电场中的迁移速度与其分子质量成反比的关系，通过SDS的作用使得蛋白质呈现线性构象并且带有负电荷，再利用凝胶电泳对不同分子质量的蛋白质进行分离。
双向电泳技术研究进展
双向电泳技术研究进展摘要：双向电泳(two dimensional electrophoresis , 2-DE)技术是获得细胞、组织或器官等蛋白表达图谱的主要手段，是蛋白质组学研究的三大核心技术之一。
本文主要从双向电泳技术的发展，主要操作步骤及其面临的主要挑战等方面对改技术的研究进展进行综述。
关键词：双向电泳；研究1.双向电泳技术的发展蛋白质双向电泳源于1975年O,Farrell. Klose.Scheele 对大肠杆菌、老鼠及几尼猪蛋白质的研究。
它首先根据样品中蛋白质等电点不同进行等电聚焦(IEF)作为第l向，然后再按照蛋白质分子量大小不同进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS -PAGE)作为第2向，经染色后可以在凝胶上得到大量的蛋白质点，从而得到样品的蛋白质表达图谱。
根据双向电泳中第l向等电聚焦方法的不同，双向电泳主要分为2个主要类型，ISO-DALT(等电点一道尔顿)IPG．DALT ( 固相pH梯度一道尔顿)双向电泳。
1.1 ISO-DALT双向电泳技术传统的ISO-DALT双向电泳中，首先将载体两性电解质添加在丙烯酰胺凝胶中，凝胶聚合后在电场作用下形成连续的DH值梯度，两性电解质以游离的形式分布于聚丙烯酰胺凝胶的网孔中。
通常采用圆柱状电泳，IEF凝胶制备在圆柱型玻璃管中，可以将样品加在未凝固的凝胶溶液中，也可在凝胶凝固后在玻璃管顶端加样，然后进行等电聚焦，通常在50～100V电压下聚焦1～2 h，让样品进入IEF胶条，然后在200 ～400V或更高电压下进行聚焦，直到电流接近零时为止。
等电聚焦结束后取下凝胶柱，向玻璃管中凝胶与管壁间注水，将凝胶条吹出，用缓冲液平衡凝胶条，主要目的是充分打断多肽链间及多肽链内部的二硫键并使其与SDS充分结合，然后将胶条用琼脂包埋于第2向电泳的凝胶板中，进行第2向SDS-PAGE，SDS-PAGE 可以使用均一的分离胶浓度，也可采用不连续梯度胶或者连续梯度胶。
黄瓜叶片蛋白质双向电泳条件优化
１ ２ １ 材料 准备 ． ．
将 黄瓜种 子催 芽后播 在装 有草 炭土 ：蛭石 体 积 比为 １ ：２的 培养钵 中Ｈ 温 室培养 ， 长 至两 ， 待
片真 叶时摘取 叶 片 ， 于 一 ０ｃ 冰箱 中待用 。 置 ８ Ｉ ＝
１ ２ ２ 叶 片 蛋 白 质 的提 取 方 法 ．．
中 图 分 类 号 ：６ ７ １ Ｑ ５ ． 文 献 标 识 码 ： Ａ
蛋 白质 组 学 （ ｒｔ ｍ ｃ ） 究 已成 为 功 能基 ｐｏｅ ｉｓ 研 ｏ 因组 学研 究 的重要 方 法 与 内容 ¨ ， 白质 组 学 就 蛋 是对 一个 基 因 、 一种 细胞 或组织 、 种生物 所表 达 一 的全 部蛋 白质 的研 究 。蛋 白质 组 学 可 以 系 统 地确 定 细胞或 组 织 内 的每 一 个蛋 白质 的表 达 ， 蛋
烷基 硫 酸钠 一聚 丙 烯酰 胺 凝胶 电泳 （ Ｄ —Ａ Ｅ Ｓ ＳＰ Ｇ ）
冷 冻干 燥机 中制 成冻 干粉 ， 后放 于 一８ 最 ０℃ 冰箱
待用 。
Ⅱ 酚 提取 法 ： 黄 瓜 叶 片 １ｇ及 少 量 的 Ｐ Ｐ 取 Ｖ
放 入预 冷 的研 钵 中研磨 成 粉 、 转至 离 心 管 ， 入 ３ 加
辽宁农业科学
２１（ ）１ ０ ２ ３ ：１～１ ４
Ｌｉｏ ｎ ｒｃ ｌｕｒｌＳｃｅ ｃ ｓ ａ ｎｉｇ Ａｇ ｉｕ ｔ ａ ｉ ｎ ｅ
文章 编 号 ：０ ２—１ ２ （ ０ ２Ｊ ３—０ １ １０ ７ ８ ２ １ ０ ０ １—０ ４
黄 瓜 叶片 蛋 白质 双 向 电泳 条 件 优 化
目前双 向 电 泳 （ｗ ｉ ｎｉ ａ ｅｅｔ ｐ ｏｅ ｔｏｄｍｅｓ ｎ ｌ ｌ ｒ ｈｒ— ｏ ｃｏ
生化实验五 蛋白质SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳
试用于高中学生生物实验生化实验五蛋白质SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳一、原理聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）是以聚丙烯酰胺为支持物进行的电泳。
聚丙烯酰胺是丙烯酰胺以甲叉双丙烯酰胺为交朕剂在催化剂过硫酸铵－TEMED的作用下聚合产生的网状聚合物。
聚合的初速度与过硫酸铵浓度的平方根成正比，催化系统要求碱性环境。
此外，凝胶愈浓，网状聚合物的孔径愈小，对蛋白质的阻力愈大。
不同蛋白质在这一系统中电泳速度由蛋白质所处PH下的净电荷和分子大小（分子量）有关。
如果希望测定蛋白质分子量，则必须消除净电荷的干扰，十二烷基硫酸钠（SDS）是阴离子去污剂，它可以与蛋白质结合，使所有蛋白都带有大量负电荷，从而消除了各种蛋白由于净电荷的差异引起的泳动方向和速度的不同，使电泳中各种蛋白的泳动速度只与分子量有关，且全部向正极移动。
用已知分子量的蛋白为标准，SDS－PAGE可测定蛋白的分子量。
此外，聚丙烯酰胺凝胶电泳也可用于RNA分子量的测定。
二、试剂盒学生用：①1号管上样缓冲液300μl；②2号管没有目的蛋白表达的样品；③3号管有目的蛋白表达的样品；④4号管标准蛋白⑤5号管染色剂CuSO4·5H2O ⑥滤纸（吸水用）教师用：①1号管TEMED 200μl ②2号管过硫酸铵0.10g 2瓶③3号管丙烯酰胺14.5g 3瓶④4号管甲叉双丙烯酰胺0.5g⑤5号管上层凝胶缓冲液pH6.84瓶⑥6号管下层凝胶缓冲液pH8.86瓶⑦7号管电极缓冲液试剂含Tris9.06g、甘氨酸56.4g、SDS3g共8瓶三、教师溶液配制工作（教师试剂盒）1．配过硫酸铵溶液：取出教师试剂盒中2号试剂管（2个），在每管中分别加入1ml去离子水溶解管内药品，制成10%过硫酸铵溶液。
（注意：配制好的过硫酸胺溶液需避光、低温保存）2．配30%丙烯酰胺溶液：将3号（3瓶）、4号试剂管中药品取出置于1个小三角瓶中，加水溶解、定容至50ml，即得到30%的丙烯酰胺溶液。
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的注意
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的注意3. 跑第一向时，为什么要设定一个电流的最大值电压(50 μ A/ 胶)？电流的平方和功率成正比。
电流增大，功率增大，放出的热量也随之增大，就会导致胶条的温度增加。
当温度超过30 摄氏度时，缓冲液里的尿素就容易解离，产生一些极性分子，从而对等电聚焦产生影响。
4. 跑第一向时，为什么刚开始的电压比较低，而后逐渐增高？刚开始时，体系内的带电小分子比较多（比如无机盐和双极性分子）。
所以在这个阶段，电流主要是由这些小分子的移动所产生的。
由于这些分子质量小，移动他们不需要很高的电压。
当这些小分子移动到他们的目的地时（无机盐移动到极性相反的电极；两性分子移动到对应的pH 条带），体系内的蛋白质才开始肩负起运载电流的任务，逐渐向所对应的pH 区域移动。
5. 跑第一向时，为什么会产生一条蓝色的条带，并逐渐向酸性端移动？蓝色条带是缓冲液中痕量的溴酚蓝被聚焦所产生的。
溴酚蓝也是pH 指示剂，当它移动到酸性区时（pH4 ），颜色会变成黄色。
溴酚蓝的这个移动过程大体上发生在极性小分子的聚焦之后，蛋白质大分子聚焦之前。
6. 跑第一向时，为什么电压总达不到预定值？当上样量比较大时或体系内盐分比较多时，聚焦的电压有可能达不到所设定的数值。
7. 跑第一向时，在电压达到预定值后，电流为什么会降低？当上样量比较少时，所有蛋白在较短的时间内就移动到所对应的pH 值区域值，从而变成中性分子。
这样，体系的电阻越来越大，在恒定的电压下，电流就会越来越小。
8. 跑第一向时，为什么在两个电极丝附近有气泡产生？等电聚焦完成后，所有的蛋白质都移动到了相应的pI 值区域，而成为中心分子。
这是加在体系上的电压就开始电解水分子，在阳极产生氧气，在阴极产生氢气。
9. 重泡胀缓冲液(rehydration buffer)中的硫脲的作用是什么，双极性分子的作用是什么？硫脲的作用是增加蛋白质的溶解性，特别是碱性蛋白的溶解性。
双极性分子的作用也是增加蛋白质的溶解性。
植物蛋白质的聚丙烯酰胺凝胶电泳和双向电泳反应
• 自己配制低分子量或高分子量标准蛋白质混合试剂。 如买不到标准蛋白试剂盒时，可参考常用的标准蛋白 质及其分子量表。从中选择3—5种蛋白质，如马心细 胞色素C（Mr12 500）、牛胰胰凝乳蛋白原A （Mr25 000）、猪胃胃蛋白酶（Mr35 000）、鸡卵卵 清蛋白（Mr43 000）、牛血清白蛋白（Mr67 000）等 蛋白质，按照每种蛋白0.5—1mg·ml样品溶解液配制。 可配制成单一蛋白质标准液，也可配成混合蛋白质标 准液。
植物蛋白质的聚丙烯酰胺凝胶电泳 和双向电泳反应
植物蛋白质的聚丙烯酰胺凝胶电泳 和双向电泳反应
1.2 试剂 1.2.1 高分子量标准蛋白试剂盒（Pharmacia公司产品)
5种标准蛋白质 目前国内外均有厂商生产低分子量及高分子量标准蛋 白质成套试剂盒，用于SDS-PAGE测定未知蛋白质分子 量。
植物蛋白质的聚丙烯酰胺凝胶电泳 和双向电泳反应
• 可根据所测分子量范围选择最适凝胶浓度，并尽量选 择分子量范围和性质与待测样品相近的蛋白质作标准 蛋白质。标准蛋白质的相对迁移率（蛋白质的电泳迁 移距离除以染料迁移距离即为相对迁移率）最好在 0.2—0.8之间均匀分布。 在凝胶电泳中，影响迁移率的因素较多，而在制胶和 电泳过程中，很难每次都将各项条件控制得完全一致， 因此，用SDS-凝胶电泳法测定分子量，每次测定样品 必须同时做标准曲线，而不得利用另一次电泳的标准 曲线。
•ห้องสมุดไป่ตู้
植物蛋白质的聚丙烯酰胺凝胶电泳 和双向电泳反应
• （2）溶液中SDS的浓度：溶液中的SDS的总量，至少要 比蛋白质的量高3倍，一般需高达10倍以上。
• （3）溶液的离子强度：溶液的离子强度应较低，最高 不能超过0.26，因为SDS在水溶液中是以单体和分子团 的混合体而存在的，SDS结合到蛋白质分子上的量，仅 决定于平衡时SDS单体的浓度而不是总浓度，在低离子 强度的溶液中，SDS单体具有较高的平衡浓度。
SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳实验报告
总蛋白质相对分子质量的测定——SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法一、实验目的1. 学会SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法原理。
2. 掌握用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质相对分子质量的操作技术二、实验原理聚丙烯酰胺凝胶电泳是以聚丙烯酰胺凝胶作为载体的一种区带电泳。
该凝胶由丙烯酰胺(acr)和交联剂N, N-甲叉双丙烯聚酰胺(bis)聚合而成。
聚丙烯酰胺凝胶电泳利用电泳和分子筛的双重作用分离物质。
arc和bis单独存在或混合在一起时是稳定的，但在具有自由基团体系时就能聚合。
引发自由基团的方法有化学法和光化学法两种。
化学法的引发剂是过硫酸铵Ap，催化剂是四甲基乙二胺(TEMED)；光化学法是以光敏感物核黄素来代替过硫酸铵，在紫外光照射下引发自由基团。
采用不同浓度的arc, bis, Ap, TEMED使之聚合，产生不同孔径的凝胶。
因此可以按分离物质的大小，形状来选择凝胶浓度。
聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)有圆盘(disc)和垂直板(vertical slab)型之分，但两者的原理完全相同。
由于垂直板型具有板薄，冷却，分辨率高，操作简单，便于比较和扫描等优点，因而为大多数实验室采用。
十二烷基硫酸钠(SDS)是一种阴离子表面活性剂，加入到电泳系统中能使蛋白质的氢键、疏水键打开，并结合到蛋白质分子上（在一定条件下，大多数蛋白质与SDS的结合比为1.4g SDS/1g 蛋白质），使各种蛋白质-SDS复合物都带上了相同密度的负电荷，其数量远远超过了蛋白质分子原有的电荷量，从而掩盖了不同种类蛋白质原有的电荷差别。
这样就使电泳迁移率只取决于分子大小这一因素，于是根据标准蛋白质相对分子质量的对数和迁移率所绘制的标准曲线，可求得未知物的相对分子质量。
三、实验试剂与材料1. 30% Arc-Bis贮存液：30g Arc, 0.8g Bis, 用去离子水定容到100mL，过滤除去不溶性物质，用棕色瓶储存放置在4℃冰箱中。
2. Tris-HCl 1.0M pH=6.8、Tris-HCl 1.5M pH=8.83. 10% 过硫酸铵溶液4. TEMED（商品试剂）5. 2x Sample Loading Buffer：1.52g Tris，20mL甘油，2.0g SDS，2.0mL 2-巯基乙醇，1mg 溴酚蓝，用1M HCl调节pH至6.8，加蒸馏水稀释到100mL.6. 电泳缓冲液(Tris-Glycine缓冲液)：Tris 6.0g，甘氨酸28.8g，SDS 1.0g，用去离子水溶解加入盐酸调节pH=8.3，再定容至1L。
(色谱分析)聚丙烯酰胺凝胶电泳PAGE
4.非变性凝胶电泳中，酸性蛋白和碱性蛋白的分离 是完全不同的，而SDS-PAGE中所有蛋白都朝正 极泳动。
5.在非变性凝胶电泳中，电流不能太大，以免电泳 时产生的热量太多导致蛋白变性。这点跟变性电 泳也不一样。
所以与SDS-PAGE电泳相比，非变性凝胶大大降 低了蛋白质变性发生的机率。
基（如血红蛋白）或两条以上肽链（如α-胰凝乳蛋 白酶）组成的， SDS-PAGE测定的只是它们的亚基
或 单条肽链的分子量，而不是完整分子的分子量。
5.特殊蛋白质的相对分子质量：不是所有的蛋白
质都能用SDS-PAGE测定其分子量。包括：电荷异常 或
构象异常的蛋白质，带有较大辅基的蛋白质（如某些 糖蛋白）以及一些结构蛋白如胶原蛋白等。
实验过程
安装电泳槽
凝胶制备
电泳
样品处理与加样
剥胶与固定
染色与脱色
实验步骤
一、制胶
1.配胶
配胶应根据所测蛋 蛋白质的相对分子量
白质相对分子质量范
的范围 ＜104
围选择适宜的分离胶
1×104～4×104
浓度。由于SDS-PAGE
4×104～1×105
有连续体系和不连续
1×105～5×105
体系两种，两者各有
二、样品处理与加样
1.样品处理
样品 样品溶溶解液解 沸水浴
2.加样
小心拔出梳子 上下槽 注入电极缓冲液 用
微量进样器点样
三、电泳
冷却
加样
样品 迁移 方向
接上电泳仪，上槽为负极，下槽为正极。打开 开关，保持恒压进行电泳。
电泳过程中分子迁移的规律，小分子走在前头，大分 子滞后。电泳凝胶相当于凝胶过滤中的一个带孔胶粒。
导致：
SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳原理
聚丙烯酰氨凝胶电泳作用原理聚丙烯酰胺凝胶电泳是网状结构，具有分子筛效应，它有两种形式，一种是非变性聚丙烯酰胺凝胶，蛋白质在电泳中保持完整的状态，蛋白在其中依三种因素分开：蛋白大小，形状和电荷。
而SDS-PAGE仅根据蛋白分子量亚基的不同而分离蛋白。
这个技术首先是1967年由shapiro建立，他们发现在样品介质和丙烯酰胺凝胶中加入离子去污剂和强还原剂后，蛋白质亚基的电泳迁移率主要取决于亚基分子量的大小，电荷因素可以忽视。
SDS是阴离子去污剂，作为变性剂和助溶试剂，它能断裂分子内和分子间的氢键，使分子去折叠，破坏蛋白分子的二、三级结构。
而强还原剂如巯基乙醇，二硫苏糖醇能使半胱氨酸残基间的二硫键断裂。
在样品和凝胶中加入还原剂和SDS后，分子被解聚成多肽链，解聚后的氨基酸侧链和SDS结合成蛋白- SDS胶束，所带的负电荷大大超过了蛋白原有的蛋白量，这样就消除了不同分子间的电荷差异和结构差异。
SDS-PAGE一般采用的是不连续缓冲系统，于连续缓冲系统相比，能够有较高的分辨率。
浓缩胶的作用是有堆积作用，凝胶浓度较小，孔径较大，把较稀的样品加在浓缩胶上，经过大孔径凝胶的迁移作用而被浓缩至一个狭窄的区带。
当样品液和浓缩胶选TRIS/HCL缓冲液，电极液选TRIS/甘氨酸。
电泳开始后，HCL解离成氯离子，甘氨酸解离出少量的甘氨酸根离子。
蛋白质带负电荷，因此一起向正极移动，其中氯离子最快，甘氨酸根离子最慢，蛋白居中。
电泳开始时氯离子泳动率最大，超过蛋白，因此在后面形成低电导区，而电场强度与低电导区成反比，因而产生较高的电场强度，使蛋白和甘氨酸根离子迅速移动，形成以稳定的界面，使蛋白聚集在移动界面附近，浓缩成一中间层。
SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳原理采用十二烷基硫酸钠-聚丙稀酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE，polyacrylamide gel electrophoresis）方法可对蛋白质的组分进行分离，并可精确测得蛋白质的分子量。
聚丙烯酰胺凝胶电泳原理特性和SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳原理-1
聚丙烯酰胺凝胶电泳原理特性和SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳原理-1聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺（acrylamide，简称Acr）和交联剂又称为共聚体的N, N-甲叉双丙烯酰胺（methylene-bisacrylamide，简称Bis）在加速剂和催化剂的作用下聚合交联成三维网状结构的凝胶，以此凝胶为支持物的电泳称为聚丙烯酰胺凝胶电泳简称PAGE）。
与其他凝胶相比，聚丙烯酰胺凝胶有下列优点：①在一定浓度时，凝胶透明，有弹性，机械性能好。
②化学性能稳定，与被分离物不起化学反应。
③对pH和温度变化较稳定。
④几乎无电渗作用，只要Acr纯度高，操作条件一致，则样品分离重复性好。
⑤样品不易扩散，且用量少，其灵敏度可达10-6g。
⑥凝胶孔径可调节，根据被分离物的分子量选择合适的浓度，通过改变单体及交联剂的浓度调节凝胶的孔径。
⑦分辨率高，尤其在不连续凝胶电泳中，集浓缩、分子筛和电荷效应为一体，因而有更高的分辨率。
PAGE应用范围广，可用于蛋白质、酶、核酸等生物分子的分离、定性、定量及少量的制备，还可测定分子量、等电点等。
除了常用的聚丙烯酰胺圆盘及垂直板电泳，还有聚丙烯酰胺梯度凝胶电泳、十二烷基硫酸钠一聚丙烯酰胺凝胶电泳、等电聚焦电泳及双向电泳等技术，这些技术在凝胶聚合方面有共同之处，但又有各自的特点，分别叙述如下。
一、聚丙烯酰胺凝胶聚合原理及相关特性1．聚合反应聚丙烯酰胺凝胶（polyacrylamide gel，PAG）是由丙烯酰胺单体（Ac r）和交联剂甲叉双丙烯酰胺（Bis）在催化剂过硫酸铵或核黄素作用下聚合交联而成的三维网状结构凝胶，其单体及聚合物化学结构式如下图所示。
聚合反应时常用的催化剂有过硫酸铵及核黄素两个系统。
在水溶液中，过硫酸胺离子S2O2-8可形成游离基SO2-4，它能使丙烯酰胺单体的双键打开，形成游离基丙烯酰胺，后者和Bis单体作用，能聚合成凝胶。
催化反应需要在碱性条件下进行，如用7%的丙烯酰胺，在pH8.3时，30 min就能聚合完毕。
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Ｋｅ ｏｄ ：Ｃ ｃ ｍｂ ｒ Ｄｉｌｃｒ ｐ ｏ ｅｉ； Ｈ； ｒ ｔｏ ｃ ｙｗ ｒｓ ｕ ｕ ｅ ； ｅｅ ｔｏ ｈ ｒｓ ｐ ｓ Ｐ ｏｅ ｍｉｓ
植 物蛋 白质 组学 是后基 因组 时代 研究 的热 点之 一＿ ， ｊ 目前 关 于拟 南芥 、 稻口 ］ ］水 川等植 物 蛋 白质组 学
蛋 白质 双 向 电泳 图谱 的影 响 。结 果 表 明 ：Ｈ 为 ８ ８时 ， 白点 大 多 集 中 于 胶 面 的 中 部 ；Ｈ 为 ８ ２的 凝 胶 使 小 分 ｐ ． 蛋 ｐ ．
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何 立 中 ， 丽 萍 ， 世 荣 ， 燕娟 ， 王 郭 阳 陆晓 民 ， 婧 田
（ 京 农 业 大 学 园艺 学 院 ， 业 部 南 方蔬 菜 遗传 重 点 改 良实 验 室 ， 京 ２ ０ ９ ） 南 农 南 １０ ５
摘
要 ：以黄 瓜 品 种 ‘ 春 ２号 ’ 津 为试 材 ， 用 双 向 电泳 技 术 研 究 了 聚丙 烯 酰 胺 凝 胶 ｐ 对 黄 瓜 根 系 和 叶 片 利 Ｈ
Ａｂ ｔ ａ ｔ Ｃｕｃ ｓｒ ｃ ： ｕｍ ａｔ ｕｓ ｕｌｉ ｒ ‘ ｉ ｈｕｎ ｉ ｓ ｖ ｃ ｔｖａ ｓ ｉ Ｊ ｎｃ ２’ ｗａ ｓ ｄ ａ ｔ ｓ ｍ ａ ｅ ｉ ｌ ａ ｈｅ ｅ ｆ ｃ ｓ ｏｆ ｓｕｅ ｓａ ｅｔ ｔ ｒａ ， ｎｄ ｔ ｆ ｅ ｔ ｐ ｙ ｃ ｙｌ ｍ ｉ ｅ ｗ ｏ－ ｍ ｅ ｉ ａｌ ｅ ｔ ｏｐ ｒ ｒ ｏｌ ａ ｒ ａ ｄｅ ｇ ｌｐＨ ｏｎ ｔ ｄｉ ｎｓｏｎ ｃ ｒ ｈｅ ｏｇ ａｍ ｓｏ ｏｔ ｉ ｆｃ ｕｍ ｂｅ ｏ ｓａ ｄ ｌ ａ ｅ ｅｌ ｆｐｒ ｅ ｎｓｏ ｕｃ ｒｒ ｏｔ ｎ ｅ ｖ ｓ ｗ ｅ ｅ ｓｕｄ ｅ ｙ ｔ ｒ ｔ ｉ ｄ ｂ ｗｏ． ｍ ｅ ｓｏｎａ ｌ ｃ ｒ ＤｈＯ ｅ ｉ ｅ ｈｎ ｑ ｄｉ ｎ ｉ ｌｅ ｅ ｔ Ｏ ｒ ｔｃ ｔ ｃ ｉ ｕｅ．Ｔｈｅ ｒ ｓ ｔ ｈｏｗ ｅ ｈａ ｈ ｈｅ ＰＨ ａ ｅ ｕｌｓｓ ｄ ｔ ｔｗ ｅｎ ｔ ｗ ｓ ８． ｍ ｏｓ ｆ ｔ ｏｔ ｉ ｔ ｅ ｅ ｈｅ ｍ ｉ ｌ ｆ ｔ ｅ ｇ ｌ Ｗ ｈｅ ｈｅ ｐＨ ａ ２，ｔ ｍ ａ ｌｍ ｏｌ ８， ｔｏ ｈｅ ｐｒ ｅ ｎｓｇａ ｈ ｒ ｄ ｏｎ ｔ ｄｄ ｅ ｏ ｈ ｅ ； ｎｔ ｗ ｓ ８． ｈｅ ｓ ｌ ｅ—
上海 农 业 学 报
２ １ ，７ ２ ：８ １ ０ １ ２ （ ） １ —２
Ａｃ ａ Ａｇｒｃ ｔ ａ ｈ ｇ ｔ ｉｕｌｕｒ ｅ Ｓ ａｎ ｈａｉ
文 章 编 号 ：０ ０ ３ ２ （ ０ １ ０ — １ —４ １ ０ —９ ４ ２ １ ） ２０ ８ ０
Ｓ Ｓ聚丙烯酰胺凝胶 ｐ Ｄ－ Ｈ对黄瓜蛋 白质双 向电泳 图谱 的影响
ｃ ｅ ｐｒ ｅ ｎｓ ｔ ｏ ｅ； Ａ ｎｄ ｗ ｈ ｈｅ ｐＨ ｓ ８． ｕｌ ｏｔ ｉ ｏ ｌ ｓ ｅｎ ｔ ｗａ ５， ｔ ｏ ｅ ｎｓ ｃ ｕｌ ｂ ｅ ｒ ｔ ｄ ｍ ｏｒ ｎｄ ｂｅ ｔ ｒ ｈｅ ｐｒ ｔ ｉ ｏ ｄ ｅ ｓ ｐａ ａ ｅ ｅ ａ ｔｅ ， ｗｈｉ ｈ ｗ ａ ｕｉａ ｅ ｆ ｔ ｄｙ ｏ ｕ ｕｍ ｂｅ ｅ ｄｌｎｇ ｎ ｐ ｏｔ ｍ ｉｓ ｃ ｓ ｓ ｔ ｂｌ ｏｒｓ ｕ ｎ ｃ ｃ ｒｓ ｅ ｉ ｓｉ ｒ ｅｏ ｃ ．
依据 分子 量对 蛋 白质进行 分 离 ， 胶 的厚 度 、 凝 浓度 、 Ｈ 均会 对 双 向 电泳 图谱 产 生较 大 的影 响 。要 使 蛋 白 ｐ 质样 品成 功分离 除需 选择 合适 的凝胶 浓度 外 ， 适 的 ｐ 也很 关键 。酸 性蛋 白质 在 高 ｐ 条件 下 ， 合 Ｈ Ｈ 碱性 蛋
程 。其 中第一 向等 电聚焦 （ｓｅｅｔｏ ｏ ｕｉｇ Ｉ Ｆ 主要 采用 固相 Ｉ Ｇ 胶 条 ， 有 ｐ 梯 度稳 定 、 Ｉｏ ｌｃｒ ｆｃ ｓ ，Ｅ ） ｎ Ｐ 具 Ｈ 聚焦 准
确、 精度 高 的特 点 ， 具备无 阴极 漂移及 碱性 蛋 白丢 失 等优 势 ¨ ； 二 向是 采 用 Ｓ ． 丙 烯酰 胺凝 胶 电泳 ， ｑ第 ］ ＤＳ聚
ＨＥ Ｌ —ｈ ｎ ， ｉ ｏ ｇ ＷＡＮＧ ｉ ｉｇ ＧＵＯ ｈ－ｏ ｇ ＹＡＮＧ ｎｊａ ，Ｌ Ｘｉｏｍｉ ， ｉｎＪｎ ｚ Ｌ— ｎ ， ｐ Ｓ ｉ ｎ ， ｒ Ｙａ － ｎ Ｕ ａ — ｎ Ｔ ａ ｉｇ ｕ
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Ｈｅ ｌ ｃ ｒ ） 高速冷 冻离 心机 （ Ｅ ＫＭＡＮ） ａｔ ａｅ ， ｈ Ｂ Ｃ 。
通 过调 节 ＨＣ 的含 量 ， 制 ｐ Ｉ 配 Ｈ＝８ ８ ８ ５ ８ ２的 Ｔ ｉ ＨＣ （ ． ｌ 缓 冲液 ， ． 、． 、 ． ｒｓ Ｉ１ ５ｍｏ／ ． Ｌ） ４℃保 存 备 用 。其 他试 剂 ：０ ３ ％凝胶 储液 、０ ＤＳ Ｉ ％ＡＰ Ｔ ＭＥ 原液 ） 照 常配制 。 １ ％Ｓ 、Ｏ 、 Ｅ Ｄ（ 均
（ Ｔ 、 甲氨 基丙 磺酸 （ ＨＡＰ ） 巯 基 乙醇 ． ） 十二 烷 基磺 酸 钠 （ ＤＳ 、 ＤＴ ） 二 Ｃ Ｓ 、一 Ｍｅ 、 Ｓ ） 过硫 酸 铵 （ ） Ｔ ｉ 碱 、 ＡＰ 、 ｒ ｓ 甘 氨 酸 、 甲基 乙 二 胺 （ Ｅ 四 Ｔ ＭＥＤ） 碘 乙 酰胺 （ＡＡ） 牛 血 清 白蛋 白（ Ｓ 、 马 斯 亮 蓝 （ Ｂ Ｇ－５ 、 Ｉ 、 Ｂ Ａ） 考 Ｃ Ｂ） ２ ０和
上
海
农
业
学
报
１ ９
白质在 低 ｐ 条件 下 常得 到较好 的解 离 ， Ｈ 电泳 分 离效 果 较 好 。 目前 常用 的分 离 胶 缓 冲 系统 有 三 大 类 ： 高 ｐ （ Ｈ 右 ） 低 ｐ （ Ｈ ４左 右 ） 中性 。研究 发 现… 黄瓜 的蛋 白质 主要 分 布在 ｐ ４ Ｈ ｐ ９左 ， Ｈ ｐ 和 ， Ｈ ～７的酸性
端， 碱性 端分 布较 少 。本研 究 通过 比较 不 同 ｐ 的凝 胶 ， 出适 合 黄瓜根 系和 叶片蛋 白质 双 向 电泳研 究 的 Ｈ 找 凝胶 ｐ Ｈ。
１ 材 料 与方 法
１ １ 材料 ．
试验 在南 京农 业大 学牌 楼 实验 温 室 内进行 ， ‘ 春 ２号 ’ 以 津 黄瓜 （ ｃ ｍｉ ｓ ｔ ｕ ） Ｃｕ ｕ ｓ ａｉ ｓＬ． 品种 为 供 试 材 ｖ 料， 由天津 市农 业科 学 院 园艺研 究所 提供 。种 子 经过 消 毒 、 浸种 、 芽 后选 取 出 芽整 齐一 致 的种子 播 种 于 催 装 有 石 英砂 的育 苗盘 中 ， ／ 温 度 ２ ～３ 昼 夜 ５ Ｏ℃／５ １ １ ～ ８℃ ， 子 叶展平 后每 天浇 灌 １ １４Ｈｏ ｇａ ｄ营养 待 次 ／ ａ ｌｎ 液， 当幼苗 二 叶一 心时选 取 长势一 致 的幼 苗 定植 于 装 有 １２ ａ ｌｎ ／Ｈｏ ｇａ ｄ营 养 液 （ Ｈ ＝６ ３±０ １ 的 水 培箱 ｐ ． ．） 中 。当幼 苗三 叶一 心时取 样 置 于 一８ ０℃冰 箱 内备用 。
１ ２ 试 剂 与 ｐ 处 理 ． Ｈ
１ ｍ 固相 ｐ 梯度 （ｍｍｏ ｉｚ ｄｐ ｇ ａ ｉｎ ，Ｐ 胶 条 、Ｐ 两性 电解 质 （ ３ｃ Ｈ Ｉ ｂｌ ｅ Ｈ ｒ ｄｅ ｔＩ Ｇ） ｉ ＩＧ Ａｍｐ ｏｙ ｅ 、 物油 等 ｈ ｌｔ） 矿
均 为 ＧＥ公司 产 品 。尿 素 、 脲 、 硫 琼脂 糖 、 溴酚 蓝 、 烯 酰胺 （ ｔ 、 丙 Ａｃ） 甲又 双丙 烯酰 胺 （ ｉ Ａｃ） 二硫 苏 糖醇 Ｂｓ ｒ、 ．
（ ＣＡＲＳ２ 一 ３ 资 助 ．５Ｃ ０ ）
作 者 简介 ： 立 中（ ９ ６ ， ， 读硕 士 ， 究 方 向 ： 施 园 艺 及 蔬菜 生理 分 子 生 物 学 。Ｅ ｍａｌ 【９ ０ ０ ４ ｎａ ．ｄ ．ａ 何 １ ８ 一） 男 在 研 设 － ｉ：２） １４ ６ ＠ ｊｕ ｅ ｕ ｃ （ ） ＊通 讯 作 者 ， — ｉ ｒｕ ＠ ｎａ ．ｄ ．ａ Ｅ ｍａｌ ｇ ｏ ｊｕ ｅ ｕ ｃ ：ｓ
研究较 多 。近年 来 ， 向电泳技 术开 始用 于黄瓜 蛋 白质组 的研究 ］ 双 。蛋 白质组 是 一个 动 态 的概 念 ， 每一
种生 命 活动 都是 特定 的蛋 白质 群体 在不 同时间 和空 问发 挥功 能 的结果 ， 白质 组学 研究 的 开展是 生命 科 蛋
学进 入后 基 因组 学 时代 的重要 里程碑 。 ］ 双 向凝胶 电泳 （ ｗｏｄｍｅ ｓ ｎ ｌ ｏｙ ｃｙａ ｄ ｅ ｅｅ ｔ ｐ ｏｅｉ， ． ） 术 由 Ｏ’ ａｒｌ 于 Ｔ —ｉ ｎ ｉ ａ ｌａ ｒｌｍｉｅｇ ｌ １ｃｒ ｈ ｒｓ ２ＤＥ 技 ｏ ｐ ｏ ｓ Ｆ ｒｅｌ Ｅ １７ ９ ５年 创立 ， 目前蛋 白质组 学研 究 中分离 检测 细胞 、 是 细胞 系 、 官和组 织 总蛋 白质组 的有 效 手段 。双 向 器 电泳 技术 是 根据 蛋 白质等 电点 和分 子量 两个 相 互独 立 的参数 ， 相互 垂直 的两 个方 向进 行 二次 电泳 的过 在