嘉兴地区乙肝病毒基因分型与病理及耐药的关系
DNA测序线性反向探针杂交法检测HBV P基因耐药突变比较论文
DNA测序与线性反向探针杂交法检测HBV P基因耐药突变的比较【摘要】目的基于多重pcr和反向线性杂交原理，建立hbv基因分型及耐药突变检测的新方法。
方法对深圳地区的hbv进行基因分型，并对其常见耐药突变位点进行快速检测，了解其流行现状和流行规律。
结果在45份标本中dna序列测定法检测到碱基突变73个，其中与 lam相关突变24份（53.33%），与 adv 相关突变3份（6.66%），与ldt相关突变1份（2.22%），与etv相关突变1份（2.22%）；选取21份血清，其中与线性反向探针杂交检测结果一致的突变为85.71%（18/21），氨基酸位点一致为97.39%（224/230）。
结论检测hbv不同基因型与致病性及药物应答的关系，能够为研究hbv的流行病学规律提供新的方法，为hbv感染的治疗提供用药指导，从而也为hbv的感染控制提供新的诊断工具。
【关键词】慢性乙型肝炎；乙肝病毒；核苷/酸类药物；耐药性突变；dna测序；线性反向探针杂交法【中图分类号】r450【文献标识码】a【文章编号】1004-5511（2012）06-0346-02全世界大约有3.5亿乙型肝为病毒（hbv）携带者，每年约有80万人死于hbv 慢性感染所引发的重型肝炎、肝硬化和肝细胞癌等相关疾病。
乙型肝炎病毒（hbv）可在慢性持续性感染、机体免疫、压力或抗病毒治疗药物作用过程中发生变异［1］。
近年来，临床上开始广泛采用采用核苷/酸类药物治疗乙型肝炎，核苷/酸类药物方拉米夫定(lam)、阿德福韦酯(adv)、替比夫定(ldt)、恩替卡韦(etv)等简便、副作用少、能迅速抑制hbv复制。
但其耐药性问题也日益突出。
本研究采用基于巢式 pcr 的 hbv p 基因序列测定法检测慢性乙型肝炎患者血清 hbv 基因变异情况，并与线性反向探针杂交法检测结果比较，同时对新发现的若干 hbv dna 耐药突变位点进行分析。
现将实验结果报告如下。
结合基因型耐药突变检测与表型耐药分析探索乙肝病毒耐药的新认识
结合基因型耐药突变检测与表型耐药分析探索乙肝病毒耐药的新认识徐东平;刘妍【摘要】核苷(酸)类似物是临床上治疗慢性乙型肝炎病毒(HBV)感染最常用的药物,但长期应用可引发病毒耐药,导致治疗失败.基因变异检测及表型耐药分析是发现和鉴定HBV耐药的基本方法,前者主要是应用基因测序或线性反向探针杂交等方法,检出已知的病毒耐药相关突变,后者则是在体外细胞水平确定携带有变异基因的HBV毒株对病毒复制力及核苷(酸)类药物敏感性的影响,是鉴定复杂与特殊HBV耐药变异的基本手段.我们通过技术创新,建立了敏感、特异、经济、高效的HBV基因型检测方法,进而建立了可靠的HBV复制力和表型耐药分析方法,广泛应用于临床样本分析,实现了对HBV耐药的早期发现及对新的非典型HBV耐药相关突变株的鉴定. 我们近期在核苷(酸)类似物耐药和应答不佳的患者中检测到多种特殊和复杂HBV耐药相关突变,并结合临床资料,进一步对代表性变异株进行病毒复制力和表型耐药分析,取得了多项重要发现:①从大样本中检出和鉴定了多种多重耐药HBV 变异株,并发现联合用药可协同抑制多重耐药HBV变异株的体外复制；②HBV rtL229替换可作为补偿变异,恢复拉米夫定耐药变异株rtM204I的病毒复制力；③rtM204Q是一种新的拉米夫定耐药相关突变；④r tAl81C+rtL180M+rtM204V与恩替卡韦耐药相关；⑤同一耐药患者血清HBV虽检出耐药变异,但外周血单个核淋巴细胞(PBMCs)中的HBV cccDNA仍以原始野生株为优势种群,提示PBMCs为体内HBV野生株的“存储库”,参与HBV肝外感染 . 上述发现对深入揭示HBV耐药变异的临床特点和发生机制,辅助临床合理制定并优化抗病毒治疗方案具有重要作用.%This work was supported by the National Twelfth Five-Year Special Grand Project for Infectious Diseases(2012ZX10004S03), the National Natural Science Foundation (81171617), and the Twelfth Five-Year Clinical High-tech Project of Military Hospital (2010gxjs009)rn[Abstract] Nucleoside and nucleotide analogs are most commonly-used agents in the treatment of hepatitis B virus (HBV) infection. However, long-term use of nucleoside/nucleotide analogs may induce HBV drug resistance, thereby leading to treatment failure. The genotyping and phenotyping are two basic methods for detection and identification of HBV drug resistance. Genotyping is used to detect well-known drug-resistant mutations mainly through DNA sequencing and reverse hybridization line probe. Phenotyping is an essential tool to identify "novel" and complex resistant mutations, based on comparison of HBV replication capacity and drug susceptibility between variants and wild-type counterparts. We have developed sensitive, specific, high cost-effectiveness assay for HBV genotypic resistance detection, thus developing reliable assays for analyses of HBV replication capacity and phenotypic resistance. These assays have been widely-applied in clinic, realizing early finding of classical drug-resistant mutations and identification of unusual drug-resistant mutations. In our recent studies, we detected some unusual and complex HBV mutations in the patients with resistance and without good response to nucleos(t)ide analogs. In combination with clinical information and phenotyping of replication capacity and drug susceptibility, we have acquired novel findings as follows, (l) Detected and identified several multidrug-resistant HBV strains by screening of a large number of patients; and multidrug-resistant HBVstrains could be synergistically suppressed by combined use of anti-HBV agents. (2) It was found that HBV rt229 substitutions could be a compensatory mutation to increase replication capacity of lamivudine-resistant rtM204I mutant. (3) rtM204Q,was found as a novel lamivudine-resistance-associated mutation. (4) rtA181C+rtL180M+rtM204V was found to be associated with entecavir resistance. (S) It was found that in the same patient with drug-resistant HBV strains in sera, wild-type HBV strains were predominant in cccDNA of their peripheral blood mononuclear cells (PBMCs), suggesting that PBMCs might be a storage pool of wild-type HBV associated with extra-hepatic HBV infection mechanism. These findings are important for a better understanding of clinical features and underlying mechanism of HBV drug-resistant mutations, capacitating clinicians to optimize antiviral schedule.【期刊名称】《解放军医学杂志》【年(卷),期】2012(037)006【总页数】4页(P535-538)【关键词】肝炎病毒,乙型;突变;抗药性,病毒;表型【作者】徐东平;刘妍【作者单位】100039北京解放军302医院全军传染病研究所/肝衰竭诊疗与研究中心病毒性肝炎研究室;100039北京解放军302医院全军传染病研究所/肝衰竭诊疗与研究中心病毒性肝炎研究室【正文语种】中文【中图分类】R512.62徐东平，医学博士，研究员，博士生导师。
乙肝病毒基因分型
（1）HBV 基因型与病毒复制及变异的关系
HBV 基因型与病毒复制水平及病毒标志物的表达有一定的相关性。Watanabe等研究报道，基因C型的HBeAg阳性率高于B型和A型，而B型HBeAg阴性率高于C型，同时B型血清HBeAg清除率较C型显著常见且较早发现;基因C型血清HBV DNA水平显著高于B型；A型的HBV DNA 自然清除率高于D型和F型，同时A型的HBsAg 自然清除率也比D型高；以上均提示C型HBV复制较活跃，易形成持续病毒血症，不易发生e系统血清转换发生快，免疫清除HBV较C型早。
近年来,随着分子生物学技术的迅猛发民和对HBV认识的不断深入,国内外许多学者对HBV基因分型及其临床的相关性开展了大量的研究. HBV基因分型比血清亚型更能反映原型病毒株之间的自然异质性. HBV基因分型方法有多种,以全基因测序为HBV基因分型的金标准,基于全基因核甘酸序列比较, HBV可分为A、B、C、D、E、F、G、H8个基因型。HBV基因型呈地理区域性分布，且不则基因型致病性不同，HBV基因型与乙型肝炎病情的进展，临床表现、治疗、预后有密切的关系。
总之，HBV基因型与病毒复制与清除，病毒变异，临床表现，治疗应答和预后均有一定的关系，提示不同基因型具有不同的致病性。基因分型的研究为乙肝病毒变异的研究，发病机制的探讨,病情评估，治疗药物的选择和预后判定以及分子流行病学研究提供了有力工具
大量研究表明，我国HBV基因型南方以B型为主，北方以C型为主，D型仅见于西部及少数民簇地区，A，F型偶有发现，还未发现其它性别。也有学者研究表明D基因型在我国宁夏地区,广东地区和香港地区约占感染者15％，因而HBV基因型在我国的确切分布状况仍不十分清楚。
HBV基因型的临床意义
近年来HBV基因分布的研究成为国内外学者关注的研究热点。研究发现，HBV基因的分布具有一定的地域性，A型主要分布在西欧、北欧、北美洲及非洲地区， B型和C型是亚洲和大洋洲的特征性基因型，B型主要见于中国、日本、印度尼西亚、越南和巴西，D型分布最为广泛，主要分布在中东、北非和南欧，也是地中海地区HBV的主要基因型，还发现于亚洲少数地区；E型主要分布于非洲撒哈拉沙漠地带；F型主要分布于美国、南美洲和土著居民；G型在法国、美国、德国、英国和意大利被发现；H型已在尼加拉瓜、墨西哥及美国加利氟尼亚地区被发现。
乙型肝炎病毒耐药基因及分型检测
乙型肝炎现状如何？乙型病毒性肝炎是由乙肝病毒（hepatitis B virus，HBV）感染引起的、以肝脏炎性病变为主，并可引起多器官损害的一种疾病，主要存在于肝细胞内，可引起肝细胞炎症、坏死和纤维化。
乙型肝炎病毒(HBV)感染呈世界性分布，全球约有3.6亿感染者，每年约有100万人死于与HBV相关的肝脏疾病。
我国属于感染的高发区，现有的慢性HBV感染者约9300万例。
乙型肝炎病毒（HBV）基因分型的临床意义HBV根据DNA差异可分为A、B、C、D、E、F、G、H八种类型，不同型别在流行特征，致病性，对药物治疗反应等方面存在差异，其中，我国以B型和C型为主，感染HBV基因型B的患者发生肝纤维化及肝细胞癌的平均年龄要比感染HBV基因型C的患者的年龄大。
通过分型检测，可判断病毒复制活跃程度及突变发生率情况。
研究表明，与HBV-B型相比，C型复制较活跃，不易发生HBeAg血清转换；HBV-B型易产生前C区突变，C型核心启动子区变异发生率更高，与重型肝炎发病机制密切相关，可作为肝癌高危指标之一。
同时，HBV-B、C型患者易产生拉米夫定耐药突变，通过分型检测，可指导临床治疗方案制定，有针对性进行临床治疗，更大程度上提高患者的生活质量。
乙肝的治疗方式有哪些？HBV感染主要的治疗方法是抗病毒治疗，国内外普遍使用的药物有干扰素和核苷（酸）类。
由于干扰素需要反复注射，且副作用较多，近年来，核苷(酸)类似物(NA)已成为抗HBV感染的主要方法之一，NA因其抑制病毒复制能力强、使用方便、耐受性好且疗效确切，适用于不同阶段的肝病患者，是长期治疗的合理选择。
但随着治疗时间的延长，往往会出现病毒耐药株，从而需要监测乙型肝炎病毒耐药基因型，指导临床用药。
乙肝病毒产生耐药的机理是什么？HBV对某种药物的耐药性一般是指由HBV基因组上某些位点的变异导致这种药物对HBV的抑制作用减弱或无作用。
通常分为以下几种：（1）原发性耐药变异：指药物作用靶位的基因及其编码的氨基酸发生变异，导致变异病毒株对治疗药物的敏感度下降；（2）继发性耐药变异(又称补偿性耐药变异)：指由于原发性耐药变异病毒株复制能力下降，在原发性耐药变异的基础上，病毒株也可在其他位点发生变异，这些变异可部分恢复变异病毒的复制能力或可导致变异病毒对药物敏感度的进一步下降；（3）基因型耐药：指检测到已在体外的表型分析研究中被证实与抗病毒药物耐药相关的HBV变异；（4）表型耐药：通过体外复制系统证实检测到的HBV变异会降低其对抗病毒药物的敏感度。
乙型肝炎病毒耐药基因及分型检测
乙型肝炎现状如何？乙型病毒性肝炎是由乙肝病毒（hepatitis B virus，HBV）感染引起的、以肝脏炎性病变为主，并可引起多器官损害的一种疾病，主要存在于肝细胞内，可引起肝细胞炎症、坏死和纤维化。
乙型肝炎病毒（HBV）感染呈世界性分布,全球约有3.6亿感染者，每年约有100万人死于与HBV相关的肝脏疾病.我国属于感染的高发区，现有的慢性HBV感染者约9300万例。
乙型肝炎病毒（HBV)基因分型的临床意义HBV根据DNA差异可分为A、B、C、D、E、F、G、H八种类型，不同型别在流行特征，致病性，对药物治疗反应等方面存在差异，其中，我国以B型和C型为主,感染HBV基因型B的患者发生肝纤维化及肝细胞癌的平均年龄要比感染HBV基因型C的患者的年龄大。
通过分型检测，可判断病毒复制活跃程度及突变发生率情况.研究表明，与HBV—B型相比,C型复制较活跃，不易发生HBeAg血清转换；HBV—B型易产生前C区突变，C型核心启动子区变异发生率更高，与重型肝炎发病机制密切相关，可作为肝癌高危指标之一.同时,HBV-B、C型患者易产生拉米夫定耐药突变，通过分型检测，可指导临床治疗方案制定，有针对性进行临床治疗，更大程度上提高患者的生活质量.乙肝的治疗方式有哪些?HBV感染主要的治疗方法是抗病毒治疗，国内外普遍使用的药物有干扰素和核苷（酸）类。
由于干扰素需要反复注射，且副作用较多,近年来,核苷(酸）类似物（NA)已成为抗HBV感染的主要方法之一，NA因其抑制病毒复制能力强、使用方便、耐受性好且疗效确切，适用于不同阶段的肝病患者,是长期治疗的合理选择.但随着治疗时间的延长,往往会出现病毒耐药株，从而需要监测乙型肝炎病毒耐药基因型，指导临床用药。
乙肝病毒产生耐药的机理是什么?HBV对某种药物的耐药性一般是指由HBV基因组上某些位点的变异导致这种药物对HBV的抑制作用减弱或无作用。
通常分为以下几种：(1）原发性耐药变异：指药物作用靶位的基因及其编码的氨基酸发生变异,导致变异病毒株对治疗药物的敏感度下降；（2）继发性耐药变异(又称补偿性耐药变异)：指由于原发性耐药变异病毒株复制能力下降,在原发性耐药变异的基础上，病毒株也可在其他位点发生变异,这些变异可部分恢复变异病毒的复制能力或可导致变异病毒对药物敏感度的进一步下降；（3）基因型耐药:指检测到已在体外的表型分析研究中被证实与抗病毒药物耐药相关的HBV变异；（4)表型耐药：通过体外复制系统证实检测到的HBV变异会降低其对抗病毒药物的敏感度。
乙型肝炎病毒基因型与YMDD变异关系的研究进展(文献综述)
ＹＤ Ｍ Ｄ变异 尤为突 出 ， 得 Ｈ Ｖ感 染后 的临床表 现与临 并使 Ｂ
床过程呈现多样 化 、 复杂化 。由于 Ｈ Ｖ不 同分离 株 间核苷 Ｂ 酸序列有差异 。｛ Ｅ前根据 ｔ Ｖ核苷 酸全序列 异质 性分 为 ８ ｔ Ｂ 个基 因型 ， 问的基因型与病毒复制、 不 变异 、 疾病 的预后及治 疗药物的选操均有一定 的关系。
上升趋势 Ｊ 。
突变。１８ 年 日 学者 Ｏ ａ ｏ － 首先提 出了 乙型肝炎 病 ９８ 本 ｋｍ ｔ １ ｏ
毒基因分型法 ， １ 株不 同亚型的 Ｈ Ｖ基因序列两两 比较 对 ８ Ｂ 后， 根据核苷 酸序列异 源性 ≥８ ％将 ｌ ８株不 同亚型 的 ｔ Ｖ ｔ Ｂ 基因序列分为 Ａ Ｃ 个基 因型 ， Ｂ Ｄ４ 随后 Ｎ ｒｅ 证实 了这 一 ｏｄｒ 结果 ， 同时还发现 了两个新 的基 因型 Ｅ和 Ｆ 目前 ， 。 人类 已 发现的 Ｈ Ｖ基因型共 ８种 ， 分型标准是全 基 因序 列 同源 Ｂ 其 性 Ｉ９ ％ ， Ｓ基 因序 列 同源性 ９９ ％， ＞２ 或 ６ 以此 为标准 将 乙肝 病 毒分为 Ａ～ｉ ８个基 因型 ， ｛ 不同基因型对各种抗病 毒药物
同样 ， 欧美 国家对 Ｈ Ｖ基 因型及其 与 Ｙ Ｄ相关性 的 Ｂ ＭＤ 研究结果显 示存 在地 区差异 。Ｍｏｋｖｔ ａｏｉ ｚ等 于 １９ ９ ８年 ～
异 与基 因型无关 。
主 ， 以 Ｂ型为 主， 南方 Ｄ型仅见于少数民族地 区， 西藏和新 如
疆 ， 型偶 有 发 班 ， Ｅ型 和 Ｆ型 。 Ａ 无
２ ＩＢ ＭＤ 变 异及 产生 机制 － ＶＹ Ｄ Ｉ
Ｈ Ｖ基 因组 由 ｓ Ｃ Ｐ Ｘ４个开放 阅读框组 成 ， Ｂ Ｂ 、、 、 Ｈ Ｖ变
中国慢性乙肝防治指南
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八、病理学诊断
• 免疫组化法检测可显示肝细胞中有无HBsAg和HBcAg表达。HBsAg胞浆弥漫型和胞 膜型，以及HBcAg胞浆型和胞膜型表达提示HBV复制活跃；HBsAg包涵体型和周边 型及HBcAg核型表达则提示肝细胞内存在HBV
• 慢性乙肝肝组织炎症坏死分级(G)、纤维化程度分期(S)，可参照2000年<病毒性 肝炎防治方案>；国际上常用Knodell HAI评分系统
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六、实验室检查
• HBV DNA、基因型和变异检测 - HBV DNA定性和定量检测：反映病毒复制的情况 - HBV基因分型：基因型特异性引物PCR法、限制性 片段长度多态性分析法、线性探针反向杂交法、
PCR微量板核酸杂交酶联免疫法、基因序列测定法
- HBsAg耐药突变株检测：HBV聚合酶区基因序列分 析法、限制性片段长度多态性分析法、荧光实时 PCR法、线性探针反向杂交法等
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介绍：H & E染色病理切片
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P P
V
肝小叶 中央静脉 肝细胞索
门管区
中度慢性乙型肝炎
A/G EP(%) PTA(%)
轻度
中度
重度
≤3×ULN 3-10×ULN ＞10×ULN
17.1-34.2 34.2-85.5 ＞85.5
≥35
33-34
≤32
1.5-1.3 1.2-1.0
≤0.9
≤21
22-25
＞26
79-71
70-61
60-40
乙型肝炎病毒耐药变异与基因型检测在临床上的应用
检测４ ６例 乙肝 患 者 血 清 样 本 ， 用特 异 的 引 物 对待 检 标 本 ＨＢ 区进 行 Ｐ Ｒ 扩 增 后 作 基 因序 列 检 测 ， 用 Ｃ ｒｍａ２ ２ 采 ＶＰ Ｃ 利 ｈｏ ｓ． ３软 件 对 测序 结果 进 行 分析 有 无 突 变 产 生 ， 序 结 果 用 软 件 ｃｕｔｌ１ ８ 测 ｌｓ ｘ ． １进 行 基 因 分 型 分 析 。 结 果 可 通 过 一 次 测 序 反 应 完 成 对 ａ ＨＢ ＤＮＡ Ｐ 区的 基 因检 测 及 基 因型 分 析 。检 出 ＹＭＤ 变 异株 ８例 ， 中 ＹＩ 例 ， ＶＤ Ｖ． Ｄ 其 ＤＤ ５ Ｙ Ｄ ３例 。在 检 测 的 ４ ６例 标 本 中 ２ ３例 为 Ｂ基 因型 ， 阳性 率 为 ５ ． ； ２ 例 为 ｃ基 因 型 ， 阳性 率 ４ ． ； 基 因型 ２ ， ００ 有 １ 其 ５６Ｄ 例 阳性 率 ４ ４ 。Ｂ基 因型 ＨＢ 感 染 者 中 ＨＣ ． Ｖ Ｃ ２例 ， ８ ７ ； 占 ． Ｃ基 因 型 ＨＢ 感 染 者 中 ＨＣ Ｖ Ｃ ８例 ， ３ ． 。 结 论 直接 测 序 法 分 析 ＨＢ 常 见 耐 药 突 变位 点及 基 因 型 准 确 可 占 ８１ Ｖ
ｔ ｅ ｅ ｗｅ ｅ ２ ｈ ｐ ｔ ｃ ｌ ｌ ｒｃ ｒ ｉ ｏ ｈ ｒ ｒ ｅ ａｏ ｅｌ ａ ａ ｃｎ ｍａ（ ． ）ｉ ｅ ｏ ｙ ｅ Ｂ ｐ ｔ ｎ ， ｅ ａ ｏ ｅｌ ｌｒｃ ｒ ｉ ｏ ｕ ８７ ｎ ｇ ｎ ｔ ｐ ａ ｉ ｓ ８ ｈ ｐ ｔ ｃ ｌ ａ ａ ｃｎ ｍａ（ ８ １ ）ｉ ｅ ｏ ｙ ｅＣ ａ ｉｎ ｓ ｅ ｕ ３ ． ｎｇ ｎ ｔｐ ｐ ｔ ｔ． ｅ
乙肝病毒基因变异与抗病毒治疗预后的临床分析
乙组 ５例 ， 异 无 统计 学 意 义 ； 甲乙 组 服 药 前 、 药 后 差 但 服
３ ｎ ０ｍｉ 麻醉 时、 麻醉后 ５ｍ ｎ实施 手术 时 以及 手术 后 ３ ｉ ｉ ０ ｍｎ
比较 ， 异 均 有 统 计学 意义 （ ＜ ． ５ ， 明手 术 及 麻 醉 效 果 差 Ｐ ００ ） 说 令 人满 意 。
（ 稿 日期 ：００～ ８—１ ） 收 ２１ ０ ６
现代 医学 的发展使医生越来越 注重患者的 完整性 ， 这就 必 然要求临床医疗从 单纯 的生物 医学模 式 向生物 一心 理 一 社会 医学模式转变 ， 者的心理 反应 越来 越被 医生所 重视 。 患 在心理测量学上 ， 测定量表是用来量 化观察 中所 得到 印象的
组患者 中， 前处 于 焦虑 一抑郁 状 态 ９ 术 １例 ， 药 后处 于 焦 服
常的心理反应 ； ２ 服 药后 ３ ｉ， （） ０ ｍ ｎ 两组 Ｈ Ｄ测定值有 统计 Ａ
学 意义 。甲组 口服磷 酸可待 因片 １ ｇ和安定 片 ２ ５ｍ ５ｍ ． ｇ对
虑 一抑郁状态 ３ ， ５例 差异有统计 学意义 ， 明服用磷酸可 待 说
并设计联合或序贯治疗。
【 关键词 】
目前已在不 同的病变 和不 同感染 状态 的感 染者发 现许
多 变 异 ， 对 其 生 物 学 意 义 还 只是 推 测 性 的 … 。尽 管 变 异 引 但
１ 资料 与方 法
１１ 一般资料 ．
１８例 患 者 为 南 京 市 第 二 医 院 ２０ ０ ０ ２—２０ ０８
起感染 持续 或病变加重 的报道很多 ， 但可肯 定 因果关 系的证 据还很有限。本文从 ２０ ２ ０ ， ０ ２～ ０ ８年 对乙肝患者不 同感染状
不同民族大学生乙肝病毒基因型分布状况调查
Ｖｏ ． ． １３１ ＮＯ ２
Ｊ ｎ． ０ ２ ｕ ２ １
不 同 民族大 学 生 乙肝 病 毒 基 因型分 布 状 况调 查
李 劲 ， 莹 ， 刘 邓志芳 ， 胡文娟 ， 奎 ， 高 赵瑞杰 ， 红 ， 王 宋发军
（ １中南民族大学 生命 科学学院 ， 武汉 ４０ ７ ２中南 民族大学 校 医院， ３ ０４； 武汉 ４ ０ ７ ） ３０ ４ 摘 要 为 了解不 同民族大学生 乙型肝炎病毒 （ ｅａｔ ｉ ｓ ＨＢ 基 因型和亚型分 布状况 ， ｈｐ ｔｉ Ｂ ｖ ｕ ， Ｖ） ｉｓ ｒ 采用 限制性 片段
（ ｏ ｅｅｏ Ｌｆ Ｓｉ ｃ ， ｏｔ—ｅｔ ｌ ｎ ｅｓｙｆｒ ａｏ ａｔ ｓ Ｗｕａ ３０ ４ ｈｎ ； １Ｃ ｌｇ ｆ ｉ ｃ ｎｅ ＳｕｈＣ ｎ ａ Ｕ ｉ ｒｉ ｔ ｎｌｉ ， ｈｎ４ ０ ７ ，Ｃ ｉａ ｌ ｅ ｅ ｒ ｖ ｔ ｏ Ｎ ｉ ｉｅ ２Ｕ ｉｅｓｙＨ ｓｉ ， ｏｔ—ｅｔ ｎｖｒｉ ｒ ａ ｏａ ｔｓ Ｗｕ ａ ３ ０４ ｈｎ ） ｎｖｒｉ ｏｐｔ Ｓ ｕ Ｃ ｎｒ Ｕ ｉｅｓｙｆ ｔｎ ｉｅ ， ｈ ｎ ０ ７ ，Ｃ ｉ ｔ ｌ ａ ｈ ｌ ａ ｔ ｏＮ ｉ ｌ ｉ ４ ａ
Ｓｙ ｔＩ Ｄ Ｉ ｐｎ Ｈ ａｌ ｐ Ｉ
１ ２ ２ ＨＢ 的 ＤＮ 提 取 ． ． Ｖ Ａ
进行 检验 ．
取 ５ Ｌ乙肝 大三 阳患者 血 清 于 １５ ｐ管 ０ ．ｍＬＥ 中 ， 水 浴 １ｍｉ ， 却 至 室 温 ，４ ０ ｒｍｎ离 心 沸 ０ ｎ后 冷 １００／ ｉ
ｆ ５ ８ （ ４ ９ ）ａｄｇｎｔ ｅＤ ａｃｕ ｔ ｒ ．％ （／ ３ ． ｈ ｅ ｏ ｓａｅ ａ ｇｎｔ ｅＢ ｉ ｄｍ ｎｎ ｉ ａｌｈ ０ ２ ． ％ ２ ／ ３ ｎ ｅｏ ｐ ｃｏｎｅ ｆ ３ ４ ９ ） Ｔ ｉ ｄｍ ｎｔ ｔ ｔ ｔ ｅｏ ｐ ｏ ｉａｔｎ ｌｔｅ ｒ ｙ ｄｏ ４ ｓ ｒ ｄｈ ｙ ｓ ｎｔ ｎｌｉｓ ｅｏ ｐ ａｋ ｅｏｄｙａ ｄｌａｔｇｎｔ ｅＤ（ ＜０ ０ ） ｔ ｉ ｄ ｆ ｅｃｓｈｖ ｏ ｅ ｅｔｏ ｈ ａｉ ａ ｔ ，ｇｎ ｔ ｅＣ ｒｎ ｓｓｃｎｌ ｎ ｅｓ ｅｏ ｐ Ｐ ｏ ｉｅ ｙ ｙ ． １ ．Ｅｈ ｃ ｉｅ ｎｅ ａｅ ｎ ｆｃ ｎｔｅ ｎ ｆｒ ｆ
786例慢性乙型肝炎患者恩替卡韦基因型耐药突变及特征分析
基金项目"国家自然科学基金#(#(+")!)$%北京市自然科学基金#+#(!"+!$%北京市教育委员会科技计划重点项目#MW!"#(#""!&"%+$ 作者单位"#"""$'首都医科大学附属北京佑安医院#岳秀娟!李庆!王珊珊!陈德喜!石英$!北京市肝病研究所#王珊珊!陈德喜!石英$ 通信作者"石英!%&'()"/(+,24(!77&;-9<;-7+
表9五个突变位点单点和多点突变情况,例#B$-
突变位点
T#=?-?6@#() T#=?-?6E#+% T#=?-?6K!"! T#=?-?6=!&" T#=?-?6C#$'
单位点突变 与其他位点联合 #.0$&($ 突变#.0#!($
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乙型肝炎病毒基因分型荧光PCR检测及临床应用
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维普资讯
放射 免疫 学 杂 志 ２０ ０ ７年第 ２ 巷第 ６期 Ｊｏ ａｉｉ，ＵＡ０ ２０ ２ （ ０ ｆＲ ｄ‘ｌＩＵ，￣， ７．０ ６ ）ＵＩ ［ ０ １
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性 前列腺 炎容易复发 ， 因此 经治疗 后 ， 症状 及上述 指标检 测
ｆｒｇ ｏ ａ ｉｋ ａ ｓ ｓ ｍｅ ｔｉ ｈｅｐ ｍａ ｙ ｐ ｅ ｅ ｔ ｎ ｏ ｏ ｌ ｂ ｒｓ ｓ ｓ ｎ ｎ ｔ ｒ ｒ ｒ ｖ ｎ ｏ ｆ￣ ｌ ｉ ｖ ｓ ｕ ａ＂ ｉ． ｌ ｅ ｉ ｉ ｘ ｏ ａ ｃ ｌｌ ｄ ｓ ｔ ｅ ８ ８ ｃｒ ｕ ａ ｏ ａ ｅ ． ｉｃ ｌｔ ｎ．２ ０１ ０ １ １ ｉ ０ ．１ ３： ８ ３．
摘要
濮翔科
王永忠 陈 敏
杭双荣
目的 ： 了解 乙型肝炎病毒基因分型 、 分布及其 与肝功能 损害 、 病毒 复制水平 的关 系。方法 ： 采集 ６ ９
例 乙肝患者 血样 ， 用荧 光聚合酶链反应 （ Ｃ 检测 乙肝病毒基 因分型 ， 采 Ｐ Ｒ） 通过荧 光探针识 别基 因型特 异性 序
PCR-反向点杂交法检测乙型肝炎病毒的基因耐药变异与基因分型
出血临床 观察 ［ Ｊ ］ ． 中国当代 医药， ２ ０ １ ０ ， １ ７ （ １ ） ： ４ ３ — ４ ４ ．
［ １ Ｏ ］ 林道浙 ， 徐定银 ， 陈积 贤． 泰绫 在 甲状 腺手术 中的应用 ［ Ｊ ］ ． 中
华普外科手术学杂志 ， ２ ０ １ ０， ４ （ ２） ： ２ ０ ０ － ２ ０ ３ ． ［ １ １ ］Ｓ ｉ ｌ ｖ ｅ ｖ ｓ ｔ ｅ ｉ ｎ ＭＥ， Ｃ ｈ ｖ ａ ｐ ｉ ｌ Ｍ．Ｅ ｘ ｐ ｅ ｒ ｉ ｍｅ ｎ ｔ ａ ｌ ａ ｎ ｄ ｃ ｌ ｉ ｎ ｉ ｃ ａ ｌ ｅ ｘ ｐ ｅ ｉ ｒ ｅ ｎ ｃ ｅ ｓ ｗ ｉ ｓ ｈ ｃ ｏ ｌ ｌ ａ ｇ ｅ ｎ ｌ ｆ ｅ ｅ ｃ ｅ ａ ｓ ａ ｈ ｅ ｍｏ ｓ ｔ ａ ｔ ｉ ｃ ａ ｇ ｅ ｎ ｔ ［ Ｊ ］ ．Ｊ Ｔ ｒ ａ ｕ ｍ ａ ， １ ９ ８ １ ， ２ １
［ ７ ］刘远成 ， 叶伟 明， 沈 奎． 痔术 后出血 的预 防及 治疗 ［ Ｊ ］ ． 中医药
临床杂志 ， ２ ０ １ ０， ２ ２ （ ３ ） ： ２ ５ ４ － ２ ５ ５ ． ［ ８ ］贺平 ， 谢敏江 ， 张桢， 等． 地奥 司 明用 于痔外 剥 内扎 术后 ４ ７ （ ９） ： １ ０ ８ １ － １ ０ ８ ２ ． ［ ９ ］卢本银 ， 李扬轶 ， 赖彪 ， 等． 痔上动脉缝 扎术预 防外 剥 内扎术后
血绫是 由纯天然再 生纤维素经化学变性后而成 ， 无 毒、 无害 ， 不 含任何 药 物 ， 遇 血后 与 手 术 创 面 贴 敷 严
密， 然后 逐渐 溶化膨 胀 成半 透 明凝胶 样 ， 具 有很 好 的 物理 、 生理 、 化 学 止血 功 效 ， 除用 于一 般 止 血 外 ， 还用 于 创 面 广 泛 渗 血 和 体 内 某 些 特 殊 部 位 的 止 血 。本研 究 显示 ， 治疗 组术 后 １ 、 ３ 、 ５ ｄ出血 症状
不同临床类型慢性乙肝患者乙肝病毒基因型检测_牟一坤
乙型肝炎病毒基因型与耐药病毒株的相关性研究
（ 东省 深 圳 市 中 医 院 ：． 验 科 ；． 家级 肝 病 重 点 专 科 ５ ８ ３ ） 广 １检 ２国 １ ０ ３
摘 要 ： 的 研 究 乙型肝 炎病 毒 （ Ｖ） 因型 与耐 药病 毒 株 产 生 的相 关性 。方 法 征 集 ３ ０例 接 受 拉 米 夫 定 治 疗 １年 以 目 ＨＢ 基 ４ 上 的 慢 性 乙型 肝 炎 （ ＨＢ 患 者 为研 究 对 象 。采 集血 样 经 离 心 分 离血 浆 ， 行 ＨＢ Ｄ Ｃ ） 进 Ｖ ＮＡ 定 量 检 测 ， 进 行 基 因 测 序 和 基 因 分 型 。 再 结 果 基 因测 序 和 基 因型 分 析 结 果 为 ： 型 １ Ａ ６例 （ ． ） Ｂ 型 ｌ ２例 （ ２ ９ ） Ｃ型 １ ８例 （ ３ ５ ） Ｄ 型 ４ ４７ ， １ ３． ， ４ ４ ． ， ４例 （ ２ ９ ） Ｂ Ｃ １． ， ／
ｇ ｎ ｔｐ ６ （ ２ １ ） ｉ ｅ ｏ ｙ ｅＣ， （ ８ ２ ）ｉ ｅ ｏ ｙ ｅＤ ａ ｄ４ ２ ． ）ｉ ｘ ｄｇ ｎ ｔｐ Ｃ． ｎ ｌｓ ｎ Ｔｈ ｒ ｑ ｅ — ｅ ｏ ｙ ｅＢ，４ ４ ． ｎｇ ｎ ｔｐ ８ １ ． ｎ ｇ ｎ ｔ ｐ ｎ （ ０ ０ ｎｍｉｅ ｅ ｏ ｙ ｅＢ／ Ｃｏ ｃｕｉ ｕ ｅｆｅ ｕ ｎ
取 １ ０ Ｌ血 清 与 蛋 白酶 Ｋ 混合 后 ， ０
耐药 的相 关 性 尚未 完 全 明 晰 。 本 课 题 旨 在 通 过 揭 示 ＨＢ 基 Ｖ 因型 与 Ｌ ＡＭ 耐 药 的 关 系 ， 临 床 优 化 ＣＨＢ治 疗 方 案 ， 明 为 阐
裂 解 缓 冲液 １０℃ 孵 育 １ ｉ， 过 酚／ 仿 抽 提 ， 醇 沉 淀 ， ０ ０ｒ ｎ 通 ａ 氯 乙
乙型肝炎病毒耐药突变基因的检测与分析
乙型肝炎病毒耐药突变基因的检测与分析姜清明【摘要】目的检测该院2013年-2015年乙型肝炎患者基因分布及病毒耐药基因突变情况及相关性和临床意义.方法采用荧光定量和基因芯片技术检测240例乙型肝炎患者乙肝病毒(HBV)基因型和对拉米夫定、阿德福韦、恩替卡韦和替比夫定药物突变基因型.结果 240例乙型肝炎患者中,HBV基因型包括:B型61.3％(147/240)、C型25.0％(60/240)、B和C混合型5.4％ (13/240)、其他型8.3％(20/240),未检出D型.182例未出现耐药,拉米夫定耐药突变44例,阿德福韦出现耐药突变者7例,恩替卡韦出现耐药突变者6例,替比夫定出现耐药突变者为1例.M204V以及M204I是两种常见的拉米夫定耐药突变情况,在阿德福韦耐药突变中以N236T±A181位碱基替换相对常见;T184位碱基替换是恩替卡韦耐药突变的典型代表;M204I是替比夫定耐药突变的主要表现.部分从来没有采用核苷酸等药物治疗者也有可能被检测出耐药突变情况.44例出现拉米夫定耐药的基因型中,180M 及其混合突变型占86.4％(38/44),C型HBV基因突变占61.4％(27/44),且主要为180M耐药突变型(24/27).结论检测乙型肝炎病毒耐药突变基因,可以帮助医学工作者确定患者是否存在耐药性,从而选择恰当的抗病毒方法对其进行治疗.【期刊名称】《中国医学工程》【年(卷),期】2017(025)002【总页数】3页(P84-86)【关键词】肝炎病毒;乙型;耐药;突变基因【作者】姜清明【作者单位】广东省粤北第二人民医院检验科,广东韶关512231【正文语种】中文【中图分类】R512.62乙型肝炎简称乙肝，作为全球性关注的公共卫生问题，严重威胁到人类健康，据报道，慢性乙型肝炎病毒携带者全球多达3.6亿人，在中国，乙肝病毒携带者占三分之一。
乙型肝炎可成为肝硬化、肝癌和肝衰竭的诱因，严重者甚至可引发死亡。
HBV(共56张)
HBV基因型与肝硬化的关系(guān xì)
第45页，共56页。
HBV基因型和肝细胞癌的关系(guān xì)
KAO等在进一步对67 例无症状HBV携带,103 例慢性 肝炎,32 例肝硬化,20 例肝细胞癌患者进行基因分型 研究中发现,各组均以B/ C 型为主,C基因型所占比例 按上述顺序逐渐增大,而B 基因型的比例逐渐减小;与 B 基因型比较,C 基因型在肝硬化及50 岁以上的肝细 胞癌患者中比例较高,而B 基因型与50 岁以下,特别 是35 岁以下的肝细胞癌患者有关。
已发生YMDD变异的患者，使用恩替卡韦耐药几率较 大
第31页，共56页。
替比夫定耐药变异(biànyì)
突变株与拉米夫定存在交叉耐药
发生率较拉米夫定低
治疗一年后，耐药性显著增强
第32页，共56页。
1896变异(biànyì)
使用干扰素治疗，HBV前C区A1896的G突变为A，使 TGG变为TAG，为前C区终止突变
HBsAg:
以三种不同形式存在于患者血清中 HBsAg亚型的分布有明显地区差异,并与
种族有关 血清HBsAg是感染HBV的重要标志
HBsAg刺激机体产生的抗-HBs是中和抗体,对 机体有保护作用
第16页，共56页。
HBcAg 存在于Dane颗粒(kēlì)中 不易在血液中检出
可在感染的肝细胞表面存在 刺激机体产生抗-HBc（IgG、IgM） 血清抗-HBc IgM的检出，表明病毒在肝细 胞中复制
HBeAg累积(lěijī)清除率
第43页，共56页。
HBV 基因型与病毒(bìngdú)致制病性的关系
日本学者Shiina分析了1744 例HBsAg 阳性者的基因型 与肝功能异常的关系后发现,与B 基因型相比,C 基因型 的肝功能异常更为常见。
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全科医学临床与教育2014年3月第12卷第2期Clinical Education of General Practice Mar.2014，Vol.12，No.2DOI ：10.13558/ki.issn1672-3686.2014.02.012作者单位：314000浙江嘉兴，嘉兴市第一医院感染科由于乙型肝炎病毒（hepatitis B virus ，HBV ）在逆转录过程中缺乏校对酶的作用，容易发生碱基错配，长期点突变累积形成不同基因型，根据其全基因序列同源性＞92％的标准可将HBV 分为A～H 8种基因型[1]。
HBV 基因型呈一定的地域性分布，不同基因型与疾病的发展及预后关系密切。
嘉兴地处浙北地区，本次研究在嘉兴慢性乙型肝炎患者中进行了HBV 基因型与乙型肝炎疾病进程、核苷类药物耐药的相关性分析。
现报道如下。
1资料与方法1.1一般资料选取2011年2月至2013年2月嘉兴市第一医院住院的慢性乙型肝炎（chronic hepatitis b ，·临床研究·嘉兴地区乙肝病毒基因分型与病理及耐药的关系李洁萍谢新生张戡邓敏吴建明[摘要]目的了解嘉兴地区慢性乙型肝炎（CHB ）患者乙型肝炎病毒（HBV ）基因型分布的特点，探讨基因型与病理及核苷类药物耐药之间的关系。
方法采用荧光定量聚合酶链反应方法检测85例CHB 患者的HBV 基因型，同时检测血清HBV DNA 、乙肝三系、核苷类药物耐药，并进行肝组织病理检查。
结果85例CHB 患者B 基因型32例（37.65％）、C 基因型53例（62.35％），C 基因型患者的HBV DNA 水平、HBeAg 阳性率均明显高于B 基因型，差异均有统计学意义（t =2.78，χ2=8.03，P 均＜0.05）。
肝组织炎症坏死及肝纤维化的进展程度，C 基因型较B 基因型明显加重，差异均有统计学意义（χ2分别=8.82、10.67，P 均＜0.05），C 基因型较B 基因型发生拉米夫定、替比夫定耐药更多，差异均有统计学意义（χ2分别=4.03、4.03，P 均＜0.05）。
结论嘉兴地区CHB 患者HBV 基因型以C 型为主，C 型HBV 复制能力强，拉米夫定、替比夫定耐药更多，更易导致严重肝脏病变。
HBV 基因分型对判断肝脏病变的严重程度和指导临床抗病毒治疗具有重要意义。
[关键词]乙型肝炎病毒；基因型；肝/病理学；HBV DNARelationship of hepatitis B virus genotyping ，pathology and drug resistance in Jiaxing LI Jieping ，XIE Xinsheng ，ZHANG Kan ，et al.Department of Infection ，The First Hospital of Jiaxing ，Jiaxing 314000，China[Abstract]ObjectiveTo understand the distribution characteristics of hepatitis B virus （HBV ）genotype in chronic hep 鄄atitis B （CHB ）patients and explore the relationship between the genotype ，pathological and nucleoside drugs resistance.MethodsThe HBV genotypes of 85cases of patients with CHB were detected by fluorescence quantitative polymerasechain reaction （PCR ）.The serum HBV DNA ，three series of hepatitis b and nucleoside drugs resistance were detected and liver tissue pathologic were examined.Results There were 32cases （37.65％）of B genotype in 85patients with CHB ，53cases （62.35％）of C genotype.HBV DNA levels ，HBeAg positive rate of C genotype patients were significantly higher than B genotype （t =2.78，χ2=8.03，P ＜0.05）.Inflammation of the liver tissue necrosis and the progression of liver fibrosis of C genotype patients were significantly more serious than B genotype （χ2=8.82，10.67，P ＜0.05）.The lamivudine and telbivu 鄄dine resistances of C genotype were significantly more than B genotype （χ2=4.03，4.03，P ＜0.05）.ConclusionThe mainHBV genotype in patients with CHB in Jiaxing is C genotype ，whose replication ability is strong and more resistable for lamivudine and telbivudine ，more likely to lead to severe liver disease.It is significance to judge the severty of liver dis 鄄ease and guide clinical treatment with HBV genotype.[Key words]hepatitis B virus ；genotype ；liver/pathology ；HBV DNA·159·全科医学临床与教育2014年3月第12卷第2期Clinical Education of General Practice Mar.2014，Vol.12，No.2CHB）患者共85例，其中男性62例、女性23例；平均年龄（37.20±11.43）岁；所有病例诊断标准均符合2005年制定的慢性乙型肝炎防治指南[2]。
均排除合并其他类型肝炎病毒感染以及药物性肝病、酒精性肝病、自身免疫性肝病、代谢性肝病等。
1.2方法所有病例在进行血清学HBV标志物（HBV-M）、HBV DNA定量、超声及肝穿刺病理等检查的同时，均采血4 ml，留取血清-30℃集中保存，采用实时荧光定量聚合酶链反应法测定HBV DNA定量及基因型分型耐药检测和采用酶联免疫吸附检测法测定HBV-M，肝组织取材均在彩超引导下通过弹射式组织活检枪方法取得。
肝组织长度1.0～1.5 cm，取材后立即10％甲醛固定、常规脱水、浸蜡包埋，进行厚度为4 μm 连续切片。
由高年资病理科医师进行盲法阅片。
病理诊断按《病毒性肝炎防治方案》的诊断标准[3]，进行慢性肝炎的炎症分级（G0～G4）和纤维化分期（S0～S4）。
1.3统计学方法采用SPSS 13.0统计软件。
计量资料以均数±标准差（ｘ±ｓ）表达，采用t检验；计数资料采用χ2检验。
设P＜0.05为差异有统计学意义。
2结果2.1HBV基因型与HBV DNA及HBeAg的关系见表1由表1可见，85例CHB患者B基因型32例（37.65％）、C基因型53例（62.35％）；C基因型HBV DNA定量及HBeAg阳性构成数均明显高于B基因型，差异均有统计学意义（t=2.78，χ2 =8.03，P均＜0.05）。
2.2HBV基因型与患者肝组织学改变的关系见表2由表2可见，肝组织炎症坏死及肝纤维化的进展程度，C基因型较B基因型明显加重，差异均有统计学意义（χ2分别=8.82、10.67，P均＜0.05）。
2.3HBV基因型与核苷类药物耐药的关系见表3由表3可见，C基因型较B基因型发生拉米夫定、替比夫定耐药更多，差异有统计学意义（χ2分别=4.03、4.03，P均＜0.05），阿德福韦、恩替卡韦和替诺福韦等其他核苷类药物耐药检测，B、C基因型差异均无统计学意义（χ2分别=1.77、1.24、0.61，P均＞0.05）。
3讨论乙型肝炎病毒的基因型在我国以B型、C型为主，其中北方主要是C型，南方则以B型为主，而浙江、南京地区B、C型比例相当[4，5]。
本次研究结果显示，嘉兴85例CHB患者中，C基因型53例，占62.35％，B基因型32例，占37.65％，嘉兴地区HBV感染者基因型以C型为主，可与嘉兴外来务工人员多，人口流动性大有关。
HBV感染后的临床转归受多种因素的影响，HBV基因型可能是其中重要因素之一。
研究表明，B 基因型与较轻的病变有关，C基因型与较重的病变有关[6，7]。
本次研究显示HBV DNA 定量及HBeAg阳性率C基因型明显高于B基因型（P均＜0.05），肝脏病理学证实，在肝纤维化及炎症坏死程度较重的患者中，C基因型比例明显高于B基因型（P均＜0.05）。
说明C型病毒株致病性、复制性增强，易形成持续的病毒血症，不易发生e抗原的转换，更易出现较严重的肝脏病变。
同时也说明C基因型HBV感染者预后比B 基因型者差，可能与C基因型HBV感染病毒不易被清除，病毒血症水平高，持续时间长有关。
本次研究显示，B基因型及C基因型的慢性乙型肝炎患者均有核苷类药物耐药情况发生。
但相比B 基因型，C基因型发生拉米夫定、替比夫定耐药更多（P均＜0.05）。
这可能是C基因型HBV感染者预后比B基因型者差的又一原因。
拉米夫定是抗乙肝病毒的主要药物之一，因其抗病毒作用确切而被广泛用于治疗慢性乙型肝炎。
随着拉米夫定的广泛应用，由拉米夫定导致的耐药问题逐渐成为人们关注的基因型n HBVDNA/logHBeAg阳性/例（％）HBeAg阴性/例（％）B型32 6.20±0.5613（40.63）19（59.37）C型537.12±0.63*38（71.70）*15（28.30）表1HBV基因型与HBV DNA、HBeAg水平的关系注：*：与Ｂ型基因比较，P＜0.05。