TUNEL法检测PRRSV感染Marc细胞凋亡的研究

７２ ｈ、９６ ｈ、１２０ ｈ 和 １４４ ｈ 取出接毒和正常对照组 ２ 可 看 出 ，正 常 对 照 组 细 胞 的 细 胞 凋 亡 水 平 极 低 ，
的细胞（ 如果细胞脱落，则将脱落细胞收集后进行 且 在 不 同 时 间 细 胞 凋 亡 水 平 变 化 不 大 ， 而 感 染
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中国预防兽医学报
本研究以 ＰＲＲＳＶ－ＳＣ１ 四川分离株感染体外培养 的 Ｍａｒｃ－１４５ 细胞为模型，通过 ＴＵＮＥＬ 法对 ＰＲＲＳＶ 引起的宿主细胞凋亡的动态变化规律进行了研究， 现将研究结果报告如下。
洗 ３ 次；（ ６） 加 ５０ μＬ 转 换 ＰＯＤ 溶 液 ， 加 上 覆 盖 膜 ， 放 在 湿 盒 中 ３７ ℃ 作 用 ３０ ｍｉｎ， ＰＢＳ 漂 洗 ３ 次；（ ７） 加 ５０ μＬ ＤＡＢ 底 物 ，１５ ℃ ～２５ ℃ 湿 盒 中 避光显色 １０ ｍｉｎ，ＰＢＳ 漂洗；（ ８） 按常规 方法进行 苏木精复染，盐酸酒精分化，自来水蓝化，酒精系 列脱水，二甲苯透明，封片，显微镜下观察。 １．２．３ 凋亡细胞的统计和分析：细胞核呈蓝色的为 正常细胞，细胞核呈棕黄色或棕褐色的为凋亡细 胞。对感染 ＰＲＲＳＶ 后 不 同 时 间 点 的 细 胞 在 光 镜 下 任选一定数目的视野进行凋亡细胞计数，统计 ＰＲＲＳＶ 感 染 诱 导 Ｍａｒｃ－１４５ 细 胞 凋 亡 的 百 分 率 并 进
第 ２９ 卷 第 １ 期 ２００７ 年 １ 月
中国预防兽医学报
Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｒｅｖｅｎｔｉｖｅ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ
Ｖｏｌ．２９，Ｎｏ．１ Ｊａｎ． ２００７
ＴＵＮＥＬ 法检测 Ｐ ＲＲＳ Ｖ 感染 Ｍａ ｒｃ－１４５ 细胞凋亡的研究
汪铭书 １，２，程安春 ， １，２＊ 刘伍梅 １，３，刘 芳 １，李雪梅 １，张平英 １，周 毅 １，陈孝跃 １
应，可以原位地、较特异的显示发生凋亡的细胞， 而正常的或正在增殖的细胞几乎没有 ＤＮＡ 的断裂， 因而没有 ３＇－ＯＨ 形成，很少能够被染色 ， ［９，１０］ 因此， 细胞凋亡可用原位末端标记（ 末端脱氧核苷酸转移 酶介导的生物素化的 ｄＵＴＰ 切口末端标记，Ｔｅｒｍｉｎａ ｄｅｏｘｙ ｎｕｃｌｅｏｔｉｂｙｌ ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｄＵＴＰ－ｂｉｏｔｉｎ ｎｉｃｋ ｅｎｄ ｌａｂｅｌｌｉｎｇ，ＴＵＮＥＬ） 法进行检测。
对感 染 ＰＲＲＳＶ 后 不 同 时 间 点 的 细 胞 在 光 镜 下 任选 ６ 个 视 野 进 行 凋 亡 细 胞 计 数 ，统 计 ＰＲＲＳＶ 感 染诱导 Ｍａｒｃ－１４５ 细 胞 凋 亡 的 百 分 率 ，结 果 见 表 １。 方差分析表明，对照组细胞在不同时间点的细胞
用 含 １０ ％ 新 生 牛 血 清 和 １００ μｇ／ｍＬ 青 ／ 链 霉 素 的 凋 亡差异不显著（ Ｐ＞０．０５）；感染 ＰＲＲＳＶ 的细胞在
关键词：猪呼吸与繁殖障碍综合征病毒；细胞凋亡；ＴＵＮＥＬ 法
中图分类号：Ｓ８５２．１６
文献标识码：Ａ
文章编号：１００８－０５８９（２００７）０１－００４２－０４
Ｓ ｔｕｄｉｅ ｓ ｏｎ ａ ｐｏｐｔｏｓ ｉｓ ｏｆ Ｍａ ｒｃ－１４５ ｃｅ ｌｌ ｌｉｎｅ ｉｎｄｕｃｅ ｄ ｂｙ Ｐ ＲＲＳ Ｖ ｄｅ ｔｅ ｃｔｅ ｄ ｂｙ ＴＵＮＥＬ ｍｅ ｔｈｏｄ
ＷＡＮＧ Ｍｉｎｇ－ｓｈｕ１，２， ＣＨＥＮＧ Ａｎ－ｃｈｕｎ１，２＊ ， ＬＩＵ Ｗｕ－ｍｅｉ１， ＬＩＵ Ｆａｎｇ１， ＬＩ Ｘｕｅ－ｍｅｉ１， ＺＨＡＮＧ Ｐｉｎｇ－ｙｉｎｇ１， ＺＨＯＵ Ｙｉ１， ＣＨＥＮ Ｘｉａｏ－ｙｕｅ１
（１． Ａｖａｉｎ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ， Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ｏｆ Ｓｉｃｈｕａｎ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｙａ＇ａｎ ６２５０１４， Ｃｈｉｎａ； ２． Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｄｉｓｅａｓｅ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｈｅａｌｔｈ ｏｆ Ｓｉｃｈｕａｎ Ｐｒｏｖｉｎｃｅ， Ｙａ＇ａｎ ６２５０１４， Ｃｈｉｎａ； ３． Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ａｑｕｉｃｕｌｔｕｒｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ｏｆ Ｓｉｃｈｕａｎ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｐｉｘｉａｎ ６１１７３０， Ｃｈｉｎａ）
２００７ 年
ＰＲＲＳＶ 的 Ｍａｒｃ－１４５ 细 胞 凋 亡 水 平 变 化 很 大 ： 在 接 毒后的 ０ ｈ、２４ ｈ，对照组与接毒组差异不显著，而 在 接 毒 后 ４８ ｈ 明 显 上 升 ， 在 ７２ ｈ 达 到 最 高 峰 值 ， 在 ９６ ｈ、１２０ ｈ 又显著下降，在 １４４ ｈ 低于同期对照 组。
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ ： ｐｏｒｃｉｎｅ ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ ａｎｄ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｓｙｎｄｒｏｍｅ ｖｉｒｕｓ（ＰＲＲＳＶ）； ａｐｏｐｔｏｓｉｓ； ＴＵＮＥＬ
＊Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ ａｕｔｈｏｒ
猪繁殖和呼吸综合征病毒（ Ｐｏｒｃｉｎｅ ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ ａｎｄ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｓｙｎｄｒｏｍｅ ｖｉｒｕｓ，ＰＲＲＳＶ） 是引起猪繁 殖与呼吸综合征（ Ｐｏｒｃｉｎｅ ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ ａｎｄ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｓｙｎｄｒｏｍｅ，ＰＲＲＳ） 的病原，可分为欧洲和美洲两个 基因型。据报道，ＰＲＲＳＶ 的两个基因型均能在体内
版即可进行 ３＇ 端的脱氧核苷酸合成，如果在反应系 （ ４） 加 ５０ μＬ ＴＵＮＥＬ 反应混合液，加上覆盖膜，湿
中加入标记的脱氧核苷酸，则在 ３＇ 端出现一段带有 盒中 ３７ ℃作用 １ ｈ，ＰＢＳ 漂洗 ３ 次；（ ５） 用 ３ ％的
标 记 物 的 寡 核 苷 酸 ， 通 过 荧 光 显 示 或 其 他 显 色 反 小牛血清白蛋白（ ＢＳＡ） ３７ ℃封闭 ２０ ｍｉｎ，ＰＢＳ 漂
外诱导细胞凋亡（ Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）［１￣８］。研究 ＰＲＲＳＶ 感染 与细胞凋 亡 的 关 系 ，有 助 于 我 们 认 识 ＰＲＲＳＶ 感 染 的发生、发展及转归机制，为进一步阐明 ＰＲＲＳ 的 致病机制和防治提供依据。
细胞在凋亡过程中发生一系列的形态学、生物
收稿日期：２００６－０２－１４ 基金项目：四川省十五攻关重大生物技术项目（ ０１ＮＧ０１８－０１）、四川省重点建设学科项目（ ＳＺＤ０４１８） 和教育部新
Ａｂｓ ｔｒａｃｔ： Ｔｏ ｅｖａｌｕａｔｅ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｏｆ Ｍａｒｃ－１４５ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ ｐｏｒｃｉｎｅ ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ ａｎｄ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｓｙｎｄｒｏｍｅ ｖｉｒｕｓ （ＰＲＲＳＶ）． Ｓａｍｐｌｅｓ ｗａｓ ｃｏｌｌｅｃｔｅｄ ａｔ ０ ｈ， ２４ ｈ， ４８ ｈ， ７２ ｈ， ９６ ｈ， １２０ ｈ ａｎｄ １４４ ｈ ｗｈｅｎ ｔｈｅ Ｍａｒｃ－１４５ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ ｗａｓ ｉｎｆｅｃｔｅｄ ｗｉｔｈ ＰＲＲＳＶ ａｎｄ ｗｅｒｅ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｂｙ ＴＵＮＥＬ ｍｅｔｈｏｄ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ｔｈａｔ ＰＲＲＳＶ ｃａｎ ｉｎｄｕｃｅ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｏｆ Ｍａｒｃ－１４５ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ ｉｎ ｖｉｔｒｏ， ａｎｄ ｔｈｅ ｅａｒｌｉｅｓｔ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｃｅｌｌ ｗａｓ ｏｂｓｅｒｖｅｄ ａｔ ２４ ｈ ｐｏｓｔ－ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ， ｍｏｒｅ ａｔ ４８ ｈ ａｎｄ ｒｅａｃｈｅｄ ｔｈｅ ｐｅａｋ ａｔ ７２ ｈ． Ｔｈｅｎ ｔｈｅ ａｍｏｕｎｔｓ ｏｆ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｃｅｌｌ ｗｅｒｅ ｒｅｄｕｃｅｄ ｓｕｂｓｅｑｕｅｎｔｌｙ， ａｎｄ ｌｏｗｅｒ ｔｈａｎ ｔｈａｔ ｏｆ ｃｏｎｔｒｏｌ ｇｒｏｕｐ ａｔ １４４ ｈ．
（ １． 四川农业大学动物科技学院禽病防治研究中心，四川 雅安 ６２５０１４；２． 动物疫病与人类健康四川省重点实验室， 四川 雅安 ６２５０１４；３． 四川农业大学水产学院，四川 郫县 ６１１７３０）
摘 要：为了研究 ＰＲＲＳＶ 诱导 Ｍａｒｃ－１４５ 细胞凋亡的动态变化规律，收集 ＰＲＲＳＶ－ＳＣ１ 株感染 Ｍａｒｃ－１４５ 细
１ 材料和方法
行方差分析。
１．１ 材 料
２结果
１．１．１ 病毒和细胞：ＰＲＲＳＶ－ＳＣ１ 四川分离株，由动 物疫病与人类健康四川省重点实验室分离、鉴定 ， ［１１］ 对 Ｍａｒｃ－１４５ 细 胞 的 ＴＣＩＤ５０ 为 １０－６．５２／０．０４ ｍＬ； Ｍａｒｃ－ １４５ 细胞，由本实验室保存。 １．１．２ 主 要 试 剂 ： ＭＥＭ 培 养 基 、 新 生 牛 血 清 为
胞 ＤＮＡ 断 裂 是 无 规 则 的 ， 其 中 也 有 少 数 可 出 现 ３＇－ＯＨ 的暴露，但数量极小，不易检测出来），以此
３ 次（； ２） 加 ３ ％ Ｈ２Ｏ２ 阻断液 ２０ ℃作用 １０ ｍｉｎ，ＰＢＳ 漂洗 ３ 次（； ３） 加渗透液（ ０．１ ％ ＴｒｉｔｏｎＸ－１００ 柠檬酸
特性，在末端脱氧核苷酸转移酶的作用下，无需模 钠 缓 冲 液） 于 ４ ℃ 作 用 ２０ ｍｉｎ， ＰＢＳ 漂 洗 ３ 次 ；
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化学、细胞学及分子生物学方面的改变。其中生化 涂片）。用 ＰＢＳ 缓冲液清洗备用。
特征之一是在细胞发生凋亡时，内源性的 ＤＮＡ 内 １．２．２ ＴＵＮＥＬ 法 检 测 ： 参 照 试 剂 盒 说 明 书 进 行 ：
切酶激活导致 ＤＮＡ 断裂而断端 ３＇－ＯＨ 暴露（ 坏死细 （ １） 用 ４ ％的多聚甲醛固定 １ ｈ，用 ＰＢＳ 缓冲液漂洗
３７ ℃吸附 １ ｈ 后，倒掉－１４５ 细 胞 后 引 起 的 细 胞 凋
清和 １００ μｇ／ｍＬ 青 ／ 链霉素的 ＭＥＭ， 于 ３７ ℃ 细 胞 亡百分率与感 染 不 同 时 间 点 绘 制 的 ＰＲＲＳＶ 感 染 诱
培 养 箱 中 培 养 。 分 别 于 接 毒 后 ０ ｈ、 ２４ ｈ、 ４８ ｈ、 导 Ｍａｒｃ－１４５ 细胞凋亡的动态变化规律见图 ２。从图
ＭＥＭ 将 Ｍａｒｃ－１４５ 细胞传代培养于 ２ 个含盖玻片的 ２４ ｈ 和 １４４ ｈ 与 对 照 组 细 胞 相 比 ， 差 异 不 显 著
６ 孔细胞培养板内，待细胞长成单层后，其中一个 （ Ｐ＞０．０５），而在感染后 ４８ ｈ、７２ ｈ、９６ ｈ、１２０ ｈ 与
按每孔 ２５×１０６．５２ ＴＣＩＤ５０ 的剂量接种 ＰＲＲＳＶ－ＳＣ１ 株， 对照组细胞相比，差异极显著（ Ｐ＜０．０１）。
世纪优秀人才支持计划项目（ ＮＣＥＴ－０４－０９０６） 作者简介：汪铭书（ １９６４～），女，苗族，贵州凯里人，博士，教授，主要从事动物病毒分子生物学的教学和研究． ＊ 通讯作者：Ｅ－ｍａｉｌ：ｃｈｅｎｇａｎｃｈｕｎ＠ｖｉｐ．１６３．ｃｏｍ．
第１期
汪铭书，等． ＴＵＮＥＬ 法检测 ＰＲＲＳＶ 感染 Ｍａｒｃ－１４５ 细胞凋亡的研究
Ｍａｒｃ－１４５ 细胞感染 ＰＲＲＳＶ 后 不 同 时 间 ＴＵＮＥＬ 法检测细胞凋亡的结果见图 １。从图 １ 可看出，正 常对照组细胞和 ２４ ｈ、４８ ｈ 的细胞仅有少量细胞表 现为阳性，７２ ｈ、９６ ｈ、１２０ ｈ、１４４ ｈ 的阳性细胞明 显多于正常组。
ＧＩＢＣＯ 公司产品；Ｃｅｌｌ Ｄｅａｔｈ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ＴＵＮＥＬ 试剂 盒为 Ｒｏｃｈｅ 公司产品；其它试剂均为国产分析纯。 １．２ 方 法 １．２．１ Ｍａｒｃ－１４５ 细胞的 ＰＲＲＳＶ 感染及样品的采集：
胞后 ０ ｈ、２４ ｈ、４８ ｈ、７２ ｈ、９６ ｈ、１２０ ｈ、１４４ ｈ 和相同时间点未接种病毒的细胞样品，采用 ＴＵＮＥＬ 法进行细
胞凋亡的检测。结果表明，ＰＲＲＳＶ 能诱导 Ｍａｒｃ－１４５ 细胞发生凋亡；在 ＰＲＲＳＶ 感染后 ２４ ｈ 开始出现凋亡，４８ ｈ
凋亡更加明显，７２ ｈ 达到高峰，随后细胞凋亡水平又有所下降，在感染后 １４４ ｈ，细胞的凋亡水平低于正常组。