人工诱发单倍体及其应用

第十四章人工诱发单倍体及其应用

第一节植物单倍体概念及人工诱发单倍体的应用

一、植物单倍体与人工诱导单倍体概念

①具有单套染色体的植物体称为单倍体植物。

②人工诱导单倍体是指单倍体细胞在人工离体条件下培养，使其单性发育成植物体。

二、植物单倍体在植物育种中的应用

①可以控制杂种分离，缩短育种年限。

②排除显隐性基因的干扰，提高选择效率。

③加速自交系育成。

④单倍体是诱变育种的良好材料。

⑤单倍体是远缘杂交的优良方法。

⑥利用单倍体对栽培品种进行纯化复壮。

第二节花药培养

利用花药培养的方法诱导花粉形成单倍体植株的工作始于1964年（Gu Ha，et al，1964）。

单倍体植物的主要特点是孢子体细胞染色体数目和配子体细胞染色体数目相同，因此可以从其“表型”观察“基因型”。花药培养和获得单倍体植株基本培养过程见图14.1。

图14.1 花药培养与单倍体植株再生示意图

第三节花药培养应注意的问题

一、材料选择

（1）基因型

研究表明，供体植株的遗传背景对花药培养影响很大，如水稻中粳稻比籼稻易于培养。

（2）生理状态

花药供体植株的生理状态直接影响花粉愈伤组织的诱导率。如大田植株比温室植株、主茎穗比分蘖穗花粉愈伤组织的诱导率都明显高。

（3）花粉发育时期

早期研究表明，并不是任何发育时期的花粉都可在离体培养时期接受诱导产生愈伤组织或胚状体，只有那些发育到特定时期的花粉对离体刺激才最敏感。烟草和水稻的花粉从单核中期至双核早期都可接受离体诱导产生愈伤组织。小麦的花粉处于单核中期时培养效果最好。

二、预处理

在花药培养前进行低温冷藏可以提高培养效果，但不同材料所要求的温度和处理时间不同。如烟草为7︒C～9︒C处理7～14天；水稻为7︒C～10︒C处理10～15天；黑麦为1︒C～3︒C处理7～14天；大麦为3︒C～7︒C处理7～14天。

三、材料灭菌

用于花药培养的材料一般用0.1%氯化汞浸泡10 min，再用无菌水反复冲洗多次。

四、花粉植株诱导

以禾本科花粉植株的诱导为例，将花药接种在含2，4-D 1～2 mg/L诱导培养基上，诱导花粉细胞非正常发育的细胞分裂，形成愈伤组织。10～15天后花粉愈伤组织生长到直径约1.5～2.0 mm时，及时转移到分化培养基上（用NAA和kT取代2，4-D）（孙敬三，1995）。

提示：为了提高花粉植株的移栽成活率，有时将花粉植株从分化培养基上移至壮苗培养基上。壮苗培养基中除加入低浓度的NAA外，还要加入一定浓度的多效唑，对促进生根和抑制茎叶的徒长有明显效果。

第四节花粉培养

花粉培养即小孢子培养，是将花粉从花药中分离出来成为分散或游离状态，通过培养使花粉启动脱分化，进而发育成完整植株的一种技术。

花粉培养对研究高等植物遗传变异和作物育种具有重要意义。花粉培养具有单细胞、单倍性和较高同步性的优点，可以排除花丝和药壁等体细胞干扰，解决花药培养中再生植株倍性混乱的缺点，而且一个花药中花粉数量很多，可以提高单位培养基诱导率，节省人力与物力（见图9.2）。

图9.2 花粉培养与花药培养示意图

第五节花粉培养应注意的问题单倍体植株的鉴定和二倍化的方法

一、材料预处理

人们在研究中发现，对用于花粉培养的材料进行预处理，可以促进细胞脱分化，提高愈伤组织或体细胞胚诱导率。预处理的方法主要有黑暗处理、光质处理、高渗处理、药物处理和温度处理（低温或高温处理）等。

二、花粉的分离

花粉分离的方法一般包括机械分离法和花药漂浮培养自然释放法。每种分离方法操作程序和步骤完全不同，要求注意的问题也各异。前一种方法操作起来比较繁杂。后一种方法操作比较简单，是将花药直接接种在液体培养基上，经过1～7天的花药漂浮培养，花药壁自然裂开，花粉自然释放出来。注意要及时将花药壁从培养基中取出来，留下花粉继续培养。具体选用哪种花粉分离方法，还要根据试验的具体要求而定。

三、严格控制操作过程，杜绝污染源，提高花粉培养效率。

四、单倍体植株的鉴定和二倍化的方法

1、形态学鉴定和染色体分析

2、单倍体植株的二倍化

（1）、继代加倍

（2）、创伤法加倍

（3）、秋水仙素处理加倍