影响共焦荧光扫描显微镜分辨率的因素

影响共焦荧光扫描显微镜分辨率的因素
高万荣　聂守平　刘　明　陶纯堪　卞松龄
(南京理工大学电光学院,南京210094)
摘要　本文分析了影响共焦荧光扫描显微镜的各种因素——探测器小孔直径、杂散光、物镜孔径等,并以正在研制的一台共焦荧光扫描显微镜为例,讨论了如何抑制杂散光,在设计上保证系统高分辨率实现
的方法。

关键词　共焦;扫描;荧光显微镜;分辨率
Factors Influencing the Resolution of Laser Scanning Confocal Fluorescent
Microscope
Gao Wangro ng　Nie Shouping　Liu m ing　T ao Chunkan
(D epar tment o f Optics,Nanjing U niv er sity o f Science and T echnolog y,Nanjing210094)
Abstract　T his paper discusses v ar ious fa ct or s that influence the reso lutio n o f a confocal fluor escent mi-
cro sco pe,including the diamet er of the pinhole in fr ont o f t he detector,str ay lig ht a nd the numer ical
apert ur e.A design metho d is also pr esented in or der to ensur e the realization of the super-r eso lut ion of
the system.T he imag es of t hin optical sectio ns in thick samples are g iv en w hich sho w that t he instru-
ment desig ned w it h t he m ethod makes po ssible a new t ype of noninv asive o pt ical bio spy.
Key words　co nfo cal fluor escence micr oscope;r esolut ion;st ray light
1　引言
共焦扫描显微镜[1]因其优异的横向分辨率和纵向分辨率[2-5]而引起了人们广泛的注意和深入的研究,特别是用付里叶光学的方法建立了共焦扫描显微镜的3维光学传递函数与小孔直径的关系[6-10]。

本文从系统设计的角度详细分析了影响共焦扫描显微镜分辨率的各种因素,并以目前正在研制的一台共焦荧光扫描显微镜为例,讨论了改进显微镜分辨率的各种方法。

2　分辨率与探测器孔径的关系
共焦荧光扫描显微镜光学系统的原理如图1所示[7]。

点光源用激光器和聚光镜来实现。

而点探测器则可用在有一定探测面积的光电倍增管前面放置一个小孔来构成。

其直径在下面讨论。

照明光束在动镜的控制下作两维扫描,而试样由一微驱动器驱动沿光轴作一维纵向扫描(或者使试样作机械式3维扫描)。

探测器小孔所在的位置相应于点源的像
点位置。

图1　激光扫描荧光显微镜光学原理图
Fig.1　Optical diagram f or laser-scanning
fluorescence microscope
共焦荧光显微镜的3维强度点扩展函数数h(x,y, z),由下式给出[7]:
h(x,y,z)=h1(x,y,z)[h2(x,y,z)**t2(x,y)](1)式中**表示对坐标x和y的两维卷积,h1(x,y,z)是聚焦激光束的3维强度点扩展函数,h2(x,y,z)是荧光测量系统的3维点扩展函数,t2(x,y)是探测器的孔函数。

JOU R NA L O F O PT OEL ECT RO N ICS L A SER　V ol.9　N o.6　Dec.1998
本项目得到江苏省重点学科资助
收稿日期:1998-04-16　修订日期:1998-05-25
对于与光轴垂直的圆形探测器(或置于探测器前面的圆形孔径)
t 2(x ,y )=
1　(x 2+y 2)1
2≤
0　其他
(2)
式中 是通过物镜逆向投影到物空间的圆形探测器的孔径大小。

对式(1)和(2)进行3维付里叶变换,获得具有圆形探测器的共焦扫描荧光显微镜的3维光学传递函数:
H ( , )=H 1( , )***[H 2( , )J 1(2 )/( )]
(3)
式中, =( 2+y 2)1
2
=1/(x 2+y 2)12
,J 1(2 )/( )是
圆盘形函数(2)的付里叶变换。

对共焦扫描显微镜的3维光学传递函数与探测器小孔直径之间的依赖关系,许多人进行了研究[6,7,10,11]。

计算表明[7],进行3维成像时,探测器小孔的直径不必非常小,当小孔的直径等于爱里斑(Airy disk)的大小时,则从物体焦面上发出的通过物镜的几乎所有荧光光能量通过位于探测器前面的爱里斑大小的孔径,由此得探测器小孔直径为
d = 1.22
N A
(4)式中, 为物镜的放大率, 为光的波长,N A 为物镜的数值孔径。

由该公式确定探测器小孔的直径,一方面满足了共焦扫描系统对探测器小孔直径的要求,从而保证高的横向和纵向分辨率,另一方面,又最大限度地使从试样中发射的荧光能量被探测器接收。

3　分辨率与光源相干性的关系
显微镜的成像性质在很大程度上取决于所采用光源的相干性。

例如,传统非干涉显微镜的通带宽度是传统干涉显微镜的2倍。

在扫描显微镜中,这个性质也适用
[12]。

通过在最后的光电探测器前面放一个限制孔径
而构成的共焦扫描显微镜,系统的分辨率大大改善。

这种共焦扫描显微镜是一个干涉成像系统,其空间频带宽度是传统干涉显微镜的2倍。

这种高分辨率的获得是由于对探测系统的像面进行限制的结果。

由此可以设想,如果能够研制出非相干共焦显微镜,那么,其通带宽度将是传统干涉显微镜的4倍,于是便提出了共焦荧光扫描显微镜。

如果在试样中加入荧光物质,由于所产生的荧光场与入射辐射的强度成正比,因此,离开试样的辐射便是非相干的。

当荧光波长等于原始波长时[12],则共焦非干涉系统的分辨率是传统干涉显微镜的1.8倍,是传统非相干显微镜的1.3倍。

如果共焦非相干系统使用
一个环形通光孔径的透镜,则分辨率相应的改进分别是
传统干涉系统的2.3倍和传统非相干系统的1.7倍。

4　分辨率与杂散光的关系
与传统的显微镜一样,共焦显微镜物镜的数值孔径
越大,所用波长越短,系统分辨率越高;另一方面,由于探测器前接收小孔的尺寸不能过大,否则将损失共焦扫描系统特有的纵向分辨率。

因此,到达探测器表面的能量就很小。

因此,必须充分考虑杂散光的影响。

因为到达像面的杂散光会在像面上产生一附加的强度分布,从而进一步降低了像面的对比度,限制了系统分辨率的提高。

杂散光源主要有扫描镜面的多次反射,特别是二次反射;透镜边缘的散射;周围环境中能进入到探测系统中的光等。

为此在实际设计中,我们将整个系统密封在一个罩子里。

罩子的内表面作了发黑处理,并采取措施减少光学系统本身产生的杂散光。

我们所设计的共焦荧光扫描显微镜的结构原理图如图2所示。

图2　共焦荧光显微镜设计方案图Fig .2　Schematic diagram of the conf ocal
f luorescent microscope
共焦扫描显微镜分为试样扫描和光束扫描两种型式[1],每一种又有透射式和反射式。

我们的设计采用两者相结合(图2),即由光束扫描实现两维扫描,而纵深方向的扫描由一微驱动器驱动试样来实现。

为了尽可能减少荧光能量在分光镜上的反射损失,我们采用了一种特殊结构的分光元件,并在探测器接收小孔与聚光镜之前加上了消杂光罩,入射至小孔以外的光线,经过多次反射而被吸收样[13],如图3所示。

我们知道,共焦系统的根本特性,就是通过在探测器前面加一限制小孔来限制视场,并同时抑制掉与探测小孔共焦的试样上某一层次以外的光线。

因此,本设计采用这种消杂装置,有效地保证了系统分辨率的实现。

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502・光电子 激光 1998年　第9卷　
图3　抑制杂散光的光罩的结构
Fig.3　Structure of the hood used for the suppression
of stray light 5　实验结果
我们所研制的共焦荧光扫描显微镜的深度分辨率为0.10 m,横向分辨率为0.05 m。

图4所示为用这台仪器采集的几幅断层图象。

对生物样品等进行断层扫描的目的,就是为了能够用这些断层图象来合成样品的3维形貌,从而揭示生物组织的性质,为生物医学研究工作者提供强有力的工具。

3维合成软件已接近完成,所研制的共焦荧光扫描型微镜即将推广使用。

感谢南京医学院组胚实验室周菁老师提供细胞组
织并协助进行实验。

(a)Five-pointed s tar (b)Gratin g (c)Biological cell tiss ue
(d)Th e same biolog ical cell tissu e with tw o m icrons beneath the optical section
图4　用自行设计的激光扫描共焦荧光显微镜获得的断层图象
Fig.4　The images of thin optical sections in several thick samples obtained with the laser scanning conf ocal f luorescence microscope designed by us
参　考　文　献
1　T.Wilso n and C.J.R.Sheppar d.T heor y and P ractice of Scanning Op tical M icr oscopy.L undon:A cademic,1984
2　C.J.R.Sheppar d,T.W ilso n.Dept h of field in t he scan-ning micro sco pe.Op t.L ett,1978,3(3):115～117
3　N.Str eibl.T hree-dimensio nal imag ing by a micro sco pe.
J.Op t.Soc.A m,A,1985,2(2):121～127
4　B.Ber ter o,C.D e M ol,E.R.P ike.A nalytic inver sion fo r-mula fo r co nfocal scanning micr oscopy.J.Op t.S oc.A m.
A,1987,4(9):1748～1750
5　C.J.R.Sheppar d,X.Q.M ao,T hr ee-dimensional imag ing in a micro sco pe.J.Op t.Soc.A m.A,1989,6(9):1260～1269
6　V alter D razic.Dependence of two-and thr ee-dimensional optica l tr ansfer functio ns on pinhole r adius in a coher ent confocal micr oscope.J.Op t.S oc.A m.A,1992,9(5):725～731
7　S.Kaw ata,R.A rimoto,O.N akamur a.T hr ee-dimensional optical-t ransfer-function a nalysis for a laser-scan fluo-rescence micro sco pe1991,8(1):171～175
8　C.J.R.Sheppar d,M in Gu,X.Q.M ao.T hr ee-dimensional co herent t ranfster functio n in a r eflect ion-m ode confocal
scanning micr oscope.Op tics Communications,1991,81
(5):281～284
9　Shig eha ru Kimur a,Chusuke M una kat a.Calculatio n o f thr ee-dimensional o ptica l fluo rescent micr oscope.J.
Op t.Soc.A m.A,1989,6(7):1015～1019
10　T.W ilso n,A.R.Canlini.Size o f t he detector in confocal imaging systems.Op tics L etter s,1987,12(4):227～229 11　V alter Drazic.Dependence of tw o-and t hr ee-dimensio n-al o pt ical tr ansfer functions o n pinhole radius in a co-herent confocal micr o sco pe-reply t o co mments.J.Op t.
S oc.A m.A,1993,10(3):535～537
12　I.J.Co x,C.J.R.Sheppar d,T.w ilso n.Super-reso lutio n by confo cal fluo rescent micr oscope.Op tik,1982,60(4): 391～396
13　Gao Wanr ong,Zhang X ingzhen,Pan L aijiu,et al.T he Desig n of the Black Pat ch.Chinese J our nal of L aser s,
1996,B5(3):260～267
高万荣　男,1961年4月生。

1996年9月中国科学院西安光机所获光学博士学位。

现从事光学显微成像方面的研究,主要包括激光共焦扫描荧光显微镜的理论研究和产品开发,光学低相干显微成像的理论和实验研究。

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　第6期 高万荣等:影响共焦荧光扫描显微镜分辨率的因素。