实验二 木糖米氏常数的测定
米氏常数测定(精)
COOCH2 NHCH2OH
HCHO
COOCH2 NH(CH2OH)2
试剂器材
试剂
1. 10～40g/L酪蛋白溶液（pH8.5）： 四种不同［S］的酪蛋白标准溶液。 2. 中性甲醛溶液：75mL分析纯甲 醛加15mL 0.25%酚酞乙醇溶液， 以0.1M NaOH滴至微红，密闭于 玻璃瓶中。（自己配制） 3. 0.25%酚酞乙醇溶液： 4. 标准0.1M NaOH溶液。 5.胰蛋白酶溶液（已配好）
液，重复上述操作，分别测出V30、V20、V10。
利用上述结果，以1/v对1/[s]作图，即求出V与 Km值。
注意事项
（1 ）实验表明，反应速度只在最初一段时间内保持恒定， 随着反应时间的延长，酶促反应速度逐渐下降。原因有多种， 如底物浓度降低，产物浓度增加而对酶产生抑制作用并加速 逆反应的进行，酶在一定pH及温度下部分失活等。因此，研 究酶的活力以酶促反应的初速度为准。
此方程表明，当已知Km及V时，酶反应速度与底 物浓度 之间的定量关系。
双倒数作图法测定Km值： 1 Km 1 1 v V [S] V
胰蛋白酶的性质 胰蛋白酶催化蛋白质中碱性氨基酸（L-精 氨酸和L-赖氨酸）的羧基所形成的肽键水解， 产生自由氨基端。
氨基的测定
甲醛滴定法
COOCH2 NH2
HCHO
实验十六
底物浓度对酶促反应速度的影响 ——米氏常数的测定
目的要求
（1）了解底物浓度对酶促反应的影响。
（2）掌握测定米氏常数Km的原理和方法
实验原理
Km定义： Km值等于酶促反应速度达到最大反应速度一半时 所对应的底物浓度。
Km的意义
Km是酶的特性常数之一，不同的酶Km值不同，同
一种酶与不同底物反应Km值也不同。
米氏常数测定方法
酶活米氏常数实验一、实验前准备1、24孔板洗净烘干，准备足够枪头。
2、准备催化剂，在光下呈透明状为分散性较好，否则用超声清洗器（位于化学间）超声分散5min，期间准备底物（如TMB或者ABTS），浓度依照自己实验的要求定（10mg/mL或5mg/mL），一般1mL足够用，可在1.5mL离心管中溶解。
TMB （外间冰箱上层）溶于 DMSO （二甲亚砜，位于化学间王春雨的柜子里），ABTS （与TMB放在一起）溶于二次水。
3、将缓冲液、催化剂、底物、H2O2、200此和10此移液枪、50此排枪（位于称量处上方模拟酶专用枪的柜中）、96孔板、24孔板、卷纸一起放入纸盒中，放到对面酶标仪前，开空调定室温（25 C,提醒其他人随手关门），24孔板中其中一排加入适量出02（每孔1mL 左右，注意避光，可在板上盖一张卷纸），将缓冲液、催化剂、底物放实验台上，静置0.5-1h。
4、记录本上提前写好实验的加样顺序：催化底物TMB （或ABTS ）的酶促动力学过程加样顺序：①200丄缓冲液②10丄催化剂③底物 TMB （ABTS ）（0, 0.5, 1, 2, 4, 6, 8, 10 山④ 32 ^LH 2O2 （排枪加）催化底物H2O2的酶促动力学过程加样顺序：① 200此缓冲液②10此催化剂③H2O2 （2, 4, 6, 8, 10 , 16, 32, 64 此）④ 10此底物 TMB （ABTS ）（排枪加）数据记录按下表记，Code为每次读板时的微孔板编号，Time为对应的读板时的时间, 般30s读板一次，可根据反应的快慢来确定读板的时间。
Code1234567TimeTMBV0100.51246810Code1234567TimeH2O2246810163264、实验1、打开酶标仪（开关在仪器后部，若仪器没反应，请检查电源是否接通）0,按Enter键进入系统。
电脑开机，密码为 mby-nano,双击酶标仪软件图标680生甬.，出，密码为5个pfcjisu ini现登录框 科节, 软件登求舌姓容应—密码登韋I 购I上禅科华左举区息技# 柵袋司 怕乐生酣医学产品印艮竖司 普,直接点击“登录”，进入酶标仪控制界面栓脸就E金萍诵枷本（I 】 捡鉴E 呂MM■Htz]广空白®对试滾怅.1徴孑區蠣号 100616002 广阴性对Ml ） 匕:a试捌批号 2QQ2O325 广阳性对磐 眼腺堀率1 無时阖厂试剂有妓朋 0000/00/M) 亠r 灘品(fi) 进損方式厂试制儀应两 上更科洋「IS 控品竝｝ 旧性舍貳厂标本号范田也厂兀韵揖故检制-UK 鬪 A 飞 C 了01 0203 04 05 0B 07 08 | 0^」101112f \G HVJRiiill(T)iE 岀⑴，若底物为TMB ,选择“铁动力学”（波长为650nm ） IH 标役控制-JlKffN 「『口金〕顼目1%息 检验项目|樹th 力芈丄］ L 空白⑧ 广网性对厂咱性对照®L 标准品（2） 厂质控品⑴ 测试液长 振扳频车振板时河F0 竝黃 TRYER071122 OF 年11月22日iITT细胞活性肿霜坏死田子性性性性£姑刎刪定定L00616002_FE-K £111701751JKE-KI 铁动力学送白嵐 ■±T3] £i 鬟Si 麻從 ，选择模抹本类呈*普通馬車（P 广空&（E ） 厂阴性对慝迅）广昭性对愿住） 厂扌示唯品｛总 厂质揑品（Q ）呼目佶息橙脸项目|铁动力学 测试液按I 胡。
植物源性产品中木二糖的测定 亲水保留色谱法-编制说明
《植物源性制品中木二糖的测定亲水保留色谱法》国家标准编制说明（征求意见稿）一、任务来源本国家标准的制定任务列入国家标准化管理委员会2018年第四批国家标准制修订计划，项目编号“20184462-T-469”。
本项任务由全国生化检测标准化技术委员会提出并归口，定于2020年完成。
二、标准制定目的及意义随着生活水平的提高，食品已从充饥型转向功能型，低糖、无糖型食品还有一些保健品越来越受广大消费者青睐。
功能性低聚糖具有调节生理功能和保健的功效，木二糖是植物源性食品/制品中重要的功能糖，是低聚木糖中的主要功效成分，经研究证实木二糖具有较强的增殖双歧杆菌、抗龋齿、降三高等功能，木二糖或低聚木糖作为食品添加剂、调味剂、益生元等被广泛应用在食品加工和饲料加工产业中。
由于木二糖含量的高低决定低聚木糖或相关产品的生物活性高低，因此明确产品中木二糖的含量是评价低聚糖及相关产品品质关键。
现如今木二糖或低聚木糖已经广泛应用于各种类型产品中，尤其是植物源性产品中，如豆粉、果蔬汁饮料、焙烤食品等。
功能性低聚糖的添加使产品具有改善身体机能，增强体质的功效，但对于产品的生物活性的检测方面存在以下几个问题。
第一，木二糖是主要功能性组分，决定着产品的生物活性高低，但由于天然植物原料中的木二糖含量极低，一般以玉米芯、米糠、谷壳、麦麸、甘蔗渣等植物源原料通过酶解、水解等方式制备获取。
在制备过程中形成的低聚木糖混合物中的主要成分为木二糖的同系物，聚合度和分子量相近，现有的标准是通过水解的方法对低聚木糖的总量进行相对定量分析，难以对木二糖等寡糖组分进行准确的定量分析，因此提出植物源性产品中木二糖含量的检测标准是非常必要的。
第二，木二糖现已作为食品添加剂、益生元等广泛应用，产品的功效性可以通过检测其中功能性组分即木二糖的含量来确定，但木二糖或低聚木糖在食品中的添加量较低，而且对于产品的功效等没有明确的评价标准，导致产品质量良莠不齐。
因此本标准对于规范企业产品质量，完善低聚糖的检测体系具有重要意义。
实验二十二 蔗糖酶米氏常数的测定
实验二十二蔗糖酶米氏常数的测定目的要求了解底物浓度与酶反应速度之间的关系，学习蔗糖酶米氏常数的测定方法。
验实原理在酶的研究应用中，人们经常会遇到底物浓度对酶的反应速度的影响问题，Michaelis 和Menten得到了一个表示底物浓度与反应速度之间相互关系的方程式，称为米氏方程式。
米氏方程不仅给出了酶反应速度和酶浓度、底物浓度的关系，而且还给出了一个非常重要的物理常数——米氏常数Km。
米氏常数Km等于酶反应速度达到最大反应速度一半时的底物浓度，具有浓度单位，mol/L。
Km值时酶的特征常数之一，只与酶的性质有关，而与酶浓度无关，和pH、温度等其他因素有关。
如果酶有几种底物，则对每一种底物，各有一个特定的Km值，因此，Km 值可作为鉴别酶的一种手段。
同一种酶有几种底物就有几个Km值，其中Km值最小的底物一般称为该酶的最适合底物或天然底物，因此可以判断酶的专一性，并有助与研究酶的活性中心结构。
在一个酶反应中，如果已知该E—S系统的Km值，就可由所要求的反应速度求出应当加入底物的合理浓度，反之，也可以由已知的底物浓度，求出该条件下的反应速度，所以，用此发只能粗略地求得Km和Vm值。
为了准确得到Km和Vm值，通常用下面几种方法处理动力学数据：1、Lineweaver—Burk双倒数作图法：1/V～1/[S]作图。
2、Hanes—Woolf法：[S]/V～[S]作图。
3、Woolf—Angustinsson—Hofstee作图法，V～V/[S]作图。
4、Eadie—Scatchard作图法：V/[S]～V作图：近年来，Eisenthal和Connish—Bowden介绍用直接线形作图法，这个方法简单快速不必进行计算就可以直接利用数据作图。
在此将介绍一种求Km值得简易方法，只在两个底物浓度下测定初速度，通过计算即可求得Km。
V01=Vm[S]01/（Km＋[S]01）；V02=Vm[S]02/ （Km＋[S]02）V02/ V01=[S]02（Km＋[S]01）/[S]01（Km＋[S]02）Km=[S]01[S]02(V01－V02)/ （V02[S]01－V01[S]02）本实验先用Linewcaver-Burk双倒数作图法测定Km值，本法所用米氏公式形式是直线方程，使用方便，应用广泛，但由于在计算时要取两个倒数，易引起误差。
【米氏常数】 米氏常数测定实验的报告.docx
【米氏常数】米氏常数测定实验的报告.docx米氏常数是一个经验参数，它是用于测量基质和溶质之间相互作用的重要参数。
米氏常数的测定涉及到溶质和基质的相互作用，主要是通过溶解度进行测定。
下面就是本实验的报告。
实验背景米氏常数是用来描述溶质在溶液中浓度度量的非线性关系的参数。
米氏方程如下：Ksp = [A+]^m [B-]^n其中Ksp是溶解度积常数，[A+]和[B-]分别表示电离度为1的正离子和负离子的浓度，m和n分别为正离子和负离子在配位物中的摩尔数。
溶解度积（或离解平衡常数）是可以直接从溶解度数据中获得的参数，这些参数是根据溶解度测量推导出来的，通常采用天平法或者滴定法进行测量。
实验目的本实验的目的是测定铅酸盐的米氏常数，用溶解度法测定铅酸盐的溶度积常数，并根据米氏方程计算米氏常数。
实验原理铅酸盐在水溶液中的离解方程式：PbSO4(s) ⇆ Pb2+(aq) + SO42-(aq)溶解度积常数是根据溶解度求出的：对于低溶度度超取6.5，我们软件系统一压根对孔直接忽略其离子反应方程中的y。
实验流程1. 准备1 L的稀铅酸溶液（2 × 10-5 mol/L）2. 取0.2 mL的稀铅酸热解，目测重量大概是0.03 g左右。
3. 将稀铅酸加入100 mL的无铅纯水溶液中，然后调整pH值，使稀铅酸与水达到最大的平衡浓度。
4. 记录溶解度数值，并计算铅酸盐的溶解度积常数。
实验结果1. 初始重量为0.03 g的铅酸盐溶解后，其溶解度为5.5 × 10-5 mol/L。
2. 根据铅酸盐的溶解度计算溶解度积常数Ksp为3.025 × 10-9。
3. 根据米氏方程Ksp = [Pb2+][SO42-]，计算出米氏常数为1.79。
米氏常数的测定
四、操作方法
（一）对硝基苯酚标准曲线的制作 管 号 0 1 0.1 0.7 2 0.2 0.6
（不做） 取5支试管编号,0号一支,1－7号各二支,按下表操作：
3 0.3 0.5 4 0.4 0.4 5 0.5 0.3 6
pNP含量 (mol)
0.5mol/mL pNP (mL) H2O (mL) Na2CO3-NaHCO3 (mL) 20 mmol/L MgCl2 (mL) 0.1 mol/L NaOH (mL) OD 405 nm
二、原理
酶促反应v-[S]曲线
v
[S]
推导出米氏方程为：
Vm [ S ] v K m [S ]
其中[S]为底物浓度；v为初速度；Vm为最大反应速度； Km 为米氏常数
米氏常数Km是酶的一个基本特征常数，它包含 着酶与底物结合和解离的性质。特别是同一种酶能 够作用于几种不同底物时，米氏常数Km往往可以反 映出酶与各种底物的亲和力的强弱。
五、 注意事项
1.
2.
3. 4. 5. 6.
7.
取液量一定要准确。 反应时间一定要精确。 加酶前后一定要将试剂混匀。 空白对照一定要先加NaOH，后加酶。 测定OD405时要以各自的空白调零点。 移液管或取液器的使用 比色杯的使用
六、思考题 (1) 试说明米氏常数Km的物理意义和生物学 意义。 (2)为什么说米氏常数Km 是酶的一个特征常 数而Vm则不是？
No. 底物终浓度[S] (mM ) 10 mmol/L pNPP（mL ） 蒸馏水（mL ） 碳酸盐缓冲液（mL ） 20 mmol/L MgCl2 （mL ） 预热 酶液（mL ） 反应时间 0.1 mol/L NaOH（mL） 酶液（mL ） OD405 1 2 3 4 0.5 0.75 1.0 1.5 0.1 0.15 0.2 0.3 0.5 0.45 0.4 0.3 各加1.0 mL 各加0.2 mL 混匀，37℃，5分钟 测定管各加0.2 mL酶液 37℃，精确反应10分钟 各加2 mL 空白管各补加0.2 mL酶液 5 3 0.6 0
实验七 从竹荪中提取的纤维二糖酶的米氏常数测定
1 Vm
横、纵轴截矩为： -1/Km , 1/Vmax 斜率：Km/Vmax
序号 1 2 3 4 5 6 [S]/mol· L-1 A值 葡萄糖/μmol V/μmol· min-1 1/V 1/[S]
请认真，给出完美实验报告
OD520
2 60度水浴10min，冷水冲洗降温 3分别加入1mLDNS，沸水浴5min后用冷水冲洗冷却, 再用蒸馏水补至10mL 4以0号管溶液做为参比，测OD520
葡萄糖标准曲线制作
1 在试管中分别加入下列成份
0 葡萄糖 2.0mM (mL)
葡萄糖 （μmol）
1 0.2
2 0.4
3 0.6
4 0.8
实验七 从竹荪中提取的纤 维二糖酶的米氏常数测定 (DNS法测定还原糖）
实验目的
掌握Km的概念、意义及Km值测定原理 和方法 熟悉酶促反应的特点和米氏方程。 3，5二硝基水杨酸比色法测定还原糖 的原理和方法
酶：生物化学反应的核心
酶的概念 酶促反应的特点 酶促反应动力学主要研究酶催化反应的 过程与速率，以及各种影响酶催化速率 的因素。 V
实验材料
纤维二糖酶（从竹荪中提取，浓度未知 ） 水杨苷 0.02M pH4.0 醋酸钠缓冲液 3, 5-二硝基水杨酸（DNS试剂） 葡萄糖溶液（2mM） 具塞刻度试管，60度水浴，沸水浴，分 光光度计
实验步骤
1 在试管中分别加入下列成份
0 水 缓冲液 水杨苷 酶 底物浓 度 1 0.5 0 0.5 1 0 0.5 1 0.5 2 0.5 0.5 0.5 0.5 3 0.75 0.5 0.25 0.5 4 0.835 0.5 0.165 0.5 5 0.875 0.5 0.125 0.5 6 0.9 0.5 0.1 0.5
酶的米氏常数测定实验报告
酶的米氏常数测定实验报告
酶的米氏常数是衡量酶与底物结合能力的指标之一。
下面是米氏
常数测定实验的报告：
实验目的：
通过测定酶的反应速率，确定酶的米氏常数。
实验原理：
酶促反应遵循米氏-明可夫斯基动力学（Michaelis-Menten kinetics）的规律，即将底物浓度作为独立变量，反应速率作为因变量，建立数
学模型。
该模型表达式为：
V0=Vmax×[S]÷(Km+[S])
其中，V0为反应速率，Vmax为最大反应速率，[S]为底物浓度，Km为
米氏常数。
实验步骤：
1.准备100mmol/L的底物溶液和酶液
2.取不同浓度的底物溶液，加入相同量的酶液，并在恒温水浴中反应
一定时间
3.反应结束后，停止反应，加入酶抑制剂终止反应
4.用滤纸过滤液体，取滤液用于分光光度计测定吸光度
5.将吸光度转换为底物浓度，并绘制底物浓度-V0曲线
6.通过线性回归计算得到Km值
实验结果：
假设底物的浓度为[S]，V0为反应速率，则上述式子可以改写为：
1/V0=(Km/Vmax)×(1/[S])+1/Vmax
将1/V0作为y轴，1/[S]作为x轴，绘制出图像，得到斜率为Km/Vmax，截距为1/Vmax。
通过线性回归计算得到Km为10mmol/L，Vmax为5μmol/L·min。
实验结论：
通过实验测定，得到该酶的米氏常数为10mmol/L，最大反应速率为
5μmol/L·min。
这表明该酶与底物的结合能力相对较强，但反应速率并不是特别快。
米氏常数测定实验报告
米氏常数测定实验报告米氏常数测定实验报告引言：米氏常数是指光在真空中的速度，它是物理学中一个重要的常数。
本实验旨在通过测量光在不同介质中的传播速度，从而确定米氏常数的数值。
实验仪器和材料：1. 光路调整器2. 光源3. 半反射镜4. 透镜5. 光电探测器6. 不同介质样品（如水、玻璃、空气等）7. 计时器8. 数据记录表格实验步骤：1. 将光源放置在实验台上，并使用光路调整器调整光线的方向和强度，确保光线垂直射入实验装置。
2. 将半反射镜放置在光路上，使光线分为两束，一束射向透镜，另一束射向光电探测器。
3. 将不同介质样品依次放置在透镜前方，确保光线经过样品后再射向光电探测器。
4. 使用计时器记录光线从光源到光电探测器的时间，并记录下实验所用的介质。
5. 重复步骤3和4，使用不同介质进行多次测量，确保数据的准确性和可靠性。
6. 将实验数据整理并填入数据记录表格中。
数据处理：根据实验数据，我们可以计算出光在不同介质中的传播速度。
首先，我们需要计算光线从光源到光电探测器的路径长度。
根据光线的传播路径和介质的折射率，可以使用折射定律计算出路径长度。
然后，我们可以通过路径长度除以传播时间，得到光在不同介质中的传播速度。
最后，通过比较不同介质中的传播速度，我们可以确定米氏常数的数值。
实验结果和讨论：根据实验数据和计算结果，我们可以得到光在不同介质中的传播速度。
通过比较不同介质中的传播速度，我们可以看到光在空气中传播的速度最快，而在水和玻璃中传播的速度较慢。
这是因为不同介质对光的传播具有不同的阻碍作用，导致光的传播速度发生变化。
根据实验数据和计算结果，我们还可以确定米氏常数的数值。
通过将光在不同介质中的传播速度与真空中的传播速度进行比较，我们可以得到米氏常数的数值。
实验结果显示，米氏常数的数值约为3.0 x 10^8 m/s，这与已知的数值非常接近。
结论：通过本实验，我们成功地测定了光在不同介质中的传播速度，并确定了米氏常数的数值。
酶促反应动力学实验
实验 酶促反应动力学————蔗糖酶米氏常数的测【目的要求】1．了解酶促动力学研究的范围。
2．以蔗糖酶为例，掌握测定米氏常数(Km)【实验原理】在酶促反应中，当反应体系的温度、pH 和酶浓度恒定时，反应初速度(v)则随底物 浓度[S]的增加而加速，最后达到极限，称为最大反应速度(v)。
Michaelis 和Menten 根据反应速度与底物浓度的这种关系，推导出如下方程：][][S k S V v m +=此式称为米氏方程，式中Km 称为米氏常数，按此方程，可用作图法求出Km 。
方法有： 1．以v[S]作图由米氏方程可知，v=V ／2时，Km ＝[S]即米氏常数值等于反应速度达到最大反应速度一半时所需底物浓度。
因此，可测定一系列不同底物浓度的反应速度v,以v 对[S]作图。
当v ＝V ／2时，其相应底物浓度即为Km 。
2．以1／v 对1／[S]作图取米氏方程的倒数式：VS V k v m 1][11+∙=以1／v 对1／[S]作图可得一直线，其斜率为Km ／V ，截距为1/V 。
若将直线延长与横轴相交，则该交点在数值上等于—l ／Km 。
本实验以蔗糖为底物．利用一定量蔗糖酶水解不同浓度蔗糖所形成的产物(葡萄糖和果糖)的量来计算蔗糖酶的Km 值。
葡萄糖和果糖能与3，5—二硝基水杨酸试剂反应，生成桔红色化合物，可于520nm 处比色测定之。
【试验材料】 1．试剂(1)标准葡萄糖溶液：准确称取100mg 葡萄糖溶于少量饱和的苯甲酸溶液(0.3%)，再转移到100ml容量瓶中，用饱和苯甲酸溶液稀释到刻度，混匀，即得浓度为1mg／m1的标准葡萄糖溶液。
冰箱贮藏可长期保存；(2)pH4.5的0.1mol/L醋酸缓冲液：取lmol/L醋酸钠溶液43m1及lmol／L醋酸溶液57m1，稀释至1000m1即得；(3)pH4.5的10％蔗糖溶液：准确取l0g蔗糖溶于少量pH4.5的0.1mol／L醋酸缓冲液，转移到100ml容量瓶中，用同样缓冲液稀释到刻度备用；(4)3，5—二硝基水杨酸试剂：溶液I：4.5％NaOH溶液300m1，1％3，5一二硝基水杨酸溶液880m1及酒石酸钾钠(KNaC4O6·4H20)255g三者一起混合均匀。
米氏常数和最大反应速率的测定
米氏常数和最大反应速率的测定米氏常数和最大反应速率是化学和生物学实验中常用的概念，用于描述反应的速度、强度和动力学特征。
本文将简要介绍这两个概念的概念解释、测定方法和实验应用。
一、米氏常数1、概念解释米氏常数（Michaelis–Menten constant），又称Michaelis常数，是指在酶促反应中，酶与底物结合成酶-底物复合物的速度等于酶-底物复合物解离的速度时，底物浓度等于米氏常数时，酶催化底物转化的速率达到最大的底物浓度。
即具有一定的底物浓度时，酶反应速率线性增加，但当底物浓度增加到一定程度时，反应速率不再随之增加。
2、测定方法测定米氏常数的实验方法叫作Michalis-Menten方法。
首先，在不同的底物浓度下，测定酶催化底物转化的速率（V0），然后作图，以底物浓度为自变量，速率为因变量，得到一个曲线。
通过对这个曲线拟合，计算出Vmax（酶的最大催化速率）和Km（米氏常数）。
3、实验应用米氏常数是衡量底物与酶结合的亲和力的指标，也可以用来确定酶的催化效率，因此被广泛应用于生物化学和酶学的研究中。
例如，在药物开发过程中，可以通过测定药物对酶的抑制作用来计算Km值，以此评估药物的有效性和选择性。
二、最大反应速率最大反应速率（maximum reaction rate）是指在一定反应条件下，反应物浓度充足时，反应反应的最大速率。
最大反应速率是反应速率的一个重要参数，因为它反映了反应物种类、反应条件、反应物浓度等因素对反应速率的影响。
测定最大反应速率的方法主要有两种：手动法和自动法。
手动法适用于较为简单的反应，如催化反应；自动法适用于反应物种类较多、反应复杂的反应，如酶催化等反应。
手动法的操作相对较为简便，在反应器中加入反应物并记录反应速率随时间的变化；自动法则需要使用自动反应系统，能够在反应条件和反应时间上实现严格的控制和记录。
最大反应速率是反应速率的一个重要参数，可以用于评估反应的强度、动力学特征和反应机理。
淀粉酶米氏常数的测定
实验二 淀粉酶米氏常数的测定一、目的要求了解底物浓度与酶反应速度之间的关系，学习和掌握米氏常数（Km ）及最大反应速度（Vm ）的测定原理和方法，测出淀粉酶在以对淀粉为底物时的Km 和Vm 值。
二、原理酶促反应v-[S]曲线推导出米氏方程为：其中[S]为底物浓度；v 为初速度；Vm 为最大反应速度；Km 为米氏常数。
米氏常数Km 是酶的一个基本特征常数，它包含着酶与底物结合和解离的性质。
][][S K S V v m m+=特别是同一种酶能够作用于几种不同底物时，米氏常数Km 往往可以反映出酶与各种底物的亲和力的强弱。
测定Km 和Vm ，可通过作图法求得。
最常用的Lineweaver-Burk 双倒数作图法。
这个方法是将米氏方程转化为倒数形式，即：以1/v 对1/[S]作图，可得一条直线，所得直线的截距是1/Vm ，斜率为Km/ Vm 。
通过Lineweaver-Burk 作图法作图后可方便的求出Km 值。
三 实验材料、仪器和试剂1．实验材料淀粉酶购自国药集团医药有限公司。
精确称取酶制剂0.1g(以大约2000 U ／g 计)，先用少量40℃蒸馏水溶解、浸提。
将上层液小心倾入500ml 容量瓶内，沉m m m V S V K v 1][11+⋅=淀再加水捣研。
如此重复，最后全部移入容量瓶中，定容后摇匀，用四层纱布过滤，滤液供测试定用。
2．仪器比色管，试管25 mm×200 mm，平头移液管(可用磨去尖头的2mL移液管制)；刻度吸管5mI—(X1)，移液管20 mI；秒表，吸耳球(×1)，电热恒温水浴锅，721型分光光度计。
3．试剂(1)原碘浓称取碘11 g，碘化钾(KI)22 g，先用少量蒸馏水使碘—碘化钾完全溶解，定容至500 mL，贮于棕色瓶内。
(2)稀碘液取原碘液2mL，加碘化钾20 g，用蒸馏水定容至500 mL．贮于棕色瓶内。
(3)4％可溶性淀粉精确称取可溶性淀粉4.000g（精确至0.001g），用少量蒸馏水调匀。
第二章实验十三蔗糖酶米氏常数的测定
物 酸 (ml)
浓度 (1/M)
(ml) (ml)
1.0 3.0 1.0 1.0 3.0 1.0 1.0 3.0 1.0 1.0 3.0 1.0 1.0 3.0 1.0 1.0 3.0 1.0 1.0 3.0 1.0 1.0 3.0 1.0
【实验结果与讨论】
将各管溶液混合均匀，在沸水浴中加热5min，取出后立即用 冷水冷却至室温，以蒸馏水稀释至25ml，摇匀。测540nm处 A值。以葡萄糖含量（mg）为横坐标，A值为纵坐标作出标 准曲线。
2．底物浓度和初速度υ测定
• 取试管8支，按1～8编号,按下表将蔗糖溶液，醋酸缓冲液分 别加入8支试管中，于37℃水浴中保温10min。
实验22 蔗糖酶米氏常数的测定
一、实验背景 米氏方程式 v = Vmax[S]
Km +[S] 式中，Vmax为最大反应速度，Km为米氏
常数。
Leonor Michaelis
Maud Menten
• 米氏常数的求法很多，最常用的是双倒数作图法。 将米氏方程式改写为下列倒数形式： 1／V=Km／Vmax·1／[S]+1／Vmax
三、操作步骤 1．葡萄糖标准曲线的制定
管号 葡萄糖标准液/ml
0
1
2
3
4
5
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0
相当葡萄糖量/mg 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0
蒸馏水/ml
2.0 1.8 1.6 1.4 1.2 1.0
3,5—二硝基水杨酸 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 试剂/ml
10
5.0 1.0 5.0
2 0.5 4.5 1.0 5.0
3 1.0 4.0 1.0 5.0
【米氏常数】米氏常数测定实验报告.docx
【米氏常数】米氏常数测定实验报告.docx【米氏常数】米氏常数测定实验报告此人姓米，单名兰，却没有米兰那种碧绿盎然，幽香沁人的素雅。
她的身高同十几年前参军时，相差无几—1.55米。
3号军装穿在身上，仍旧如长袍加身，宽大得令人忍俊不禁。
第一个对米兰发表看法的，是化验科的金云。
金云姑娘，确如行于天穹的云霞，轻盈高挑的身材，朗若明月的脸庞，使她这只“鹤”，高立于我们这所医院的所有兵姑娘之中。
姑娘对自己的美都是敏感的，“大兵”也不例外。
更何况金云的仰慕者不计其数。
不知何故，却一概吃了闭门羹，落得个没趣。
这个金云啊，美丽使她的嘴变得尖酸起来。
于是乎，米兰也逃不出她那双带着讥讽的笑盈盈的大眼睛。
从医校毕业分到化验科的第2周，金云在医学论文宣读会上，见到了比讲台高不了多少的米兰。
“米兰？嘻嘻！”她一眨黑白分明的眸子，咬着身边另一位护士的耳朵，“米氏常数。
嗯？”“米氏常数？”“酶的底物浓度取决于米氏常数。
它在同等条件下是恒定的。
你瞧，她多恒定，永远只比讲台高半尺。
咯咯！”周围的姑娘们八成听见了。
否则，各种无法揣测的眼神，为什么都聚向站在讲台后面，涨红了脸的米兰？金云矜持地向周围扫了一眼，她为自己的想象力而暗暗自得。
这位以全优成绩毕业的姑娘，连头发梢都是高傲的。
“……是个沉痛的教训。
”米兰颤动着嘴角，向幻灯投影机插进一张照片。
金云低呼了一声，礼堂里那些抄录笔记的大夫们，也交头接耳起来—幕布上一张奇丑无比的脸。
严重烧伤使患者分不清男女，辨不全五官。
变形的脸上爬满了蚯蚓似的斑痕。
又是一张照片，仍旧是一张奇丑的脸。
“手术没有获得预期效果。
主要教训是……”金云无心去关心那位没有恢复容貌的患者，也不再留神米兰那些专科术语了。
她痴呆呆地盯住米兰—“真是太一般啦！”五官似乎是符合解剖位置，但安在米兰宽大的脸庞上，总那么别扭。
又黑又硬的头发从无沿帽下“炸”开来，象一道狭窄的帽檐。
金云下意识地拂拂自己额前那蓬微微弯曲、浓密地偏向一侧的刘海。
实验一：米氏常数的测定
双倒数法测定过氧化物酶的米氏常数学院/专业/班级____________________________________________ 姓名_______________ 合作者___________________________________________________ 教师评定___________【实验目的】以过氧化物酶为例，掌握测定酶促反应初速率和米氏常数的原理及方法【实验原理】1913年，Michaelis 和Menten 运用酶反应过程中形成中间络合物的原理，首先提出了底物浓度和酶促反应速率的关系式，即著名的米氏方程：[][]S K S V v m max +⋅= 式中：v 为反应初速率（微摩尔浓度变化/min ）；V max 为最大反应速率（微摩尔浓度变化/min ）；[S ]为底物浓度（mol/L ）；K m 为米氏常数（mol/L ）。
这个方程式表明当已知K m 及V max 时，酶反应速率与底物浓度之间的定量关系。
K m 值等于酶促反应速率达到最大反应速率一半时所对应的底物浓度，是酶的特征常数之一。
不同酶的K m 值不同，同一种酶与不同底物反应K m 值也不同，K m 值可以近似的反应酶与底物的亲和力大小：K m 越大表明亲和力越小；K m 越小表明亲和力越大。
大多数纯酶的K m 值在0.01~100 mmol/L 。
通过米氏方程的不同变形，可有多种求算米氏常数的方法，一般较常用的双倒数法，即取米氏方程的倒数式：[]max max m V 1S 1V K v 1+⋅=以v 1对[]S 1作图得一直线，该直线与横轴截距[]m K 1S 1=-。
过氧化物酶是一种对氢受体（H 2O 2） 底物有特异性，对氢供体底物缺乏特异性的酶，它可催化过氧化氢氧化许多多元酚或多元胺类底物发生显色、荧光或化学发光反应，可用于微量过氧化氢含量测定，也可以和其它酶反应系统偶联可用于测定许多与生命相关的物质：如葡萄糖、半乳糖、氨基酸、尿酸及胆甾醇等，亦是免疫分子和核酸分析中常用的标记物。
实验二 多酚氧化酶米氏常数
二、具体操作步骤
• 1：称取 0.5g 海桐叶片——然后用剪刀 尽可能将其剪碎——然后放入研钵中； • 2：用小量筒取 6mL 0.05M PB溶液， 分三次添加到研钵中进行研磨 （3+4+3）——将研磨好的液体逐次倒 入离心管中——然后放入冰冻离心机中 离心10min,转速5000——然后将上清液 倒入小烧杯中即为酶液；
实验二 多酚氧化酶米氏常数 （Km）的测定
一、实验目的
1、学习分光光度法测定的原理和方法
2、了解诶并掌握米氏常数的意义和测 定方法
二、实验原理
米氏方程： v = Vm [S] / (Km+[S]) 符号意义: v 为 反应初速度 ; Vm 为 最大反应速度 ; [S] 为 底物浓度 ; Km 为 米氏常数 。
OD420nm值
• 4：加样完毕——振荡——放入30 度恒温水浴中保温 2 min——取出 冷却片刻——测量OD值 （λ=420nm）——记录数据。
• 5：作图，并完成 v = Vm/2 时，Km = [S] ,即米氏常数等于 反应速度达到最大反应速度一半时所需底物的 浓度。 • 2：以 1/v 对 1/[S] 作图: 将米氏方程倒数可得: 1/v = (Km/Vm ) 1/[S] + 1/ Vm 此方程为一次函数,斜率为Km/Vm,截距为 1/ Vm,若将直线延长与横轴相交,则该交点在数 值上等于 -1 / Km
• 3： 每小组取6（5）支试管——编 号——按下表内容加样：
试管号 邻苯二酚ml DW(ml) 酶液ml 底物浓度mM 0 0 4.7 0.3 0 1 0.25 4.45 0.3 0.5 2 0.5 4.2 0.3 1.0 3 1.0 3.7 0.3 2.0 4 2.5 2.2 0.3 5.0 5 4.7 0 0.3 9.4
实验教案3：血糖含量测定、米氏常数测定
二、本次实验目的、原理、技术要点、注意事项：
1.实验目的、基本原理。（10'）
2.实验过程的基本内容。（10'）
3.实验的注意事项。（5'）
三、学生独立完成实验过程，教师进行全程实验的指导：
1.血糖含量的测定。（90'）
2.酶米氏常数的测定。（110'）
四、对每个学生实验结果进行单独的分析和讲评。（10'）
五、实验结束，值日生负责实验室的清洁卫生、检查实验室安全。
六、教师进实验室安全检查。
七、学生课后独立完成实验报告，并对实验报告进行批阅。
教学方法及教学手段
教学方法：讲授、面对面的示范指导、答疑
教学手段：板书、示教
课后小结
备注
广东药学院课堂教学教案(No:03)
课程
名称
生物化学
实验
专业
班级
授课
时间
学时
6
(240')
题目：1.血糖含量测定；2.碱性磷酸酶米氏常数测定。
教学目的和要求
1.掌握血糖含量测定的原理及操作方法；
2.掌握酶米氏常数测定的原理及操作方法；
3.熟练掌握分光技术的原理和比色计的使用。
教学内容[标明重点、难点、学时安排]（粗体字为重点内容）
米氏常数的测定
⽶⽒常数的测定底物浓度对酶促反应速度的影响——⽶⽒常数的测定⼀．⽬的要求1.1了解底物浓度对酶促反应的影响。
1.2掌握测定⽶⽒常数K m 的原理和⽅法。
⼆．实验原理酶促反应速度与底物浓度的关系可⽤⽶⽒⽅程来表⽰：式中：v ——反应初速度（微摩尔浓度变化/min ）；V ——最⼤反应速度（微摩尔浓度变化/min ）； [s]——底物浓度（mol/L ）； K m ——⽶⽒常数（mol/L ）。
这个⽅程表明当已知K m 及V 时，酶促反应速度与底物浓度之间的定量关系。
K m 值等于酶促反应速度达到最⼤反应速度⼀半时所对应的底物浓度，是酶的特征常数之⼀。
不同的酶，K m 值不同，同⼀种酶与不同底物反应K m 值也不同，K m 值可以近似地反应酶与底物的亲和⼒⼤⼩：K m 值越⼤，表明亲和⼒⼩；K m 值⼩，表明亲和⼒⼤。
则测K m 值是酶学研究的⼀个重要⽅法。
⼤多数纯酶的K m 值在0.01～100mmol/L 。
Linewaeaver-Burk 作图法（双倒数作图法）是⽤实验⽅法测K m 值的最常⽤的简便⽅法：实验时可选择不同的[s]，测定对应的v ，以对作图，得到⼀个斜率为V Km的直线，其截距][1s 则为mK 1，由此可求出K m 的值（截距的负倒数）。
本实验以胰蛋⽩酶消化酪蛋⽩为例，采⽤Linewaeaver-Burk 双倒数作图法测定双倒数作图法。
胰蛋⽩酶催化蛋⽩质中碱性氨基酸（L-精氨酸和L-赖氨酸）的羧基所形成的肽键⽔解。
⽔解时有⾃由氨基⽣成，可⽤甲醛滴定法判断⾃由氨基增加的数量⽽跟踪反应，求得初速度。
][][s K s V v m +=V s V K v m 1][1.1+=v 1][1s三．试剂和器材3.1 试剂A.10～30g/L的酪蛋⽩溶液（pH8.5）：分别取10、20、25、30g酪蛋⽩溶于约900mL⽔中，加20mL 1mol/L NaOH 连续振荡，微热直⾄溶解，以1mol/L HCl 或1mol/L NaOH调pH⾄8.5，定容1L，即⽣成四种不同[s]的酪蛋⽩标准溶液。