《蛋白质难点聚焦》
实验五 等电聚焦测蛋白质等电点
实验五等电点聚焦测蛋白质等电点Mangogola等电点聚焦（IEF）是在电场中分离蛋白质技术的一个重要进展，其实质就是在稳定的pH梯度中按等电点的不同分离两性大分子的平衡电泳方法。
IEF的关键是得到一定范围内的稳定pH梯度，即找到合适的两性载体。
载体两性电解质是脂肪族多氨基多羧基的同系物和异构物的混合物，其氨基和羧基的比例不同，使pH和pI相异、相近。
经过适当电泳时间后，两性电解质将依等电点递增的次序在支持物中从正极到负极彼此相互衔接，形成一平滑稳定的pH梯度。
蛋白质靠近正极在低于其pI的环境中带正电荷，向负极移动，反之则向相反方向移动，最终停在其pI处。
聚焦在等电点的分子也会不断扩散，一旦偏离等电点分子因pH的改变而重新带上正或负电荷，从而又向pI迁移。
最后测出蛋白质停留位置的pH即为该蛋白质的pH。
一．实验过程1.圆柱体凝胶制备用封口膜将玻管[D4×120mm]的一端封口，将玻管套上橡胶塞放置在支架上，加入凝胶至10cm处（注意摇动玻管，震出底部气泡），轻轻铺上一层双蒸水，放置聚合1h。
凝胶T=%，C=%，共4mL30%Acr，%Bis 1mL10%过硫酸铵双蒸水载体两性电解质样品液（BSA-10mg/mL）样品液（肌红蛋白-5mg/mL）TEMED共作三支管，每管加胶液约2.聚焦电泳在电泳下槽注入%硫酸500mL，将套有橡胶塞的玻璃管插入电泳上槽(注意塞紧所有孔，以防电极液下漏)，加入上槽溶液%乙醇胺约1000mL（注意排除凝胶下表面的气泡，凝胶上下表面都要接触电极液）。
接上电源，正极接酸，负极接碱，恒压160V至电流为0，再继续通电20min。
3.蛋白质染色及等电点测定用注射器向胶管注水取出胶条，测量胶体总长度及肌红蛋白距酸端（碱端）距离。
将其中一胶条放在玻璃板上用刀片切成1cm长的小段，按顺序放入装有2mL10mM的KCl溶液中，浸泡过夜，次日用pH计测每支管中的pH值。
另外两只胶条在三氯乙酸中浸泡，等出现灰色条带时量总长及其距酸端（碱端）距离。
8 聚焦层析
例：当柱中装有阴离子交换聚焦介质PBE 94时，首先用 当柱中装有阴离子交换聚焦介质 时 乙醇胺-HCl（ pH =9.4）的起始缓冲液平衡，直至流出液 （ 的起始缓冲液平衡 平衡， 乙醇胺 的pH相同时，柱内就会自动形成一个连续的pH梯度，然 pH相同时，柱内就会自动形成一个连续的pH梯度， 相同时 pH梯度 后选用洗脱缓冲液洗脱，并将该缓冲液的终止pH最低设 后选用洗脱缓冲液洗脱，并将该缓冲液的终止pH最低设 pH 定为pH6。这样就获得一个pH9~6 pH梯度的色谱聚焦的 定为pH6。这样就获得一个pH9 6的pH梯度的色谱聚焦的 pH6 pH9 洗脱条件
六、样品中多缓冲剂的去除
方法
① 在待分离样品中加入固体 (NH4 )2 SO4 ，使蛋白质沉淀， 使蛋白质沉淀， 再通过离心分离 ② 用Sephadex G-25层析分离 层析分离
③ 将分离的样品通过亲和层析和疏水层析分离
第三节
应 用
一、分离模型蛋白质
根据聚焦层析的原理，可用聚焦层析将 值不同 值不同的蛋白质 根据聚焦层析的原理，可用聚焦层析将pI值不同的蛋白质 组分分离开 梯度为9~6的聚焦层析柱可将鲸和马的肌红蛋白及 如：①用pH梯度为 梯度为 的聚焦层析柱可将鲸和马的肌红蛋白及 碳氧血红蛋白（各2mg）混合样品分离成三个主峰（图8-6） 碳氧血红蛋白（ ）混合样品分离成三个主峰（ ） 梯度为11~8的聚焦层析柱可将细胞色素 和核糖核 的聚焦层析柱可将细胞色素C和核糖核 ②用pH梯度为 梯度为 的聚焦层析柱可将细胞色素 酸酶的混合液分离成四个主峰 聚焦层析的分辨率高，峰宽窄，且随着 梯度间隔缩小分 聚焦层析的分辨率高，峰宽窄，且随着pH梯度间隔缩小分 离效果更佳 梯度为8~5的聚焦层析柱中分 如：碳氧血红蛋白的亚组分在pH梯度为 碳氧血红蛋白的亚组分在 梯度为 的聚焦层析柱中分 离效果不很理想；而在pH梯度为 离效果不很理想；而在 梯度为8~7的聚焦层析柱中可分离开 的聚焦层析柱中可分离开 梯度为
油脂蛋白质考点精析
考点54油脂蛋白质1．复习重点1．油脂的组成和结构、性质；2．肥皂和洗涤剂；蛋白质的组成、性质和用途。
2．难点聚焦一、油脂的结构和分类：分类：R1、R2、R3相同时，为单甘油脂，R1、R2、R3不同时，为混甘油脂，天然油脂多为混甘油脂。
二、油脂的性质1·物理性质：ρ＜ρ水，粘度大，不溶于水，易溶于有机溶剂，是较好的溶剂。
高级脂肪酸中既有饱和的，又有不饱和的，因此，许多油脂兼有烯烃和酯类的一些化学性质，可以发生加成反应和水解反应。
2·化学性质（1）油脂的氢化——油脂的硬化用途：硬化油性质稳定，不易变质，便于运输。
（2）油脂的水解①酸性水解应用：制高级脂肪酸和甘油②碱性水解——皂化反应应用：制肥皂和甘油肥皂是怎样去污的呢？阅读课本P196三、了解肥皂的制取和去污原理以及合成洗涤剂的优缺点。
三、肥皂和洗涤剂1·肥皂的制取2·去污原理亲水基：极性的-COONa或-COO--，可以溶于水，伸在油污外憎水基：非极性的烃基-R，不溶于水，具有亲油性，插入油污内3·合成洗涤剂优点：能在硬水中使用，去污能力强，原料便宜缺点：引起水体污染蛋白质蛋白质是组成细胞的基础物质，生物的一切生命活动都与蛋白质有关，因此，研究蛋白质的组成和性质是相当重要的。
下面我们来做几个实验，看一看蛋白质有哪些性质？【7-6】【7-7】【7-8】一、蛋白质的组成含C、H、O、N、S等元素，能水解最终生成氨基酸（天然蛋白质水解最终生成物全是α-氨基酸），故氨基酸是蛋白质的基石。
二、蛋白质的性质：有的可溶于水，有的难溶。
1·盐析——是可逆过程，用来分离、提纯蛋白质。
2·变性——不可逆，蛋白质失去可溶性和生理活性。
条件：①加热②紫外线、X射线③加酸、加碱、加重金属盐④一些有机物：如乙醇、甲醛、苯甲酸等3·颜色反应：带有苯环的蛋白质遇浓硝酸变黄。
4·灼烧：产生烧焦羽毛的气味。
蛋白质纯化与鉴定
蛋白质纯化与鉴定蛋白质纯化与鉴定是生物化学研究中的重要环节，它们对于解析蛋白质的功能与结构具有至关重要的作用。
本文将介绍蛋白质纯化与鉴定的基本原理和常用方法，帮助读者深入了解和掌握这一领域的知识。
一、蛋白质纯化的基本原理蛋白质纯化的目的是从复杂的混合物中分离出目标蛋白质，使其达到高纯度并可供进一步研究。
纯化的基本原理包括分子大小、电荷、氢键、亲和性等特性的利用。
1. 分子大小分子大小是蛋白质纯化中最常用的原理之一。
常见的技术包括凝胶过滤、超速离心和透析等。
凝胶过滤是利用滤膜的孔径大小将分子按大小分离，大分子会滞留在凝胶中，而小分子则通过滤膜。
超速离心则是通过离心的力将分子按大小分离，大分子相对于小分子会沉降得更快。
透析则是通过膜的选择性渗透，让目标蛋白质在液相中透析。
2. 电荷蛋白质具有酸性和碱性基团，它们在不同pH条件下会带有正电荷或负电荷。
利用这一特性，可以利用离子交换色谱和等电聚焦等技术进行纯化。
在离子交换色谱中，蛋白质在具有相反电荷的交换树脂上吸附，通过改变溶液中的离子浓度和pH值来洗脱目标蛋白质。
等电聚焦则是通过在pH梯度中，蛋白质在等电点向电极方向移动，实现纯化。
3. 氢键氢键是蛋白质中常见的一种相互作用力，利用氢键的特性可以进行水相相互作用色谱的纯化。
该技术通过蛋白质与水相固定相的相互作用，实现蛋白质的纯化。
4. 亲和性亲和性是蛋白质纯化中常用的原理之一，通过将特定配体固定在固定相上，使其与目标蛋白质发生亲和作用，实现纯化。
常见的技术包括亲和层析、亲和电泳、亲和免疫吸附等。
二、常用的蛋白质纯化方法蛋白质纯化的方法多种多样，根据目标蛋白质的特性和纯化目的的不同，选择合适的方法进行纯化。
1. 酸碱沉淀法酸碱沉淀法是最常见的一种蛋白质纯化方法，通过调节溶液的pH 值，使蛋白质发生沉淀。
根据目标蛋白质的溶解性差异，可以采用酸性或碱性条件进行沉淀。
此外，在沉淀过程中还可以利用其他技术如离心和过滤等进一步提高纯度。
生化技术第八章 聚焦层析
pH
pH
6
6
pH
7 pH8
pH
pH
6
6
Байду номын сангаас
pH9
pH8
pH7
pH6
柱中的pH变化：
高→梯度形成→梯度下移→梯度消失（低）
2.蛋白质行为
蛋白质存在于“风云变幻”的层析柱中。
（1）环境pH＜蛋白质pI时，蛋白质带正电荷，不 与阴离子交换剂结合，以很快的速度向前移动；
（2）当在某一距离时，环境pH＞蛋白质pI，蛋白 质带负电荷，并与阴离子交换剂结合；
柱内发生何种变化？
中和作用—多缓冲液中的大部分酸性成分与与阴离子交 换剂的碱性基团结合。 结果：随淋洗过程的进行，柱内每一点的pH都在下降； 一段时间后，柱内自上而下形成了pH6-9的梯度。
pH9
一
起
段
始
时
间
后
pH9
pH6 pH9 pH9
最后，继续淋洗，pH梯度逐渐下移，直至底部流出液 pH由9 降至6 并恒定于此值时，柱中的pH梯度随即消 失。
4. 加样和洗脱 洗脱液浓度和洗脱体积可参考表8-2 ，控制流速在3040cm/h
5.样品中多缓冲剂的去除 固体硫酸铵法使蛋白质沉淀，与多缓冲剂分开； 通过Sephadex G-25柱可把大于5000Da的蛋白质与 多缓冲剂分开； 通过亲和层析和疏水层析把蛋白质与多缓冲剂分开
2. 多缓冲交换剂的选择与处理
根据pH梯度范围确定多缓冲交换剂与起始缓冲液。
起始缓冲液的pH要比pH梯度上限高约0.4个pH 单位，以克服因起始缓冲液与洗脱液之间pH差值引 起的pH波动。
3. 样品的准备 加样量：通常每10ml床体积可以加100mg左右的样品 样品浓度: 由于有聚焦效应，样品浓度可低些
蛋白质透析和分离技术
蛋白质透析和分离技术蛋白质是生命的重要组成部分，其在细胞功能、代谢、信号传导等方面都具有重要作用。
因此，研究蛋白质的结构、功能、互作关系等问题是现代生命科学的热门领域。
然而，由于蛋白质具有高度复杂的分子结构和多样性，要想从混合物中分离纯化出纯的目标蛋白质是十分困难的。
为此，科学家们就发明了一些透析和分离技术，以便更好地研究蛋白质。
蛋白质透析技术是一种以蛋白质的分子大小和性质作为筛选目标的方法。
通常使用离子交换层析、凝胶过滤层析、亲和层析等技术进行透析。
其中离子交换层析是最常用的方法，主要是通过正离子或负离子的吸附作用吸附目标蛋白质，然后通过改变溶液的离子浓度或pH值以实现蛋白质分离。
凝胶过滤层析则是将混合物通过一个孔径超过蛋白质的凝胶柱，使大分子的混合物无法通过，实现分离。
亲和层析则是利用配体-受体的相互作用即蛋白质与 A相互作用，来特异性地分离目标蛋白。
蛋白质分离技术是一种将混合物中的各种成分一步步分离的技术。
常见的方法包括电泳分离、等电聚焦、二维凝胶电泳等。
其中，二维凝胶电泳是最常用的方法。
它利用凝胶电泳的分子大小筛选性和电荷不同的特性，通过两个维度的分离，实现蛋白质的高效分离。
第一维通常是以等电点为基础的等电聚焦，即利用电性来将具有不同等电点的蛋白质分离；第二维则是SDS-PAGE，即利用不同的分子量将蛋白质进一步分离。
这种方法不仅可以将蛋白质从混合物中分离出来，还能够确定其分子量和等电点，方便后续的其他实验研究工作。
总的来说，蛋白质透析和分离技术是生命科学中不可或缺的研究方法。
虽然这些技术在过去几十年中已经经历了巨大的发展，但现代的科学家们还需要不断地进行改进和完善，以更好地服务于研究蛋白质的目的，探索人类身体内各种蛋白质的结构、功能和互作关系，为保障人类的健康和生命做出贡献。
实验三等电聚焦电泳法测定蛋白质的等电点
实验三等电聚焦电泳法测定蛋白质的等电点一、实验目的了解等电聚焦的原理。
通过蛋白质等电点的测定，掌握聚丙烯酰胺凝胶垂直管式等电聚焦电泳技术。
二、实验原理等电聚焦（Isoelectric focusing，简称IEF）是六十年代中期出现的新技术。
近年来等电聚焦技术有了新的进展，已迅速发展成为一门成熟的近代生化实验技术。
目前等电聚焦技术已可以分辨等电点（pI）只差0.001pH单位的生物分子。
由于其分辨力高，重复性好，样品容量大，操作简便迅速，在生物化学、分子生物学及临床医学研究中得到广泛的应用。
蛋白质分子是典型的两性电解质分子。
它在大于其等电点的pH环境中解离成带负电荷的阴离子，向电场的正极泳动，在小于其等电点的pH环境中解离成带正由荷的阳离子，向电场的负极泳动。
这种泳动只有在等于其等电点的pH环境中，即蛋白质所带的净电荷为零时才能停止。
如果在一个有pH梯度的环境中，对各种不同等电点的蛋白质混合样品进行电泳，则在电场作用下，不管这些蛋白质分子的原始分布如何，各种蛋白质分子将按照它们各自的等电点大小在pH梯度中相对应的位置处进行聚焦，经过一定时间的电泳以后，不同等电点的蛋白质分子便分别聚焦于不同的位置。
这种按等电点的大小，生物分子在pH梯度的某一相应位置上进行聚焦的行为就称为“等电聚焦”。
等电聚焦的特点就在于它利用了一种称为两性电解质载体的物质在电场中构成连续的pH梯度，使蛋白质或其他具有两性电解质性质的样品进行聚焦，从而达到分离、测定和鉴定的目的。
两性电解质载体，实际上是许多异构和同系物的混合物，它们是一系列多羧基多氨基脂肪族化合物，分子量在300~1000之间。
常用的进口两性电解质为瑞典Pharmacia-LKB公司生产的Ampholine 和Pharmalyte，价格昂贵。
国产的有中国军事医学科学院放射医学研究所和上海生化所生产的两性电解质，价格便宜，质量尚佳。
两性电解质在直流电场的作用下，能形成一个从正极到负极的pH值逐渐升高的平滑连续的pH梯度。
蛋白质分离技术(全)
聚合物沉淀法
03
利用聚合物如聚乙二醇、聚丙三醇等与蛋白质结合形成沉淀。
离心分离法
高速离心
利用高速旋转产生的离心力使溶液中 的悬浮颗粒沉降，从而实现分离。
超速离心
利用超速离心机的高速旋转产生的强 大离心力，使亚细胞器和蛋白质等组
分分离。
密度梯度离心
在离心管中加入密度梯度介质，使不 同密度的组分在离心过程中形成不同
高效回收
在蛋白质分离过程中，保持蛋白质的活性和稳定性，实现高效回收也 是一大挑战。
蛋白质分离技术的展望
新型分离介质
开发新型的分离介质是蛋白质分离技术的重要发展方向，有望提高分离效率和特异性。
集成化与自动化
实现蛋白质分离技术的集成化和自动化，能够提高分离效率和降低成本，是未来的发展 趋势。
蛋白质组学技术
03
环境影响评价的应 用
蛋白质分离技术用于环境影响评 价，如对工业废水、废气排放的 监测等。
05
蛋白质分离技术的挑战 与展望
蛋白质分离技术的挑战
高分辨率分离
蛋白质具有复杂的结构和性质，实现高分辨率分离是蛋白质分离技 术的关键挑战之一。
特异性分离
由于蛋白质的多样性和相似性，实现特异性分离是另一个挑战，需 要开发更高效的分离方法。
蛋白质分离技术的历史与发展
01
蛋白质分离技术的发展可以追溯到19世纪末期，当时科学家开始使用沉淀法和 过滤法来分离蛋白质。
02
20世纪中期，随着电泳技术的出现，蛋白质分离技术得到了极大的发展。电泳 技术可以按照蛋白质的电荷和分子量大小进行分离，具有高分辨率和高灵敏度 等优点。
03
近年来，随着蛋白质组学研究的深入，蛋白质分离技术也在不断发展。新型的 蛋白质分离技术如色谱技术、质谱技术、纳米技术等不断涌现，为蛋白质分离 提供了更多的选择和手段。
高三化学教案 蛋 白 质9篇
高三化学教案蛋白质9篇蛋白质 1第2节生命活动的主要承担者──蛋白质一、教学目标1.说明氨基酸的结构特点，以及氨基酸形成蛋白质的过程。
2.概述蛋白质的结构和功能。
3.认同蛋白质是生命活动的主要承担者。
4.关注蛋白质研究的新进展。
二、教学重点和难点1.教学重点（1）氨基酸的结构特点，以及氨基酸形成蛋白质的过程。
（2）蛋白质的结构和功能。
2.教学难点（1）氨基酸形成蛋白质的过程。
（2）蛋白质的结构多样性的原因。
三、课时安排2四、教学过程〖引入〗以“问题探讨”引入，生思考师提示。
〖提示〗1.提示：富含蛋白质的食品有大豆制品，如豆浆、豆腐、腐竹；奶类制品，如奶粉、酸奶、袋装奶；还有肉、蛋类食品，如烤肉、肉肠、鸡蛋，等等。
2.提示：有些蛋白质是构成细胞和生物体的结构成分，如结构蛋白；有些蛋白质能够调节生命活动，如胰岛素；有些蛋白质有催化作用，如绝大多数酶都是蛋白质；有些蛋白质具有运输载体的功能，如红细胞中的血红蛋白；有些蛋白质有免疫功能，如人体内的抗体。
3.提示：因为氨基酸是构成蛋白质的基本单位，在人体内约有20种氨基酸，其中有8种是人体需要而不能自己合成的，必须从外界环境获得，如赖氨酸、苯丙氨酸等，它们被称为必需氨基酸。
所以有些食品中要添加赖氨酸或苯丙氨酸等人体必需的氨基酸。
〖问题〗以“本节聚焦”再次引起学生的思考。
〖板书〗一、氨基酸及其种类氨基酸是组成蛋白质的基本单位。
〖思考与讨论〗生思考回答，师提示。
〖提示及板书〗1.每个氨基酸都有氨基和羧基，并且都有一个氨基和一个羧基连接在同一个碳原子上。
2.“氨基酸”代表了氨基酸分子结构中主要的部分──氨基和羧基。
〖讲述〗先讲功能再讲结构。
〖板书〗二、蛋白质的功能1.蛋白质一个重要的生物学功能是作为生物体的结构成分。
（例如，细胞中的细胞膜、线粒体、叶绿体和内质网等都是由不溶性蛋白质与脂质组成的。
人和动物的肌肉等组织的主要成分也是蛋白质，如横纹肌中的球状蛋白，平滑肌中的胶原蛋白，毛、甲、角、壳、蹄中的角蛋白等。
蛋白质聚焦层析
聚焦效应
• 蛋白质按其等电点在pH梯度环境中进行排列 的过程叫做聚焦效应
• pH梯度的形成是聚焦效应的先决条件 • 如果一种蛋白质是加到已形成pH梯度的层析
柱上时，由于洗脱液的连续流动，它将迅速 地迁移到与它等电点相同的pH处 • 从此位置开始，其蛋白质将以缓慢的速度进 行吸附、解吸附，直到在等电点pH时被洗出
脱剂向前移动，固定相中的pH值是随着淋洗 时间延长而变化的 • 当蛋白质移动至环境pH高于其pI时，蛋白质
由带正电荷变为带负电荷，并与阴离子交
换剂结合
蛋白质的行为
• 由于洗脱剂的通过，蛋白质周围的环境pH 再次低于pI时，它又带正电荷，并从交换剂 解吸下来
• 随着洗脱液向柱底的迁移，上述过程将反复 进行，于是各种蛋白质就在各自的等电点被 洗下来，从而达到了分离的目的
• 具有生物活性部分的蛋白质,通过SDS-PAGE测定其 分子量
洗脱曲线
β-乳球蛋白A型和B型的分离
• 美国一所大学应用阳离子型聚焦层析 分离A型和B型β-乳球蛋白
• A型和B型分子量都是36000，等电点 仅差
• A型等电点为型为
β-乳球蛋白A型和B型的分离
• PolyCAT A柱，上样量为的β-乳球蛋 白
1
2 3
人血清载脂蛋白CⅢ亚型的分离
• 华西医科大学基础医学院方定志等利用此方 法分离了人血清载脂蛋白CⅢ亚型
• 他们用密度梯度超速离心法,从混合人血清中 分离极低密度脂蛋白，经脱脂后再进行聚焦 层析分离其中的载脂蛋白。获得的纯品载脂 蛋白CⅢ1和CⅢ2经等电聚焦电泳均呈现一 条带
蛋白质自动聚焦原理
蛋白质自动聚焦原理今天来聊聊蛋白质自动聚焦原理。
你知道吗？在我们的生活中有很多类似自动聚焦的现象。
就像我们拍照的时候，相机能自动把画面中的主体对焦清晰，这好像看起来很聪明的操作其实背后有一定的原理，和蛋白质自动聚焦原理还有点相似之处呢。
蛋白质自动聚焦啊，其实说的是等电聚焦，这是一种根据蛋白质等电点的不同来分离蛋白质的电泳方法。
那什么是蛋白质的等电点呢？简单来说，蛋白质是由氨基酸组成的，氨基酸既有酸性基团，又有碱性基团。
在溶液里，蛋白质会带电，而等电点就是这个蛋白质分子所带正负电荷相等的时候的pH值。
打个比方吧，假如把蛋白质想象成一群性格不一的小团子。
每个小团子都有自己独特的“平衡时刻”，这个时刻就像它的等电点。
在溶液环境这个大舞台上，当周围的pH值刚好是这个等电点的时候，这个小团子就处于一种特别的状态，既不被正极吸引，也不被负极吸引。
有意思的是，等电聚焦就是基于这个原理来工作的。
我们在凝胶里面设置一个pH梯度，这个就像给小团子们设下的一个个小关卡。
当我们把混合的蛋白质放在这个有pH梯度的凝胶里通电的时候，这些蛋白质就会开始移动。
不同等电点的蛋白质就会在凝胶中分别向它们各自对应的等电点pH位置聚焦，好像各自找到了最舒服的位置站定不动了。
这就要说到它的实际应用案例了。
在生物研究里，如果我们想要知道一种未知蛋白质的等电点，我们就可以用等电聚焦的方法把它从混合的蛋白质里面分离出来，然后去测定。
还有在检测某些疾病相关蛋白质的时候，这个方法也很有用。
比如说某些遗传病可能会导致特定蛋白质的等电点发生变化，那我们就可以通过等电聚焦后检测蛋白质位置是否异常来初步判断了。
老实说，我一开始也不明白为什么蛋白质会这么听话地跑到自己的等电点位置。
后来学习了更多之后才知道是因为在电场中蛋白质的带电情况在不同pH环境下发生改变。
不过在这个过程中我还是会有一些困惑，比如一些蛋白质可能会受到周围其他蛋白或者杂质的影响，它的聚焦是不是就不会那么准确呢？这可能就涉及到我们在做这个实验或者运用这个技术的时候需要注意的地方，在操作过程一定要尽可能保持样本的纯净度，减少杂质干扰。
等电点聚焦测蛋白质等电点
实验四等电点聚焦测蛋白质等电点宫魁六组200928006841083一、实验原理：等电点聚焦（IEF）是在电场中分离蛋白质技术的一个重要发展，IEF实质就是在稳定的pH梯度中按等电点的不同分离两性大分子的平衡电泳方法。
在电场中充有两性载体和抗对流介质，当加上电场后，由于两性载体移动的结果，在两极之间逐步建立起稳定的pH梯度，当蛋白质分子或其它两性分子存在于这样的pH梯度中时，这种分子便会由于其表面电荷在此电场中运动，并最终到达一个使其表面静电荷为0的区带，这时的pH则是这种分子的pI。
聚焦在等电点的分子也会不断地扩散。
一旦偏离其等电点后，由于pH环境的改变，分子又立即得到正电荷或负电荷，从而又向pI迁移。
因此，这些分子总是处于不断地扩散和抗扩散的平衡之中，在pI处得以“聚焦”。
二、实验仪器和用具：玻璃管（4支）、封口膜、试管架、细长滴管、注射器和长针头、培养皿、刀片、烧杯、微量移液器、圆盘电泳槽及电泳仪三、试剂：0.1M磷酸（500ml）、0.1M氢氧化钠（1000ml）、丙烯酰胺储液、两性载体电解质、TEMED、牛血清蛋白样品（0.5mg/ml）、过硫酸铵（10%）、三氯乙酸（10%）等四、实验步骤：1、先将玻管洗净，用封口膜封的一端垂直放在架上；2、配胶：丙烯酰胺储液0、67ml两性载体电解质0、2mlTEMED 0、004ml牛血清蛋白质样品0、04ml蒸馏水 2.9ml过硫酸铵0.02ml3、用细长滴管加入溶液至10cm高处，胶面上加3—3cm高水层，进行封闭，聚合10—50min，吸出上层水，用滤纸稍微吸取；4、在电泳槽上槽加800ml磷酸，下槽500ml氢氧化钠；5、将管接入电泳槽，要求上端浸入液面，下端不接触下槽底面，注意排除凝胶下表面的气泡；6、接上电源，正极接酸，负极接碱；恒定160v，4h左右，电泳至电流为“0”；7、取胶将聚胶后的含蛋白质样品的凝胶借助注射器针头注水取出；8、量取三条胶的长度；9、pH梯度的测定取KCl溶液分别加入2ml于10只小管中，将欲测pH 梯度的胶条置于玻片上，用刀片切成1cm长的小段，按顺序放入有标号的小管中，盖好盖子，室温下过夜；10、次日用pH计测每只小瓶中浸泡液的pH值。
快速检测蛋白质原理的方法
快速检测蛋白质原理的方法
快速检测蛋白质的原理方法主要有以下几种：
1. 光谱法：利用蛋白质在紫外光或可见光区域吸收、散射或荧光发射的特性来检测。
常用的方法有紫外吸收光谱、荧光光谱和圆二色谱等。
2. 免疫检测法：利用特异性抗体与蛋白质的结合来实现快速检测。
常用的方法有酶联免疫吸附试验（ELISA）、免疫层析法和免疫荧光法等。
3. 质谱法：利用质谱仪分析样品中蛋白质的质量和结构信息。
常用的方法有质谱图谱法、质谱成像法和蛋白质组学等。
4. 聚焦电泳法：利用电场将蛋白质从复杂混合物中分离出来，再利用染色或质谱等方法进行检测。
常用的方法有SDS-PAGE（饱和盐溶液-聚丙烯酰胺凝胶电泳法）和2D-PAGE（二维凝胶电泳法）等。
这些方法可以单独使用，也可以结合使用，以提高蛋白质的检测速度、准确度和灵敏度。
第四节 蛋白质是生命活动的主要承担者
R1 肽键 H2O
分子H2O， 个肽键。
R2 脱去的H2O中的氢来自 氨基和羧基，氧自 羧基 。
1.氨基酸的结合方式： 脱水缩合
HOH HO
H
NH2 C C N C C OH H N
二肽
肽键 R1
R2 肽键
H2O
H2O
H C COOH
R3 三肽
三肽 脱以此去类2推，分由子多H个2O氨，基酸形分成子缩2合个而肽成键的含。有多个肽键的化 m肽脱合物去，m叫-1多分肽子。H多2肽O通，常形呈成链状m结-1构个，叫肽作键肽。链。
从某些动物的组织中提取的胶原蛋白，可以用来制 作手术缝合线。手术一段时间后，这种缝合线就可 以被人体组织吸收，从而避免拆线的痛苦。
讨论： 1.为什么这种缝合线可以被人体组织吸收？
组成动物和人体的胶原蛋白是相似的物质。 2.这种缝合线发生什么样的化学变化才能被吸收？ 这种手术缝合线要变为小分子物质（氨基酸）才能 被吸收。
因为胰岛素是一种蛋白质，口服会在消化道里以蛋 白质的形式被消化成氨基酸，而失去胰岛素的功能。
组成元素
组成
氨基酸
脱 水 缩 合
多肽
折 叠 盘 旋
蛋白质
C、H、O、N（S）
必需氨基酸：8种 种类：21种 非必需氨基酸：13种
课堂小结
RO 通式： H2N C C OH
H 特点：至少有一个－NH2和一个－COOH连在同一个C原子上
H2N CH COOH
√ CH2
OH
× H
NH2 C H
× CH3
H2N C NH2
CH2 COOH
H
组成蛋白质的氨基酸的判断标准
• 数量标准：至少含有一个氨基（-NH2）和 一个羧基（-COOH）
蛋白质等电点分析之方法学验证
蛋白质等电点分析之方法学验证蛋白质的等电点与其氨基酸序列和三维结构密切相关。
每种特定蛋白质都有其固定的等电点。
因此，通过比较不同蛋白质的等电点，我们可以研究它们之间的结构和功能差异。
精确测定蛋白质的等电点在对生物制品电荷异质性的表征中扮演着重要的角色。
毛细管等电聚焦（capillary isoelectric focusing, cIEF）是生物制品等电点分析中最常用的方法。
该微分离技术利用毛细管两端施加直流电压，使得载体两性电解质在毛细管内形成一定范围的pH梯度。
根据其所带电荷，蛋白质会在梯度中向阳极或阴极移动，直到净电荷为零的特定pH值（即等电点pI）停止。
这样，蛋白质可以聚焦在极窄的区段上，从而实现高效分离，并获取有关蛋白质等电点的信息。
基于cIEF的蛋白等电点检测具有诸多优势，包括短时间分析、高分辨率、良好的重复性、高精确度和样本用量少等。
因此，它已成为多种生物制品研发与质量控制中至关重要的技术，包括氨基酸、多肽、重组蛋白、抗体和疫苗等生物制品的表征分析。
该方法不仅能够快速准确地确定蛋白质的等电点，还为生物制品的质量控制提供了关键的信息和依据。
北京百泰派克生物科技有限公司BTP参照《中华人民共和国药典》2020年版三部通则0542/四部通则0542毛细管电泳法，对基于cIEF的蛋白等电点检测能力进行了验证，公司通过CNAS实验室认可。
BTP能够提供基于cIEF的蛋白等电点检测服务，并提供包括方法学建立、验证以及后续样品检测的全面解决方案。
• 方法参考：《中华人民共和国药典》2020年版三部通则0542/四部通则0542毛细管电泳法。
• 设备配置：BECKMAN COULTER PA800+毛细管电泳仪。
• 试剂配置：磷酸、冰醋酸、氢氧化钠、精氨酸、尿素、亚氨基二乙酸、Pharmalyte 3-10 for IEF、CIEF Gel等。
• 验证参数（示例）：1 专属性。
取相同量的空白对照品与标准品，用测定结果进行评价。
实验五 等电聚焦测蛋白质等电点
实验五等电点聚焦测蛋白质等电点Mangogola等电点聚焦（IEF）是在电场中分离蛋白质技术的一个重要进展，其实质就是在稳定的pH梯度中按等电点的不同分离两性大分子的平衡电泳方法。
IEF的关键是得到一定范围内的稳定pH梯度，即找到合适的两性载体。
载体两性电解质是脂肪族多氨基多羧基的同系物和异构物的混合物，其氨基和羧基的比例不同，使pH和pI相异、相近。
经过适当电泳时间后，两性电解质将依等电点递增的次序在支持物中从正极到负极彼此相互衔接，形成一平滑稳定的pH梯度。
蛋白质靠近正极在低于其pI的环境中带正电荷,向负极移动，反之则向相反方向移动，最终停在其pI处。
聚焦在等电点的分子也会不断扩散，一旦偏离等电点分子因pH的改变而重新带上正或负电荷,从而又向pI迁移.最后测出蛋白质停留位置的pH即为该蛋白质的pH。
一．实验过程1。
圆柱体凝胶制备用封口膜将玻管[D4×120mm］的一端封口，将玻管套上橡胶塞放置在支架上，加入凝胶至10cm处（注意摇动玻管，震出底部气泡），轻轻铺上一层双蒸水，放置聚合1h.凝胶T=7。
5％，C=2。
7%，共4mL30％Acr，0.8％Bis 1mL10%过硫酸铵0.02mL双蒸水 2.68mL载体两性电解质0.15mL样品液（BSA—10mg/mL）0.05mL样品液（肌红蛋白—5mg/mL）0.05mLTEMED 0。
02mL共作三支管，每管加胶液约1。
1mL2.聚焦电泳在电泳下槽注入0.2%硫酸500mL,将套有橡胶塞的玻璃管插入电泳上槽(注意塞紧所有孔,以防电极液下漏)，加入上槽溶液0.5%乙醇胺约1000mL（注意排除凝胶下表面的气泡,凝胶上下表面都要接触电极液).接上电源，正极接酸，负极接碱，恒压160V至电流为0，再继续通电20min.3。
蛋白质染色及等电点测定用注射器向胶管注水取出胶条，测量胶体总长度及肌红蛋白距酸端（碱端）距离。
将其中一胶条放在玻璃板上用刀片切成1cm长的小段,按顺序放入装有2mL10mM的KCl溶液中，浸泡过夜,次日用pH计测每支管中的pH值。
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《蛋白质难点聚焦》
张建尚 江苏省赣榆高级中学
1.氨基酸结构通式
特别提醒：
①组成蛋白质分子的氨基酸都至少含有一个氨基（一NH 2）和一个羧基（—COOH ），但并非只有一个—NH 2和一个—COOH ，在R 基团中可以含有数量不同的—NH 2或—COOH ；
②氨基酸不论含有多少个－NH 2和—COOH ，都有一个－NH 2和一个—COOH 连在同一个碳原子上，这是判断是否是组成蛋白质分子的氨基酸的依据；
③氨基、羧基写成NH 2、COOH 是错误的；
④组成蛋白质的氨基酸约有20种，但自然界中的氨基酸不止20种。
【例1】已知苯丙氨酸的分子式是C 9H 11NO 2，那么该氨基酸的R 基是( )
A.—C 7H 7O
B.—C 7H 7
C.—C 7H 7N
D.—C 7H 5NO
【解析】该题考查生命观念和科学思维。
根据氨基酸的结构通式可知，氨基酸共有的结构包括C 2H 4NO 2，则R 基是C 7H 7。
【答案】B
2.蛋白质的结构
（1）氨基酸、多肽、肽链、肽键和蛋白质的关系
（2）氨基酸脱水缩合形成多肽时肽键数、失去水分子数及多肽的相对分子质量和氨基（或羧基）的计算(仅指直链多肽)： 氨基酸平均相对分子质量 氨基酸 数目 肽键数目 脱去水分子数 肽类相对 分子质量 氨基或 羧基数目
一条肽链ａm m—1 m—1 ma—18（m—1）至少一个
n条肽链ａm m—n m—n ma—18（m—n）至少n个
特别提醒：
①两个氨基酸脱水缩合形成二肽时失去的水分子中，氧原子来自羧基，氢原子一个来自羧基，一个来自氨基。
②如果n个氨基酸形成若干个环状多肽，则蛋白质分子形成过程中肽键数目等于氨基酸数目，可表示为：失去水分子数=肽键数=氨基酸总数。
③脱水缩合后形成的肽键是-NH-CO-，不能写成NH-CO。
④全部直链多肽分子的游离的氨基（或羧基）数目=直链多肽分子的数目+组成多肽的各氨基酸的侧链R基上所含有的氨基（或羧基）的数目。
⑤多肽与蛋白质的最重要的区别是多肽无空间结构。
【例2】肉毒梭菌(厌氧性梭状芽孢杆菌)是致死性最高的病原体之一，它是由两个亚单位(每个亚单位为一条链盘曲折叠而成)组成的一种生物大分子，1 mg可毒死20亿只小鼠。
煮沸1 min或75℃下加热5～10 min，就能使其完全丧失活性。
下面是肉毒类毒素的局部结构简式：
请据此回答：
(1)肉毒类毒素的化学本质是。
(2)由上图可知，该片段由种氨基酸组成，有个肽键，在形成该片段时要脱去分子水。
(3)一分子肉毒类毒素至少含有个氨基和个羧基。
(4)肉毒类毒素可用试剂鉴定，该试剂使用方法是，反应颜色为。
【解析】该题考查生命观念和科学思维。
从题图及题意(由两个亚单位组成，且每个亚单位为一条链盘曲折叠而成)可知肉毒类毒素的化学本质是蛋白质。
图中有4个肽键，5个氨基酸，因为有5种R基，所以是5种氨基酸，每形成1个肽键脱去1分子水。
在肽链的两端，各有1个羧基和1个氨基，若R基中不含氨基和羧基，1条肽链至少含有1个氨基和1个羧基。
蛋白质与双缩脲试剂反应呈现紫色，可用于蛋白质的鉴定。
【答案】(1)蛋白质(2)高温使蛋白质空间结构破坏(3)5 4 4(4)双缩脲先加A液，再加B液紫色
3.蛋白质的多样性
特别提醒：
多肽的多样性不包括肽链的数目和空间结构。
【例3】用氨基酸自动分析仪测定几种多肽化合物的氨基酸数目如下：
（1）表格中①②③的氨基酸数目虽然相同，但其生理作用各不相同，这是因为它们的。
（2）⑥中的氨基酸的种类最多有种。
（3）合成④的方式为，合成场所是。
（4）假设构成此六种多肽的氨基酸的平均相对分子质量为m，则⑤的相对分子量比④的相对分子量多。
【解析】该题考查生命观念和科学思维。
蛋白质是由氨基酸经过脱水缩合而成的，合成蛋白质的场所在核糖体，氨基酸的种类、数目、排列顺序不同，肽链的空间结构不同，则蛋白质的结构具有多样性，从而决定蛋白质具有多种功能。
⑥中有10个氨基酸，控制合成它的基因至少含有的脱氧核糖核酸数目为10×6=60个。
⑤的相对分子量为13×m-（13-1）×18=13m-216，④的相对分子量为10×m-（10-1）×18=10m-162，则两者差为3m-54。
【答案】（1）氨基酸的种类、排列顺序及肽链的空间结构不同（2）20（3）脱水缩合核糖体（4）3m－54
4.蛋白质的功能
蛋白质的功能举例
结构物质细胞膜主要由蛋白质和磷脂构成
催化功能酶大多数是蛋白质
运输功能血红蛋白、载体
防御功能抗体都是蛋白质
调控功能胰岛素和生长激素等
特别提醒：
酶和激素不都是蛋白质。
【例4】下列叙述中，哪项是对蛋白质功能的高度概括（）
A.细胞和生物体重要的结构物质
B.收缩、运输、免疫等活动的物质基础
C.生命活动的主要体现者
D.调节细胞和生物体新陈代谢的重要物质
【解析】该题考查生命观念和科学思维。
蛋白质是生命活动的主要承担者，能高度概括出蛋白质的功能，而细胞和生物体的重要结构物质，调节机体的生命活动，催化、运输、免疫等功能活动的物质基础等都只是蛋白质功能的某一方面。
【答案】C。