专题2 土壤中分解尿素的细菌的分离和计数

1个菌落→1个活菌
研究思路
❖ （二）统计菌落数目：
1、活体计数法（稀释涂布平板） （3）统计原则
①选 30∼300 个菌落的平板统计 ②每个稀释度取3个平板取其平均值
为什么？
研究思路
例：两位同学用稀释涂布平板法测定同一土壤样品中的细菌数。 从对应稀释倍数为106的培养基中，得到以下两种统计结果。 1、甲同学在该浓度下涂布了一个平板，统计的菌落数为230。 2、乙同学在该浓度下涂布了A、B、C三个平板，统计的菌落数 分别为21、212、256，该同学以这三个平板上菌落数的平均值 163作为统计结果。
•解析 反刍动物的瘤胃中含有大量的微生物，其中 也包括分解尿素的微生物。由于瘤胃中的微生物多为
厌氧菌，接触空气后会死亡，因此分离其中能分解尿
素的微生物除了需要准备选择培养基外，还应参照厌 氧菌的培养方法进行实验设计。
hfbz
实验过程
（三）微生物的培养与观察 1、接种：用适当的稀释液作涂布平板 2、培养：细菌：30∼37℃，1∼2d; 放线菌:25∼28℃, 5∼7d; 霉菌: 25∼28℃, 3∼4d. 3、观察：a.每24h统计一次菌落数目 b.以“稳定菌落”为观察对象
实验过程
（四）鉴定：筛选后必鉴定 鉴别培养基：不影响微生物的生存
你认为这两位同学的作法正确吗？如果有问题，错在哪？ 甲：没有重复实验（至少涂布3个平板） 乙：A组结果误差过大，不应用于计算平均值
研究思路
（4）统计结果：统计的菌落数往往比活菌的实际数目低，因 此统计结果一般用菌落数表示。 每克样品中的菌株数=（C/V)* M C:某一稀释度下平板上生长的平均菌落数； V:所用稀释液的体积；M:稀释倍数。
•(4)下列材料或用具：①培养细菌用的培养基与培养 皿；②玻璃棒、试管、锥形瓶和吸管；③实验操作 者的双手。其中需要灭菌的是________；需要消毒 的是________。(填序号)
•(5)在进行分离分解尿素的细菌的实验时，A同学从 培养基上筛选出大约150个菌落，而其他同学只筛选 出大约50个菌落。A同学的实验结果产生的原因可能 有______。(填序号) •①由于土样不同 ②由于培养基污染 •③由于操作失误 ④没有设置对照 •思维导图：
研究思路
❖ （一）筛选菌株
选择培养基：
允许特定种类的微生物生长，同时抑 制或阻止其他种类微生物生长的培养基。
菌株：
纯且活状态所保存的菌种 。
研究思路
KH2PO4 1.4g NaHPO4 2.1g
MgSO4 H2O 0.2g 葡萄糖 10.0g
尿素 1.0g
琼脂 15.0g
将上述物质溶解后， 用蒸馏水定容到 1000mL。
酚红培养基： 鉴定分解尿素的细菌。 原理：脲酶催化尿素分解成氨→ 培养基碱性增强→ 酚红变红→脲酶 阳性
实验过程
(1)作样品系列稀释液 (2)用适当的稀释液涂布平板
实验过程
在一定的培养条件下（相同的培养基、温度及 培养时间），同种微生物表现出相同而稳定的菌落 特征。
结果分析与评价
内容
现象
结论
有无杂菌污 染的判断
• D．确定对照组无菌后，选择菌落数在300以上 的实验组平板进行计数
•思维导图：
•深度剖析 确定对照组无菌后，选择菌落数在30～ 300的平板进行计数，D错；A是培养基的灭菌方法， B设置了一系列对照实验，C是细菌的培养方法，A、 B、C三个选项均是正确的。 •答案 D
[思维拓展]土壤中微生物含量不同，其活菌计数时所用的稀释倍 数也不同。如： 稀 倍释 数测 测 测细 放 真菌 线 菌数 菌 数： 数 ：选 ： 选用 选 用用1100421、 、03、1100531、 、04、1100641倍 倍05稀 稀 倍释 释 稀释
微生物的分离
• 【例1】 尿素是一种重要的农业肥料，但若不 经过细菌分解，就不能更好地被植物利用。生 活在土壤中的微生物种类和数量繁多，同学们 试图探究土壤中的微生物对尿素是否有分解作 用，设计了以下实验，并成功筛选到能高效降 解尿素的细菌(目的菌)。培养基成分如表所示， 实验步骤如图所示。请分析回答问题。
• 旁栏思考题
• 1．想一想，如何从平板上的菌落数推测出每 克样品中的菌落数？
• 答案 统计某一稀释度下平板上的菌落数，最 好能统计3个平板，计算出平板上的菌落数的平均 值，然后按课本旁栏的公式进行计算。
• 2．为什么分离不同的微生物要采用不同的稀 释度？测定土壤中细菌的总量和测定土壤中能分 解尿素的细菌的数量，选用的稀释范围相同吗？
• 答案 这是因为土壤中各类微生物的数量(单 位：株/kg)是不同的，例如在干旱土壤中的上层 样本中，好氧及兼性厌氧细菌数约为2 185万，放 线菌数约为477万，霉菌数约为23.1万。因此，为 获得不同类型的微生物，就需要按不同的稀释度 进行分离，同时还应当有针对性地提供选择培养 的条件。测定土壤中细菌的总量和测定土壤中能 分解尿素的细菌的数量，选用的稀释范围不相同。
微生物的计数
• 【例2】 下列是关于“检测土壤中细菌总数”实 验操作的叙述中，错误的是 ( )。
• A．用蒸馏水配制牛肉膏蛋白胨培养基，经高 温、高压灭菌后倒平板
• B．取104、105、106倍的土壤稀释液和无菌水 各0.1 mL，分别涂布于各组平板上
• C．将实验组和对照组平板倒置，37 ℃恒温培 养24～48h
结果分析与评价
❖特别提示 (1)不同细菌的菌落在大小、形状、光泽度、 颜色、硬度、透明度等方面的特征不同，可以作为菌种鉴定 的重要依据。 ❖(2)进行活菌计数时，统计的菌落数往往比活菌的实际数 目低，这是因为两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到 的只是一个菌落。 ❖(3)选择培养基一般只生长具有特定代谢特性的微生物， 鉴别培养基可以存在其他微生物，而且能鉴别特定的微生物。
•练习(教材P26) •1．提示 菌落是单个微生物在适宜固体培养基 表面或内部生长繁殖到一定程度，形成肉眼可见 的、有一定形态结构的子细胞的群落。可以通过 稀释涂布平板法计算活菌的数目，其原理是培养 基上的一个菌落来源于一个活菌。
•2．提示 利用以尿素为唯一氮源的选择培养基 在无氧环境中培养牛瘤胃提取物，选择能够正常 生长的菌落即为分解尿素的微生物。
琼脂
15 g
尿素
1g
葡萄糖
10 g
MgSO4·7H2O
0.2 g
Na2HPO4
2.1 g
KH2PO4
1.4 g
将上述物质溶解后，用蒸馏水定容到100 mL
•(1)培养基中加入尿素的目的是筛选________，这 种培养基属于________培养基。
•
• (2)“目的菌”生长所需的氮源和碳源分别来自培养 基中的_______和_____，实验需要振荡培养，原因 是______________。 •(3)转为固体培养基时，常采用________的方法接种， 获得单菌落后继续筛选。
•[思维拓展](1)利用选择培养基设计实验分离纯化微 生物。 •①真菌：用含青霉素的培养基分离。 •②金黄色葡萄球菌：用含高浓度食盐水的培养基分 离。 •③固氮微生物：用无氮培养基分离。 •④自养型微生物：用含无机碳源的培养基分离。 •⑤光合细菌：用含无机碳源的培养基在无氧而有光 照的环境中分离。 •⑥厌氧型和兼性厌氧型微生物：用普通培养基在无 氧条件下分离。
课题目的：分离产生脲酶的细菌
研究思路
❖ （一）筛选菌株
提出的问题 —如何寻找耐高温的酶？
（1）自然界中目的菌株筛选的依据是根据它对 生存环境 的 要求，到相应的环境中去寻找。
（2）实验室中微生物筛选的原理： 人为提供有利于 目的菌株 生长的条件(包括营养、温
度、pH等)，同时 抑制 或 阻止 其他微生物生长。
•⑦乳酸菌：用乳酸含量较高，pH较低的普通培养基 分离。 •⑧假单胞杆菌：用石油作为唯一碳源的培养基分离。 •(2)微生物分离与计数中两种对照组的作用： •①判断培养基中是否有杂菌污染，需将未接种的培 养基同时进行培养。 •②判断选择培养基是否具有筛选作用，需设立牛肉 膏蛋白胨培养基进行接种后培养，观察两种培养基上 的菌落数目，进行对比得出结论。对照的培养皿中 Nhomakorabea菌 落生长
培养物中菌落数偏高
菌落形态多样，菌落 数偏高
未被杂菌污染 被杂菌污染 培养物中混入其他杂菌
选择培养基 的筛选作用
牛肉膏培养基上的菌 落数目大于选择培养 选择培养基具有筛选作用 基上的数目
样品的稀释 操作
得到三个或三个以上 菌落数目在30～300 的平板
操作成功
重复组的结果
若选取同一种土样，统计结果应接近
菌落计数
液
培养
（一）土壤取样
1、天然培养基和合成培养基：
2、土壤取样：
（1）取样的位置：
土壤，天然培养基，含有大量的微生物，
其中70∼90％是细菌。在富含有机质的土壤
层的3∼8cm处中分布着绝大多数的细菌。
（2）取样要求：铲去表层土。
实验过程
（二）样品稀释 （1）测细菌数：一般用104、105、106稀释 液 （2）测放线菌：一般用103、104、105稀释 液 （3）测真菌数：一般用102、103、104稀释 液
专题2 微生物的培养和应用
合肥八中 宋 晖
内容纲要
2.1 微生物的实验室培养 2.2 土壤中分解尿素的细菌的分离与计 数 2.3 分解纤维素的微生物的分离
课题背景
➢尿素[CO(NH2)2]——重要的农业氮肥。 ➢只能被土壤中细菌分解为NH3才能被植物吸收
利用 CO(NH2)2 + H2O 细菌脲酶 CO2 +2NH3
研究思路
设置对照—同等条件下，培养空白培养基
（三）设置对照 1、设置对照的目的： 排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提 高实验结果的可信度。