TAKARA公司pMD19-T说明书
宝生物PCR试剂盒说明书
-2-
mRNA
使用 AMV 反转录酶，配制反转录反应液合成 cDNA 的第一条链。
按以下条件进行反转录反应：
（ 30℃
10 min.）*
42℃～60℃ 15～30 min. 1 Cycle95℃5 min.
5℃
5 min.
* 使用 Random 9 mers 进行反转录时，首先在 30℃下保温 10 min，使 Random
1 ml
1 ml 150 μl
1 ml 25 μl
25 μl
25 μl
【各种引物序列】
引物名称 Random 9 mers Oligo dT-Adaptor Primer Control F-1 Primer Control R-1 Primer M13 Primer M4
各引物序列 5′-（P）NNNNNNNNN-3′ 包含 dT 区域及 M13 Primer M4 序列。 5′-CTGCTCGCTTCGCTACTTGGA-3′ 5′-CGGCACCTGTCCTACGAGTTG-3′ 5′-GTTTTCCCAGTCACGAC-3′
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●引物选择
用于反转录的引物可视实验具体情况选择 Random 9 mers、Oligo dT-Adaptor Primer 或特异性下游引 物。对于不具有 Hairpin 构造的短链 mRNA，3 种引物中的任何一种都可以使用，但一般应按以下方法进 行选择。
Random 9 mers
Oligo dT-Adaptor Primer
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●RNA 样品制备
本试剂盒是把 RNA 合成 cDNA，然后再对此 cDNA 进行扩增的试剂盒。RNA 的纯度会影响 cDNA 的合成 量，而制备 RNA 的关键是要抑制细胞中的 RNA 分解酶和防止所用器具及试剂中的 RNA 分解酶的污染。因 此，在实验中必须采取以下措施：戴一次性干净手套；使用 RNA 操作专用实验台；在操作过程中避免讲话 等等。通过以上办法可以防止实验者的汗液、唾液中的 RNA 分解酶的污染。
takara反转录试剂盒说明书
Code No. RR047A 研究用PrimeScript™RT reagent Kitwith gDNA Eraser(Perfect Real Time)说明书目录内容页码●制品说明1●制品内容 1 ●试剂盒外必备材料 1 ●保存 1 ●特长 2 ●使用注意 2 ●操作方法 2 ● Real Time PCR 4 ●实验例 6 ●附录7 ●关联产品8●制品说明为了准确地进行基因表达量分析，必须满足只有cDNA作为模板检出的先决条件，但Total RNA中常常混有基因组DNA，并可以直接作为PCR反应的模板进行扩增，因此会造成解析结果不准确。
为了避免这种情况发生，通常将检测用引物设计在内含子前后的外显子上，使基因组DNA得不到扩增。
但是，此方法不适合具有单个外显子的基因或两个外显子之间所跨的内含子过小的基因，同时当基因组上有伪基因存在时、或设计引物对基因组有非特异性扩增时、以及基因信息没被完全解析的生物种等也同样不适合于本方法。
在这种情况下，我们常常需要对Total RNA样品进行DNase I处理，以除去残存的基因组DNA。
而DNase I处理通常要进行复杂的纯化操作，同时会造成RNA的降解和损失。
PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser是可以除去基因组DNA进行Real Time RT-PCR反应的专用反转录试剂。
Kit中使用了具有较强DNA分解活性的gDNA Eraser，通过42℃，2 min即可除去基因组DNA。
同时由于反转录试剂中含有抑制DNA分解酶活性的组分，经过gDNA Eraser处理后的样品可以直接进行15 min的反转录反应合成cDNA，因此，20 min内即可迅速完成从基因组DNA去除到cDNA合成的全过程。
使用本制品合成的cDNA适用于SYBR® Green分析法和TaqMan®探针分析法，可以根据实验目的，选择与SYBR Premix Ex Taq™ II（Tli RNaseH Plus）（Code No. RR820Q/A/B）、Probe qPCR Mix（Code No. RR391S/A/B）组合使用。
基因克隆实验手册
插入片段 线性化载体
推荐使用的试剂盒
产品信息
DNA Ligation Kit <Mighty Mix> P4
Blunting Kination Ligation (BKL) Kit
P6
TaKaRa DNA Ligation Kit LONG P4
Mighty TA-cloning Kit
P6
Mighty TA-cloning Reagent Set for PrimeSTAR®
↓ ③42℃反应45秒后，在冰中放置1～2分钟
↓ ④加入已预先37℃保温的SOC培养基，使终体积为1 ml。
↓ ⑤37℃振荡培养1小时（160～225 rpm）
↓ ⑥取适量涂布于LB选择培养基、37℃过夜静置培养
5. PCR扩增确认插入片段DNA 6. 培养、纯化质粒
PCR扩增确认插入片段DNA请参考第5页
TCGA 5’ Hin d Ⅲ
线性化载体 ※
C TAG A G C T
※ 利用限制性内切酶酶将环状载体DNA切断后，切胶 回收、或必要时进行去磷酸化反应
转化
·感受态细胞
形成菌落
进行菌落PCR 确认插入片段
·EmeraldAmp® MAX PCR Master Mix等
·电泳相关制品
— 1—
基因克隆实验手册
※ PCR扩增产物是平滑末端时进行dA加尾反应。
【目的DNA片段】 带有限制性内切酶的
酶切末端
In-Fusion克隆
5×In-Fusion® HD In-Fusion酶使 Enzyme Premix 末端15个相同
碱基无缝融合
TA克隆
3’ A
A 3’
T载体
pMD19-T载体说明书
TaKaRa Code：D102ApMD®19-T Vector宝生物工程(大连)有限公司目录内 容 Page●制品说明 1●制品内容 1●保 存 1●纯 度 1●用 途 1●pMD®19-T Vector的结构 1 ●实验操作 2■Control DNA片段的克隆实验2■一般DNA片段的克隆实验2●相关说明 3 ●使用注意 4 ●Q&A4●制品说明pMD ®19-T Vector是一种高效克隆PCR产物（TA Cloning）的专用载体。
本载体由pUC19载体改建而成，在pUC19载体的多克隆位点处的Xba I和Sal I识别位点之间插入了Eco R V识别位点，用Eco R V进行酶切反应后，再在两侧的3＇端添加“T”而成。
因大部分耐热性DNA聚合酶进行PCR反应时都有在PCR 产物的3＇末端添加一个“A”的特性，所以使用本制品可以大大提高PCR产物的连接、克隆效率。
由于本载体以pUC19载体为基础构建而成，所以它具有同pUC19载体相同的功能。
此外，本制品中的高效连接液Solution I 可以在短时间内（约30分钟）完成连接反应，其连接液可以直接用于细菌转化，大大方便了实验操作。
本制品中的Control Insert（500 bp）还可以用于Control 反应。
本载体与pMD ®18-T Vector 相比，本制品的 β-半乳糖苷酶的表达活性更高，菌落显示蓝色的时间缩短，菌落显示的蓝色更深。
因此，克隆后更容易进行克隆体的蓝白筛选。
●制品内容pMD ®19-T Vector（50 ng/μl） 20 μl×1支 Control Insert（50 ng/μl）10 μl×1支 Solution I*75 μl×2支* 使用时请于冰中融解。
●保存： -20℃●纯度■ Control Insert 经克隆后的白色菌落中，有90%以上含有Insert DNA 片段。
pMD-19T
效率（连接效率与转化效率）偏低，此时可以延长连接反应时间，或采用电转化方法。 5. 进行切胶回收纯化 DNA 片段时，不要使 DNA 片段在紫外线下暴露时间过长。 6. Solution I 应尽量避免反复冻融。 7. 建议使用新配制的平板培养基。
1 μl
Control Insert*2
1 μl
dH2O
3 μl
2）加入 5 μl（等量）的 Solution I。 3）16℃反应 30 分钟。
注） ① 室温（25℃）也能正常进行连接反应，但反应效率稍微降低。 ② 5 分钟也能正常进行连接反应，但反应效率稍微降低。
4）全量（10 μl）加入至 100 μl JM109 感受态细胞中，冰中放置 30 分钟。 5）42℃加热 45 秒钟后，再在冰中放置 1 分钟。 6）加入 890 μl SOC 培养基，37℃振荡培养 60 分钟。 7）在含有 X-Gal、IPTG、Amp 的 L-琼脂平板培养基上培养，形成单菌落。计数白色、蓝色菌落。 8）挑选白色菌落，使用 PCR 法确认载体中插入片段的长度大小。
TaKaRa Code：D104A
pMDTM19-T Simple Vector
目录
内容
●制品说明 ●制品内容 ●保 存 ●纯 度 ●用 途 ●pMDTM19-T Simple Vector的结构 ●实验操作
■Control DNA 片段的克隆实验 ■一般 DNA 片段的克隆实验
pMD18-T载体说明书
TaKaRa Code：D101ApMD®18-T Vector宝生物工程(大连)有限公司目录内 容 Page●制品说明 1●制品内容 1●保 存 1●纯 度 1●用 途 1●pMD®18-T Vector的结构 1 ●实验操作 2■Control DNA片段的克隆实验2■一般DNA片段的克隆实验2●相关说明 3 ●使用注意 4 ●Q&A4●制品说明pMD®18-T Vector是一种高效克隆PCR产物（TA Cloning）的专用载体。
本载体由pUC18载体改建而成，在pUC18载体的多克隆位点处的Xba I和Sal I识别位点之间插入了Eco R V识别位点，用Eco R V进行酶切反应后，再在两侧的3＇端添加“T”而成。
因大部分耐热性DNA聚合酶进行PCR反应时都有在PCR 产物的3＇末端添加一个“A”的特性，所以使用本制品可以大大提高PCR产物的连接、克隆效率。
由于本载体以pUC18载体为基础构建而成，所以它具有同pUC18载体相同的功能。
此外，本制品中的高效连接液Solution I可以在短时间内（约30分钟）完成连接反应，其连接液可以直接用于细菌转化，大大方便了实验操作。
本制品中的Control Insert（500 bp）还可以用于Control反应。
●制品内容pMD®18-T Vector（50 ng/μl） 20 μl×1支Control Insert（50 ng/μl） 10 μl×1支Solution I* 75 μl×2支* 使用时请于冰中融解。
●保存：-20℃●纯度■ Control Insert经克隆后的白色菌落中，有90%以上含有Insert DNA片段。
●用途■ 进行TA克隆，克隆PCR产物。
■ 对克隆后的PCR产物使用Bca BEST TM Sequencing Primers、M13 Primers进行DNA测序。
T载体克隆连接原理、制备及载体序列
T载体克隆连接原理、制备及载体序列T载体的定义：T载体（T-Vector）是一种髙效克隆PCR产物（TA克隆）的专用质粒载体，为线性化载体，无需酶切可直接与具有A末端的PCR产物连接，属于非定向克隆。
T载体的作用原理：大部分耐热性DNA聚合酶进行PCR反应时都具有在PCR产物的3'末端添加一个“A”的特性（下图红色框内所示位置）。
因此，人们在线性化平末端载体的两端分别又人工加上一个额外的T碱基（下图两个红色箭头所示），从而可与PCR克隆产物的A末端互补配对，提髙了PCR产物连接和克隆的效率。
T载体进行TA克隆的优势：相对于另一种非定向克隆平末端克隆，使用T载体进行TA克隆是一种快速、髙效、一步到位的非定向克隆法。
有研究曾证明，平末端克隆的连接效率仅为粘端连接的1/50，且自身环化率髙。
T载体的制备：1商业化T载体：一般来说，商业化的T载体多是先使用平端限制性内切酶（如EcoRV）将克隆载体进行线性化，然后再单独加入dTTP和Taq酶72〜751反应，进行末端的加T。
2自制T载体：一种常见的自制方法是利用限制性内切酶制造出具有单个T末端突出的片段,最常用的内切酶为Xcml,其识别和切割特点如下：其中XcmI的识别序列分别为两端的CCA和TGG，而切割序列则为中间三角箭头所指的N（N代表任意碱基）。
由于N可以是任意碱基，所以如果将切割位置的N设置为T，那么在该酶的切割下，就可以产生一个3'T末端。
相似的，在其互补链上设置另一个相同或者类似的XcmI酶切位点（保证切割位点为T即可）就可以产生另一个T末端。
一般可以在商业化的T载体基础上进行改造，通过PCR或者合成Oligo的方式插入上述两个XcmI位点。
连接成功的质粒可按需要自行扩增和保存，使用时用XcmI进行完全酶切（这里的酶切必须保证完全，否则载体易自连，所以XcmI酶最好过量，或者适当延长消化时间），就可以制备得到T载体。
[3]常见T载体及序列：虽然上面提到可以自制T-Vector，但实际上现在的商业化载体已经做到比较便宜，而且批次间稳定性保持的不错。
Takara基因组抽提试剂盒说明书
照说明书的要求进行。 ② DNA 中含有乙醇。在 Rinse B 洗净时，离心速度和时间应严格遵循说明书要求进行。
Q5. 能否使用本试剂盒提取酵母菌中的基因组 DNA？ A5. 不能。因为酵母菌属于真核微生物，其细胞壁的化学组成和结构与细菌不同，因此 Lysozyme 不
TaKaRa Code：DV810A
MiniBEST Bacterial Genomic DNA Extraction Kit Ver.2.0 （50 次量）
说明书
宝生物工程(大连)有限公司
内容
●制品说明 ●制品内容 ●运输温度 ●保存温度 ●实验前的准备 ●操作方法 ●使用例 ●注意事项 ●Q&A
22 ml
Solution C
35 ml
DB Buffer
25 ml
Rinse A
28 ml
Rinse B*3
24 ml
Elution Buffer
4 ml
*1 RNase A1 为混浊溶液。 *2 若出现沉淀，请于 65℃加热溶解，待恢复至室温后使用。 *3 首次使用前，请添加 56 ml 的 100%乙醇。
11. 弃 Filter Cup，在滤液中加入 450 μl 的 DB Buffer， 混合均匀。
12. 将试剂盒中的 Spin Column 安置于 Collection Tube 上。
-2-
图 1. 操作流程简图
13. 将上述操作 11 的混合液转移至 Spin Column 中，12,000 rpm 离心 1 分钟，弃滤液。 14. 将 500 μl 的 Rinse A 加入至 Spin Column 中，12,000 rpm 离心 1 分钟，弃滤液。
pMD19T
BcaBESTTM Sequencing Primer RV-M
GAGCGGATAACAATTTCACACAGG lacZ
Hind III
Hinc II Sse8387 I Acc I
Sph I Pst I Sal I EcoR V
Xba I
BamH I
Xma I Sma I Kpn I
Sac I
EcoR I
PCR产物克隆系列载体
Amp r
pMD18-T Vector pMD19-T Vector
D101A D102A
1 µg
500 元
1 µg
500 元
pMD18-T Vector、pMD19-T Vector是一种高效克隆PCR产物 (TA Cloning) 的专用载体。这两种载体分别由pUC18、pUC19 载体改建而成，在pUC18、pUC19载体的多克隆位点处的Xba I和Sal I识别位点之间插入了EcoR V识别位点，用EcoR V 进行酶切反应后，再在两侧的3'端添加 "T" 而成。因大部分耐热性DNA聚合酶进行PCR反应时都有在PCR产物的3'末端添加一个 "A" 的特性，所以使用这两种制品可以大大提高PCR产物的连接、克隆效率。 由于这两种载体是分别以pUC18、pUC19载体为基础构建而成，所以它具有同pUC18、pUC19载体相同的功能。此外，这 两种制品中的高效连接液Ligation Mix可以在极短时间内 (约5分钟) 完成连接反应，且此连接液可以直接用于细菌转化，大 大方便了实验操作。制品中的Control Insert (500 bp) 还可以用于Control反应。 pMD19-T Vector与pMD18-T Vector相比，pMD19-T Vector的β-半乳糖苷酶的表达活性更高，菌落显示蓝色的时间缩短，菌 落显示的蓝色更深。因此，克隆后更容易进行克隆体的蓝白筛选。
Takara 感受态制备试剂盒说明书
TaKaRa Code：D406Competent Cell Preparation Kit次（200量）宝生物工程(大连)有限公司目录内 容 页 码●制品说明 1●制品内容 1●制品保存 1●使用注意 1●感受态细胞的制备方法 1●感受态细胞的DNA转化 2●实验例 2●相关试剂及培养基的制备方法 3■Ampicillin 3■IPTG 3■X-Gal 3■LB培养基 3■LB/Amp培养基 3■SOB培养基 3■SOC培养基 4■φb×broth 4■LB/Amp/X-Gal/IPTG平板培养基 4●制品说明大肠杆菌经过处理后可以摄取外源DNA（Plasmid DNA、Phage DNA等），处于这种状态的细胞称为感受态细胞（Competent Cell）。
在基因工程实验中，经常要使用各种感受态细胞进行DNA的转化操作。
实验使用的感受态细胞的来源大体可以分为两种：一种是购买商品化的感受态细胞，但商品化感受态细胞成本高、运输及保存有一定困难（超低温）；另一种是自己制备感受态细胞，实验人员自己制作感受态细胞时，往往受到各种试剂及实验条件等限制，制备的感受态细胞效率低，达不到实验要求。
TaKaRa Competent Cell Preparation Kit是一种方便、高效、快速制备感受态细胞的试剂盒。
使用本试剂盒制备的感受态细胞可以满足大多数实验的需要，并且适用于几乎所有常用的大肠杆菌，例如：E.coli DH5α、JM109、CJ236、HB101、MV1184、BMH71-18mut S等，转化效率均可以达到1×106 cfu/μg pUC19以上（转化效率根据大肠杆菌细胞系及转化用DNA不同稍有差异）。
使用本试剂盒制备的感受态细胞可以在-80℃保存一年。
●制品内容（200次量）Solution A 20 mlSolution B 20 ml●制品保存：4℃保存。
●使用注意1.制作感受态细胞时应使用专用的玻璃器皿或塑料容器。
Takara基因组抽提试剂盒说明书
1% Agarose 凝胶电泳图 M1 ： λ-Hind III digest DNA Marker
1 ： 纯化的基因组 DNA 2 ： PCR 扩增片段（约 1,500 bp） M2 ： DL2,000 DNA Marker
图 2.基因组 DNA 及其 PCR 扩增结果电泳图 -3-
注）请确认 Rinse B 中已经加入了指定体积的 100%乙醇。 15. 重复操作步骤 14，然后从负压装置上取下 Spin Column，将其安置于试剂盒中的 Collection Tube
上。 16. 12, 000 rpm 离心 1 分钟。 17. 将 Spin Column 安置于新的 1.5 ml 的离心管上，在 Spin Column 膜的中央处加入 60 μl 的灭菌
Q1. 基因组 DNA 的收率较低或无基因组 DNA，为什么？ A1. 一般正常情况下，1～4 ml 的过夜培养大肠杆菌中，可以提取约 3 μg 的基因组 DNA。基因组 DNA
收量较低时，可以从以下几个方面考虑： ① DNA 未充分释放。保证在 SP Buffer 中充分悬浮菌体，注意不要残留菌块；加入 Solution A
否则将阻碍 DNA 结合到 DNA 制备膜上。 5. 部分试剂中含刺激性化合物，在步骤 7 以后的操作中请戴上乳胶手套和眼镜，并应尽量在通风橱中
进行。若沾染皮肤、眼睛时，要立即用大量清水冲洗，必要时应寻求医疗咨询。 6. 基因组 DNA 需长期保存时，建议在 Elution Buffer 中保存。
●Q&A
11. 弃 Filter Cup，在滤液中加入 450 μl 的 DB Buffer， 混合均匀。
12. 将试剂盒中的 Spin Column 安置于 Collection Tube 上。
takara反转录试剂盒说明书
takara反转录试剂盒说明书关键信息项：1、试剂盒名称：Takara 反转录试剂盒2、适用样本类型：＿___________________________3、反应体系：＿___________________________4、反应条件：＿___________________________5、储存条件：＿___________________________6、有效期：＿___________________________1、产品简介11 Takara 反转录试剂盒是一种用于将 RNA 反转录为 cDNA 的高效、可靠的工具。
111 本试剂盒经过精心设计和优化，能够提供高质量的反转录产物，适用于各种下游分子生物学实验。
2、试剂盒组成21 反转录酶211 具有高活性和热稳定性，确保反转录反应的高效进行。
22 反转录缓冲液221 包含各种必要的成分，为反转录反应提供适宜的环境。
23 RNA 酶抑制剂231 有效抑制 RNA 酶的活性，防止 RNA 降解。
24 随机引物或 oligo(dT)引物241 可根据实验需求选择合适的引物进行反转录。
25 dNTP 混合物251 提供四种脱氧核糖核苷酸，用于 cDNA 合成。
3、适用样本类型31 总 RNA311 包括从细胞、组织、血液等样本中提取的总 RNA。
32 mRNA321 经过纯化或富集的 mRNA 样本。
4、反应体系41 建议的反应体系如下：411 RNA 模板：X μL（根据 RNA 浓度和实验需求确定）412 随机引物或 oligo(dT)引物：Y μL413 dNTP 混合物：Z μL414 反转录缓冲液：A μL415 RNA 酶抑制剂：B μL416 反转录酶：C μL417 无 RNase 水：补充至总体积D μL5、反应条件51 反转录反应的温度和时间可根据引物类型和RNA 质量进行调整。
511 使用随机引物时，反应条件通常为：25°C 孵育 10 分钟，然后42°C 孵育 30 60 分钟。
pMD19-T Simple Vector的结构
注） ① ② ③
室温（25℃）也能正常进行连接反应，但反应效率稍微降低。 5 分钟也能正常进行连接反应，但反应效率稍微降低。 长片段 PCR 产物（2 kbp 以上）进行 DNA 克隆时，连接反应时间请延长至数小时。
4） 取 2 μl 上述连接液（10 ng Vector DNA）加入到 microcentrifuge tubes 中，冰上冷却 2 min。 5） 取 50 μl E.coli JM109 Competent Cell 加入到上述 microcentrifuge tubes 中，混匀并冰浴 5 min。 6） 在含有 X-Gal、IPTG、Amp 的 L-琼脂平板培养基上培养（平板使用前需要在 37℃预热 30 分钟），形成
记录菌落数。以得到 200 个克隆体为例计算转化效率，此时的转化效率=200 cfu/0.001 ng=2×105 cfu/ng=2×108 cfu/μg pUC19 DNA。
● 使用注意
1. 由于载体上的多克隆酶切位点被破坏，所以使用本载体克隆 PCR 产物时，注意应在 PCR 引物上设计 导入酶切位点，否则将会难以切下 DNA 片段进行其它亚克隆实验。
2. Solution I 请于冰中融解。 3. 克隆时使用的 Insert DNA 片段（PCR 产物）建议进行切胶回收纯化，否则 PCR 产物中的短片段
DNA（甚至是电泳也无法确认的非特异性小片段）、残存引物等杂质都会影响 TA 克隆效率。 4. 按照本实验操作进行连接后，直接进行转化时的连接液不要超过 20 μl。当要转化的 DNA 量较大或准
●用 途
■ 进行 TA 克隆，克隆 PCR 产物。 ■ 对克隆后的PCR产物使用BcaBESTTM Sequencing Primers、M13 Primers进行DNA测序。
pmd18-19-T 质粒图谱
GAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGCTATGACCATGATTACGCCAAGCTTGCATGCCTGCAGGTCGACGATATCTCTAGAGGATCCCCGGGTACCGAGCTCGAATTC
ACTGGCCGTCGTTTTACAACGTCGTGACTGGGAAAACCCTGGCG CAGCACTGACCCTTTTGGGACCGC BcaBESTTM Sequencing Primer M13-47
LacZ operator
146 ~ 469
ColE1 ori
852 ~ 1466
Ampr
1626 ~ 2486
■ 实验操作 Control DNA片段的克隆实验 A.操作方法
1）在微量离心管中配制下列DNA溶液，全量为5 µl。
pMD18-T or pMD19-T Vector*1
1 µl
Control Insert*2
■ 相关说明 1.感受态细胞的选择。
PCR产物克隆系列载体
PCR产物克隆系列载体
转化时请使用高效的热转化感受态细胞（转化效率≥1
×108 cfu/µg pUC19)，这样才可能得到比较理想的阳
性克隆。 如果需要进行蓝白筛选时，宿主细胞必须具
有正确的基因型（F'编码的［ △M15］）产生 ω
Fragment，才可能和载体DNA产生的
ng DNA/ml)，将上述培养液稀释10倍后（0.01 ng
DNA/ml）取100 µl涂布平板（0.001 ng DNA/100
µl)，记录菌落数。以得到200个克隆体为例计算转化效 率，此时的转化效率=200 cfu/0.001 ng=2×105
cfu/ng=2×108 cfu/µg pUC19 DNA。
Takara 感受态制备试剂盒说明书
TaKaRa Code：D406Competent Cell Preparation Kit次（200量）宝生物工程(大连)有限公司目录内 容 页 码●制品说明 1●制品内容 1●制品保存 1●使用注意 1●感受态细胞的制备方法 1●感受态细胞的DNA转化 2●实验例 2●相关试剂及培养基的制备方法 3■Ampicillin 3■IPTG 3■X-Gal 3■LB培养基 3■LB/Amp培养基 3■SOB培养基 3■SOC培养基 4■φb×broth 4■LB/Amp/X-Gal/IPTG平板培养基 4●制品说明大肠杆菌经过处理后可以摄取外源DNA（Plasmid DNA、Phage DNA等），处于这种状态的细胞称为感受态细胞（Competent Cell）。
在基因工程实验中，经常要使用各种感受态细胞进行DNA的转化操作。
实验使用的感受态细胞的来源大体可以分为两种：一种是购买商品化的感受态细胞，但商品化感受态细胞成本高、运输及保存有一定困难（超低温）；另一种是自己制备感受态细胞，实验人员自己制作感受态细胞时，往往受到各种试剂及实验条件等限制，制备的感受态细胞效率低，达不到实验要求。
TaKaRa Competent Cell Preparation Kit是一种方便、高效、快速制备感受态细胞的试剂盒。
使用本试剂盒制备的感受态细胞可以满足大多数实验的需要，并且适用于几乎所有常用的大肠杆菌，例如：E.coli DH5α、JM109、CJ236、HB101、MV1184、BMH71-18mut S等，转化效率均可以达到1×106 cfu/μg pUC19以上（转化效率根据大肠杆菌细胞系及转化用DNA不同稍有差异）。
使用本试剂盒制备的感受态细胞可以在-80℃保存一年。
●制品内容（200次量）Solution A 20 mlSolution B 20 ml●制品保存：4℃保存。
●使用注意1.制作感受态细胞时应使用专用的玻璃器皿或塑料容器。
全基因合成
全基因合成
一．目的
将一系列化学合成的oligo通过PCR的方法拼装成客户所需的基因序列，并将合成的基因克隆入pMD18-T载体。
二. 方法
1. 基因序列的QC：对所需合成的基因全序列进行分析，检查基因内部是否含有复杂二级结构和重复序列。
根据序列的具体情况设计合成方案；
2. 根据基因序列分析的结果，进行单链oligo的设计及合成；
3. 利用PCR将合成的oligo拼接成完整的基因；
4. 将合成好的基因装入pMD18-T载体并转化至感受态细胞DH5 ；
5. 测序验证重组克隆中基因序列是否与要求相符。
三. 材料
1. 克隆载体：pMD18-T（Takara公司，载体图谱如下）：
基因插入位点
四. 结果
1. 重组克隆名称：
抗性：Amp
质粒DNA体积：20 ul
含质粒的甘油菌液体积：300 ul
储存条件：-20°C
2. 测序验证结果（重组克隆中插入基因序列，经拼接）：
五. 结论
所合成的基因经测序验证符合要求。
Takara+rTaq+聚合酶说明书
TaKaRa TaqTM使 用 说 明 书TaKaRa Code：DR100A●包装量：250 U●制品说明本制品是94 kDa 的耐热性DNA 聚合酶。
是把Thermus aquaticus DNA Polymerase 的基因经过克隆转化到大肠杆菌中进行表达后，分离提取而得到的。
它与天然Taq DNA 聚合酶具有相同的功能。
使用本制品扩增得到的PCR 产物的3′端附有一个“A”碱基，因此可直接克隆于T-Vector 中。
●制品内容TaKaRa Taq （5 U/μl）50 μl10×PCR Buffer（Mg 2+ Plus）1 ml 1） 以λDNA 为模板，可以很好地扩增8 kbp 的DNA 片段。
6×Loading Buffer*1 ml* ① 电泳时，请按每5 μl PCR 反应液中加入1 μl 本制品的比例添加混合后进行电泳。
② 6×Loading Buffer 详细说明请见TaKaRa 商品目录。
●保 存：-20℃●10×PCR Buffer 的组成10×PCR Buffer（Mg 2+Plus）Tris-HCl（pH8.3） 100 mM KCl 500 mM MgCl 215 mM●活性定义用活性化的大马哈鱼精子DNA 作为模板/引物，在74℃，30分钟内，摄入10 nmol 的全核苷酸为酸性不溶物的活性定义为1个活性单位（U）。
●纯 度1）10 U 的本酶和0.6 μg 的λ-Hin d III 在74℃下反应1小时，DNA 的电泳谱带不发生变化。
2）10 U 的本酶和0.6 μg 的SupercoiledpBR322 DNA 在74℃下反应1小时，DNA 的电泳谱带不发生变化。
3）10 U 的本酶和0.6 μg 的λDNA 在74℃下反应1小时，DNA 的电泳谱带不发生变化。
●用 途1） PCR 法扩增DNA。
2） DNA 序列测定。
天根 一步法逆转录PCR试剂盒说明书
通用型一步法RT-PCR试剂盒说明书前言本试剂盒适用于对各种动、植物、病毒RNA进行PCR 检测。
用户可根据被分析基因，配合一对引物，或同时采用Taqman 荧光探针，先将提取的RNA反转录(reverse transcription).成cDNA，再经过聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction)技术对特异性片段进行扩增，进行电泳或实时荧光分析。
一步法RT-PCR可使RT及PCR过程在单管中完成，比分开进行RT及PCR更方便。
由于不需要在RT完成后打开反应管，尽可能地避免了样品间的相互污染。
规格20人份适用仪器适用于各种普通PCR仪器和实时荧光PCR仪器。
试剂盒组成试剂准备根据下表配制反应液：振荡混匀后，按每管 40 μl(可根据需要调整)分装，备用。
PCR扩增将均一化后的RNA提取样本10 μl加入各反应管，混匀、离心后，置普通PCR仪器或实时荧光PCR仪器上进行扩增及实时检测。
结果判断扩增产物可直接进行电泳检测；实时荧光检测可根据相应仪器的配套软件进行结果分析。
保存及有效期-20℃保存，有效期为6个月。
注意事项1. 开始检测前请仔细阅读本说明书全文。
2. 整个检测过程中，反应体系的配制、样本处理及加样、PCR扩增（荧光检测）应分区进行以避免污染。
3. 操作人员应戴口罩，经常更换一次性手套，以避免RNA酶的污染；实验中所用器具均应经过除RNA酶处理。
4. 试剂盒组成中的试剂使用前应充分融化并混匀。
5. 进行实时荧光分析时，应使用透光性能较好的一次性薄壁离心管；.荧光探针应避光保存，加入缓冲液中后，应尽快进行扩增。
6. 注意适当处理检测中遗留的样品、扩增产物及可能被污染的试剂。
生产企业：上海蓝创生物科技发展有限公司。
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出现的菌落有可能呈现蓝色（或淡蓝色）。
Q-3 欲对克隆 DNA 片段进行测序时，使用何种引物？ A-3 本载体来源于 pUC19 载体。因此，用于 pUC19 载体测序的通用引物都可以使用。 Q-4 pMDTM19-T Vector与pMDTM18-T Vector相比有何不同？ A-4 pMDTM19-T Vector与pMDTM18-T Vector相比，β -半乳糖苷酶的表达活性更高，菌落显示蓝色的
B）结 果 使用Control Insert时的连接/转化结果如下，使用的感受态细胞的转化效率为：1.5×108 cfu/μg pUC19 DNA。
Control Insert
连接/转化效率 （cfu/μg Vector）
白色菌落比率（%）
效率（%）*
＋
2.8×106
96.3
90 以上
－
2.2×105
4）全量（10 μl）加入至 100 μl JM109 感受态细胞中，冰中放置 30 分钟。 5）42℃加热 45 秒钟后，再在冰中放置 1 分钟。 6）加入 890 μl SOC 培养基，37℃振荡培养 60 分钟。 7）在含有 X-Gal、IPTG、Amp 的 L-琼脂平板培养基上培养，形成单菌落。计数白色、蓝色菌落。 8）挑选白色菌落，使用 PCR 法确认载体中插入片段的长度大小。
注） ① 室温（25℃）也能正常进行连接反应，但反应效率稍微降低。 ② 5 分钟也能正常进行连接反应，但反应效率稍微降低。
4）全量（10 μl）加入至 100 μl JM109 感受态细胞中，冰中放置 30 分钟。 5）42℃加热 45 秒钟后，再在冰中放置 1 分钟。 6）加入 890 μl SOC 培养基，37℃振荡培养 60 分钟。 7）在含有 X-Gal、IPTG、Amp 的 L-琼脂平板培养基上培养，形成单菌落。计数白色、蓝色菌落。 8）挑选白色菌落，使用 PCR 法确认载体中插入片段的长度大小。
●制品说明
pMDTM19-T Vector是一种高效克隆PCR产物（TA Cloning）的专用载体。本载体由pUC19 载体改建而 成，在pUC19 载体的多克隆位点处的Xba I和Sal I识别位点之间插入了EcoR V识别位点，用EcoR V进行 酶切反应后，再在两侧的 3＇端添加“T”而成。因大部分耐热性DNA聚合酶进行PCR反应时都有在PCR 产 物的 3＇末端添加一个“A”的特性，所以使用本制品可以大大提高PCR产物的连接、克隆效率。 由于本载体以 pUC19 载体为基础构建而成，所以它具有同 pUC19 载体相同的功能。此外，本制品中的高 效连接液 Solution I 可以在短时间内（约 30 分钟）完成连接反应，其连接液可以直接用于细菌转化，大 大方便了实验操作。本制品中的 Control Insert（500 bp）还可以用于 Control 反应。 本载体与pMDTM18-T Vector 相比，本制品的 β -半乳糖苷酶的表达活性更高，菌落显示蓝色的时间缩短， 菌落显示的蓝色更深。因此，克隆后更容易进行克隆体的蓝白筛选。
●制品内容
pMDTM19-T Vector（50 ng/μl） Control Insert（50 ng/μl） Solution I* * 使用时请于冰中融解。
20 μl×1 支 10 μl×1 支 75 μl×2 支
●保 存： -20℃
●纯 度
■ Control Insert 经克隆后的白色菌落中，有 90%以上含有 Insert DNA 片段。
●Q&A
Q-1 怎样提高连接转化效率？ A-1 1. 确认 Insert DNA 片段的 3’末端是否带有“A”尾。大部分的高保真 DNA 聚合酶（如：TaKaRa
Pyrobest、KOD、Pfx、Pfu 等）扩增的 PCR 产物是平滑末端，不能直接进行 TA 克隆。 2. 纯化 PCR 产物。最好使用切胶回收的 PCR 片段，以除去 PCR 产物中的非特异性片段和引物等
TaKaRa Code：D102A
pMDTM19-T Vector
目录
内容
●制品说明 ●制品内容 ●保 存 ●纯 度 ●用 途 ●pMDTM19-T Vector的结构 ●实验操作
■Control DNA 片段的克隆实验 ■一般 DNA 片段的克隆实验
●相关说明 ●使用注意 ●Q&A
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●实验操作
■ Control DNA片段的克隆实验
A）操作方法
1）在微量离心管中配制下列 DNA 溶液，全量为 5 μl。
pMDTM19-T Vector*1
1 μl
Control Insert*2
1 μl
dH2O
3 μl
2）加入 5 μl（等量）的 Solution I。 3）16℃反应 30 分钟。
*3 Insert DNA的使用量 在进行克隆时，Vector DNA 和 Insert DNA 的摩尔比一般为 1 ：2～10。
●相关说明
1. 感受态细胞的选择。 转化时请使用高效的热转化感受态细胞（转化效率≥1×108 cfu/μg pUC19），这样才可能得到比较理想 的阳性克隆。如果需要进行蓝白筛选时，宿主细胞必须具有正确的基因型（F’编码的［LacZ△M15］） 产生 ω Fragment，才可能和载体 DNA 产生的 LacZ α 多肽相结合，表现出 β -半乳糖苷酶活性（α 互补性）。 2. Insert DNA 的要求。 Insert DNA 应该进行切胶回收的纯化处理后才进行载体连接，尽量避免引物等其它杂质的存在。切胶回 收时可使用 TaKaRa 凝胶回收试剂盒（TaKaRa Code：D301 或 DV805A）。 3. Insert DNA 使用量的计算方法。 进行克隆时，Vector DNA 和 Insert DNA 的摩尔数比一般为 1：2～10，我们可以根据自己的实验情况 选择合适的 Vector DNA 和 Insert DNA 的摩尔数比。Insert DNA 使用量的计算方法如下： Insert DNA 的使用量（ng）=nmol 数×660×Insert DNA 的 bp 数 本载体 1 μl（50 ng）的摩尔数约为 0.03 pmol。 4. 阳性克隆的检测。 DNA片段成功插入至pMDTM19-T Vector中后，一般情况下 β -半乳糖苷酶的表达将受到破坏，重组克隆 体在含有X-Gal、IPTG、Amp的L-琼脂平板培养基上培养时将显示白色菌落。但有时比较短的DNA片段 插入载体时，基因的读码框有可能正好与LacZ的读码框相吻合，克隆体也会显示蓝色菌落。有报道称，2 kbp的DNA片段插入到载体中后，重组克隆体仍显示了蓝色。所以，当我们没有得到白色菌落时，可以试 着检测蓝色菌落。进行阳性克隆检测时，我们建议使用PCR的方法，扩增用引物可以使用BcaBESTTM Sequencing Primers，可以对菌体直接进行PCR扩增。
40.2
0
* 效率是指白色菌落中的目的 DNA Insert 片段的连入效率。
■一般DNA片段的克隆实验
1）在微量离心管中配制下列 DNA 溶液，全量为 5 μl。
pMDTM19-T Vector*1
1 μl
Insert DNA*3
0.1 pmol～0.3 pmol
dH2O
up to 5 μl
-2-
*1 pMDTM19-T Vector的使用量 取 0.5 μl实验也可得到满意的结果。实际操作时，可按实验需要确定T载体的使用量。pMDTM19-T Vector 1 μl（50 ng）的摩尔数约为 0.03 pmol。
*2 Control Insert Control Insert 为 500 bp 的 3′末端带有 A 碱基的 PCR 产物，Control Insert 1 μl（50 ng）的摩 尔数约为 0.15 pmol。
2）加入 5 μl（等量）的 Solution I。 3）16℃反应 30 分钟。
注） ① 室温（25℃）也能正常进行连接反应，但反应效率稍微降低。 ② 5 分钟也能正常进行连接反应，但反应效率稍微降低。 ③ 长片段 PCR 产物（2 kbp 以上）进行 DNA 克隆时，连接反应时间请延长至数小时。
时间缩短，菌落显示的蓝色更深。pMDTM18-T Vector连接转化后，一般要经 37℃过夜培养，然后 再将其于冰箱内放置一段时间后，其蓝白菌落才能明显呈色。而pMDTM19-T Vector涂板培养后一般 只需 10 个小时（37℃）便可以呈色。因此，pMDTM19-T Vector比pMDTM18-T Vector更适合于蓝 白菌落的筛选。
杂质。进行切胶回收时可以使用 TaKaRa 凝胶回收试剂盒（TaKaRa Code：D301 或 DV805A）。 3. 请使用转化效率大于 108 cfu/μg pUC19 DNA的感受态细胞。 4. DNA 片段的立体结构、DNA 片段的长短都会影响克隆效率。一般情况下，大片段 DNA 的克隆
效率（连接效率与转化效率）偏低，此时可以延长连接反应时间，或采用电转化方法。 5. 进行切胶回收纯化 DNA 片段时，不要使 DNA 片段在紫外线下暴露时间过长。 6. Solution I 应尽量避免反复冻融。 7. 建议使用新配制的平板培养基。
●使用注意
1. Solution I 请于冰中融解。 2. 克隆时使用的 Insert DNA 片段（PCR 产物）建议进行切胶回收纯化，否则 PCR 产物中的短片段
DNA（甚至是电泳也无法确认的非特异性小片段）、残存引物等杂质都会影响 TA 克隆效率。 3. 按照本实验操作进行连接后，直接进行转化时的连接液不要超过 20 μl。当要转化的 DNA 量较大或