LIPOFECTAMINE 2000转染试剂转染步骤
LIPOFECTAMINE2000转染试剂转染步骤
LIPOFECTAMINE2000转染试剂转染步骤转染是指将外源DNA或RNA导入到目标细胞中的过程，LIPOFECTAMINE2000是一种常用的转染试剂。
下面是使用LIPOFECTAMINE2000进行转染的详细步骤：步骤一：细胞处理1.1培养要转染的细胞株，并确保细胞达到70%-80%的密度。
1.2使用无菌PBS洗涤细胞，将细胞悬浮于含有10%FBS的完全培养基中。
1.3通过计数细胞数来得到适当的细胞密度，以确保每个孔或皿中有足够的细胞进行转染。
步骤二：DNA/RNA和转染试剂的配制2.1在无菌离心管中配制DNA/RNA和转染试剂的混合液。
按照试剂的说明书中的推荐比例将DNA/RNA和转染试剂混合在一起，并使用无菌PBS 或者培养基和其它试剂进行稀释。
2.2轻轻摇晃混合液，避免产生气泡。
步骤三：转染3.1将配制好的转染混合液加入到每个孔或皿中，并轻轻摇晃培养皿/板使其均匀分布。
3.2将细胞和转染试剂混合液共孵育4-6小时，在37℃的CO2培养箱中进行转染反应。
转染时间可以根据目标细胞的特性进行调整。
步骤四：更换培养基4.14-6小时后，将转染混合液完全去除，并用预温热的完全培养基洗涤细胞，以去除未吸附的DNA/RNA和转染试剂。
4.2加入足够的完全培养基来覆盖细胞，尽量减少液体涡流，以避免对转染效率的不良影响。
步骤五：细胞培养和分析5.1将培养皿/板放回37℃的CO2培养箱中，并进行适当的培养条件。
5.2根据实验需要的时间点收集转染后的细胞进行后续的实验和分析。
需要注意的是，转染步骤中的各种参数（例如细胞密度、转染试剂的浓度和比例等）可能因不同的实验目的和目标细胞而有所不同。
因此，在具体操作中请参考所使用转染试剂和目标细胞的说明书，并根据实验需要进行相应的优化。
lipofectamine 2000
细胞转染
(1) 转染前一天，用胰酶消化对数生长期的BGC细胞并计数，以3.5×105/孔，将细胞接种于2mL 含10%胎牛血清的无抗生素培养基的6孔培养板中。
(2) 铺板次日，待细胞贴壁生长汇合度约80%，将6 孔板中每个孔的旧培养基吸尽，用不含血清的OPTI-MEM 培养基洗涤细胞2 次，然后 6 孔板每个孔中加入1.5mL 的无血清的OPTI-MEM 培养基。
(3) 取出Trop-2载体，空载体和脂质体Lipofectamine 2000 放置室温中，使其融化。
(4) 对于每孔细胞，用200ul OPTI-MEM 培养基分别稀释Trop-2载体2微克，空载体1微克，轻轻混合。
(5)取5u1 Lipofectamine 2000 缓慢加入至200ul OPTI-MEM 培养基中，并将两者轻轻混均，室温孵育5 分钟。
(25min内进行下一步操作)
(6) 将稀释后的Lipofectamine 2000 分别与Trop-2载体，空载体混合，轻柔操作，以防破坏Lipofectamine 2000 和RNA 链断裂，室温孵育20 分钟。
(7) 缓慢均匀的将上述复合物加入到相应孔中，摇动培养板，轻轻混匀。
(8) 将培养板放入37℃，5%的CO2 培养箱中孵育6 小时后，换含10%胎牛血清的无抗生素1640 培养液继续。
Invitrogen脂质体2000的操作流程及注意事项
Invitrogen脂质体2000的操作流程及注意事项发布日期：2010-11-13 21:29:08 浏览次数：338Invitrogen脂质体2000的操作流程及注意事项众所周知，Invitrogen脂质体2000是广大老师所熟知的转染试剂，其特点：转染步骤快速简便（1）DNA-阳离子脂质体试剂的复合体可以直接加入到细胞培养基中，有血清也不怕。
（2）转染后不需要除去Lipofectamine 2000试剂，无需换培养基。
我们介绍一下 Invitrogen脂质体2000的操作流程、注意事项等。
一、操作流程事实上Lipofectamine系列产品操作流程都是又快又简单：稀释DNA以及Lipofectamine 2000，混合2种稀释液保温20分钟，加入培养细胞中孵育24－96小时检测结果。
下面是Invitrogen提供的详细流程和注意事项。
1、转染前一天，胰酶消化细胞并计数，细胞铺板，使其在转染日密度为90%。
细胞铺板在0.5ml 含血清，不含抗生素的正常生长的培养基中。
2、对于每孔细胞，使用50μl无血清培养基（如OPTI-MEMⅠ培养基）稀释0.8μg-1.0μg DNA。
3、对于每孔细胞，使用50μl OPTI-MEMⅠ培养基稀释1μl-3μl LIPOFECTAMINE 2000试剂。
Lipofectamine 2000稀释后保温5分钟（在30分钟内同稀释的DNA混合。
保温时间过长会降低活性。
）注意：即使Lipofectamine 2000使用OPTI-MEMⅠ稀释，细胞也可以使用D-MEM培养。
如果D-MEM做为Lipofectamine 2000的稀释液，必须在5分钟内同稀释的DNA混合。
4、混合稀释的DNA（第2步）和稀释的Lipofectamine 2000（第3步）。
在室温保温20分钟。
注意：溶液可能会混浊，但不会影响转染。
复合物可以在室温保持6小时稳定。
5、直接将复合物加入到每孔中，摇动培养板，轻轻混匀。
Lipofectamine 2000细胞转染实验步骤 注意事项
Invitrogen阳离子转染试剂Lipofectamine 2000细胞转染实验步骤注意事项2010-07-10 16:16Invitrogen的细胞转染试剂：Lipofectamine 2000Lipofectamine 2000是最为人熟知的转染产品之一。
已知可为517种细胞（见下面连接地址）提供高转染效率（表达转基因细胞的百分数）和活性（细胞抽提物中转入基因的酶产物活性）。
特点两个关键性特点使得Lipofectamine 2000试剂的转染步骤快速简便：（1）DNA-阳离子脂质体试剂的复合体可以直接加入到细胞培养基中，有血清也不怕（2）转染后不需要除去Lipofectamine 2000试剂，无需换培养基操作流程事实上Lipofectamine系列产品操作流程都是又快又简单：稀释DNA 以及Lipofectamine 2000，混合2种稀释液保温20分钟，加入培养细胞中孵育24－96小时检测结果。
下面是Invitrogen提供的详细流程和注意事项。
转染前一天，胰酶消化细胞并计数，细胞铺板，使其在转染日密度为90%。
细胞铺板在0.5ml含血清，不含抗生素的正常生长的培养基中。
对于每孔细胞，使用50μl无血清培养基（如OPTI-MEMⅠ培养基）稀释0.8μg-1.0μg DNA。
对于每孔细胞，使用50μl OPTI-MEMⅠ培养基稀释1μl-3μl LIPOFECTAMINE 2000试剂。
Lipofectamine 2000稀释后保温5分钟（在30分钟内同稀释的DNA 混合。
保温时间过长会降低活性。
）注意：即使Lipofectamine 2000使用OPTI-MEMⅠ稀释，细胞也可以使用D-MEM培养。
如果D-MEM做为Lipofectamine 2000的稀释液，必须在5分钟内同稀释的DNA混合。
混合稀释的DNA（第2步）和稀释的Lipofectamine 2000（第3步）。
在室温保温20分钟。
LIPOFECTAMINE2000转染试剂转染步骤
LIPOFECTAMINE2000转染试剂转染步骤1.准备转染试剂：取出存储在-20℃的LIPOFECTAMINE2000试剂，并将其溶解在适量的去离子水或者PBS缓冲液中，制备转染试剂。
2. 根据实验需要确定转染的质粒DNA量和细胞数量。
一般来说，每个转染需要1-2ug的质粒DNA，细胞密度则根据细胞类型的不同而有所变化。
3.将准备好的转染试剂和质粒DNA混合在一起。
首先将质粒DNA加入到含有LIPOFECTAMINE2000的管中，并轻轻混合均匀，然后将混合物静置15-30分钟，使其形成脂质-DNA复合物。
4.在脂质-DNA复合物静置的同时，准备待转染的细胞。
将细胞用无血清培养基洗涤一次，并将其悬浮在新的无血清培养基中。
5.将静置好的脂质-DNA复合物滴加到细胞中。
将脂质-DNA复合物滴加到含有细胞的培养皿中，并轻轻摇晃培养皿，使复合物均匀分布在细胞表面。
6.将转染后的细胞培养在37℃的CO2培养箱中孵育。
具体培养时间视实验需求而定，一般来说，24-48小时后可以进行下一步实验。
7. 检测转染效率。
可以通过荧光显微镜观察细胞内是否表达了目的基因或荧光标记，也可以采用Western blotting或者RT-PCR等方法进行进一步的检测。
总的来说，LIPOFECTAMINE2000转染试剂转染步骤相对简单，但需要注意的是在每一步操作中都要轻柔并避免产生气泡，以确保脂质-DNA复合物可以均匀地与细胞相结合，从而提高转染效率。
同时，在实验过程中需要注意质粒DNA的质量和浓度，以及细胞的健康状态，这些因素都会对转染效果产生影响。
希望以上介绍对您有所帮助，祝您实验顺利。
LIPOFECTAMINE2000转染试剂转染步骤
LIPOFECTAMINE2000转染试剂转染步骤转染是一种将外源DNA或RNA导入到细胞内的技术，以研究基因功能、蛋白质表达、细胞信号转导等方面的问题。
LIPOFECTAMINE2000是一种常用的转染试剂，广泛应用于多种细胞系中。
以下是LIPOFECTAMINE2000转染试剂转染步骤的详细介绍。
一、细胞种植与处理准备1.1细胞传代：将细胞进行传代，以保证其在良好的状态下进行实验。
1.2细胞密度调整：将细胞于适宜培养皿中培养至60-80%的密度，以保证细胞的适宜转染。
1.3细胞处理准备：在转染前，将细胞用无酶EDTA或胰酶剥离并重新悬浮在适宜的培养基中，以保持细胞的完整性和适宜的状态。
二、试剂配制2.1DNA或RNA的制备：将外源DNA或RNA在无菌条件下制备，并使用纯化试剂进行纯化和浓缩。
2.2转染试剂配制：将冻干的LIPOFECTAMINE2000转染试剂通过加入合适的无菌水，稀释成适宜浓度的转染试剂。
三、转染操作3.1转染试剂与DNA/RNA的混合：将适量的LIPOFECTAMINE2000转染试剂与DNA或RNA混合在无菌的管中，轻轻混合均匀。
注意，避免过量试剂和核酸的使用，以减少细胞的毒性和副作用。
3.2孵育混合物：将混合物在常温条件下孵育15-30分钟，以促使脂质体与核酸形成稳定的复合体。
四、转染过程4.1转染试剂与细胞的混合：将混合物缓慢滴加到处理好的细胞培养基上，缓慢摇晃培养皿以使混合物均匀分布。
4.2转染时间及培养条件：将细胞放置在转染液中，保持静止状态，同时将培养皿放回培养箱中，在37℃、5%CO2的恒温恒湿条件下进行转染。
转染时间需要根据细胞系和转染试剂的要求进行优化，一般为4-6小时。
4.3转染液的去除：将转染液小心去除，并将细胞用含有适宜抗生素或筛选剂的培养基洗涤一次，以去除残留的转染试剂。
五、细胞处理及分析5.1细胞培养：将细胞放回恒温恒湿培养箱中，用适宜培养基进行细胞的培养。
赛默飞lipo2000说明书
赛默飞lipo2000说明书产品概述：值得信赖的、简单的广谱转染试剂，适用于大多数细胞系。
转染；通常是指将核酸引入真核细胞，或者更具体地说，引入动物细胞中。
Invitrogen Lipofectamine 2000 转染试剂是一种多功能转染试剂，经证明可以将各种有效载荷有效地转染到各种贴壁和悬浮细胞系中。
研究人员将 Lipofectamine 2000 试剂用于质粒 DNA 转染以及基于 siRNA 和 shRNA 的基因敲除实验、基因表达研究。
使用 Lipofectamine 2000 试剂，您可实现：适用各种细胞系，转染效率极高，重组蛋白表达水平高，实验方案简单siRNA 和质粒 DNA 共转染性能出众、可靠，适合各种高通量应用Lipofectamine 2000 转染试剂的使用被更多出版物引用，远超其他转染试剂进行可靠的细胞转染：图 1.Lipofectamine 2000 试剂使用方案步骤概要。
Lipofectamine 2000 试剂以其出色的转染性能为蛋白表达、基因沉默和功能测定递送DNA 或 siRNA。
这种广谱试剂效率超高，实验方案简单，成功应用于各种细胞系，因此倍受欢迎（图 1）。
查看下列实验方案。
对于基因沉默，高效转染提供高水平的基因敲除，从而获得令人信服的结果Lipofectamine 2000 转染试剂能够有效转染 siRNA 和质粒 DNA，因此是共转染的极佳选择能够为自动化或机器人系统轻松创造转染条件，因而非常适合高通量工作高性能常见转染试剂：Lipofectamine 2000 转染试剂可有效处理所有常见细胞系（图 2）和多种难以转染的细胞系，可在含或不含血清的培养基中使用。
查看下面“相关资源”部分中的实验方案。
图 2.使用 Lipofectamine 2000 试剂进行转染后的高水平 GFP 表达。
Lipofectamine 试剂的认可度：Lipofectamine 2000 试剂于 1999 年上市，此后引用该试剂的出版物数量稳步上升，该产品仍然是被引用次数最多的在售转染试剂之一（图 3）。
lip2000转染说明书
4. 哺乳动物细胞siRNA转染4.1 转染方法：将制备好的siRNA、siRNA表达载体或表达框架转导至真核细胞中的方法主要有以下几种：磷酸钙共沉淀；电穿孔法；DEAE-葡聚糖和polybrene；机械法；阳离子脂质体试剂。
目前用的最多的是阳离子脂质体法。
4.1.1 磷酸钙共沉淀将氯化钙，RNA(或DNA)和磷酸缓冲液混合，沉淀形成包含DNA且极小的不溶的磷酸钙颗粒。
磷酸钙-DNA复合物粘附到细胞膜并通过胞饮进入目的细胞的细胞质。
沉淀物的大小和质量对于磷酸钙转染的成功至关重要。
在实验中使用的每种试剂都必须小心校准，保证质量，因为甚至偏离最优条件十分之一个pH都会导致磷酸钙转染的失败。
4.1.2 电穿孔法电穿孔通过将细胞暴露在短暂的高场强电脉冲中转导分子。
将细胞悬浮液置于电场中会诱导沿细胞膜的电压差异，据认为这种电压差异会导致细胞膜暂时穿孔。
电脉冲和场强的优化对于成功的转染非常重要，因为过高的场强和过长的电脉冲时间会不可逆地伤害细胞膜而裂解细胞。
一般，成功的电穿孔过程都伴随高水平（50%或更高）的毒性。
4.1.3 DEAE-葡聚糖和polybrene带正电的DEAE-葡聚糖或polybrene多聚体复合物和带负电的DNA分子使得DNA 可以结合在细胞表面。
通过使用DMSO或甘油获得的渗透休克将DNA复合体导入。
两种试剂都已成功用于转染。
DEAE-葡聚糖仅限于瞬时转染。
4.1.4 机械法转染技术也包括使用机械的方法，比如显微注射和基因枪（biolistic particle）。
显微注射使用一根细针头将DNA，RNA或蛋白直接转入细胞质或细胞核。
基因枪使用高压microprojectile将大分子导入细胞。
4.1.5 阳离子脂质体试剂在优化条件下将阳离子脂质体试剂加入水中时，其可以形成微小的（平均大小约100-400nm）单层脂质体。
这些脂质体带正电，可以靠静电作用结合到DNA的磷酸骨架上以及带负电的细胞膜表面。
转染技巧资源
以Invitrogen的Lipofectamine 2000为例，需要注意以下几点：
1、DNA的量：Lipofectamine 2000=1：2~3
2、细胞密度大约占培养板的80%左右，转染。
3、转染期间不要加抗生素，否则会导致细胞死亡。
步骤如下：以24孔培养板为例
1、转染前一天细胞换新的培养基
2、制备DNA-Lipofectamine 2000复合物，如下:
a、用50ul无血清培养基稀释DNA（0.8g），轻轻混匀；
b、Lipofectamine 2000使用前，轻轻混匀，用48ul无血清培养基稀释2ul Lipofectamine 2000，轻轻混匀，室温孵育5分钟；
c、将a+b的液体加在一起，轻轻混匀，室温孵育20分钟，使DNA-Lipofectamine 2000复合物形成；
3、将100ul DNA-Lipofectamine 2000复合物加入培养板中，轻轻前后摇匀；
4、放入37度孵箱中培养24~48h后，1：10传代，加入G418筛选。
加入G418的量最好设几个梯度或者转染前做MTT，找好G418对你所转细胞致死量的浓度。
5、等细胞在G418作用下，长满后冻存几支（保种）。
再克隆化培养：将细胞消化后计数50个细胞，加入22ml完全培养基中，混匀，分装在96孔板中（200ul/孔）。
第二天在显微镜下，寻找孔中有单个细胞的孔并做标记，等做标记的孔长满后，消化、转移到4孔或6孔培养板中，最后转移到培养瓶中培养，冻存，鉴定。
6、鉴定成功后，建议马上做后续实验，因为在培养过程或冻存中，转进去的基因容易从细胞中掉下来。
lipo2000转染操作步骤
Lipo2000 瞬时转染细胞步骤Stealth™ RNAi or siRNA Transfection以24孔板为例,其余规格得转染见表11 中板,细胞密度为30-50%适宜。
注意:根据转染后细胞检测时间长短决定细胞中板密度,如果转染后需要长时间后检测,则细胞中板密度适当降低,已避免细胞过度生长导致存活降低。
2 第二天(24-36小时后)每个孔转染方式如下:A 将20pmol siRNA溶于50ul Opti-mem无血清培养基中。
B 将1ul lipo2000溶于50ul Opti-mem无血清培养基中,混匀室温放置5min。
C 将A B两管混合,放置20min。
3 转染期间,将24孔板培养基换成无血清培养基,每孔400ul。
将C管mix加入24孔板对应孔中,4-6小时候换成有血清培养基。
Plasmid DNA TransfectionDNA(ug):lipo 2000(ul)=1:2-3转染时细胞密度越高,转染效率,表达效率也越高,并且可以降低细胞毒性。
1 中板。
贴壁细胞:0、5-2X105 cells/well,第二天待细胞密度达到70-80%时转染悬浮细胞:4-8X105 cells/well,中板后随即转染。
2 转染。
A 将0、8ug DNA溶于50ul Opti-mem无血清培养基中。
B 将2ul lipo2000溶于50ul Opti-mem无血清培养基中,混匀室温放置5min。
C 将A B两管混合,放置20min。
转染期间,将24孔板培养基换成无血清培养基,每孔400ul。
将C管mix加入24孔板对应孔中,4-6小时候换成有血清培养基。
Table 1、 Culture Shared reagents DNA transfection RNAi transfection*:中板密度根据不同细胞不同实验有所不同,这里仅提得数据仅供参考**:6孔板细胞质粒转染量1-2ug足以。
***:6cm dish细胞质粒转染量4-6ug足以。
转染步骤
使用Lipofectamine™2000转染Stealth™ RNA或者siRNA进入哺乳动物Lipofectamine™ 2000试剂是一项专利配方，用于高效转染Stealth™ RNA或者短的干扰RNA（siRNA）到哺乳动物细胞，以进行RNAi分析（1，2）。
该说明书提供了一般的指导以及使用Lipofectamine™ 2000转染Stealth™ RNA或者siRNAj 进入哺乳动物细胞的步骤。
提供推荐的起始使用试剂剂量。
为了获得最佳的RNAi 实验结果，需要针对哺乳动物细胞系和目的基因优化转染的条件。
影响基因阻断水平（Gene Knockdown Level）的因素在RNAi实验中，有许多因素影响目的基因表达程度的降低（例如：基因阻断），包括：转染的一般性指导使用Lipofectamine™ 2000转染Stealth™ RNA或者siRNA进入哺乳动物细胞时，遵从以下一般性指导：1 为了获得最佳基因阻断结果，每一种细胞系转染Stealt h™ RNA或者siRNA的量都需要经过实验确定。
如果您是首次转染您的细胞系，推荐尝试使用几个Lipofectamine™ 2000的浓度，并在20-100nM范围内改变Stealth™ RNA或者siRNA的浓度，以确定达到最佳基因阻断水平所需要的条件。
高浓度的Stealth™ RNA或者siRNA可能具有细胞系依赖性。
注：我们推荐开始时使用40nM Stealth™ RNA或者siRNA。
2 在30-50％细胞汇合度时进行转染。
通常基因阻断的分析至少要在转染后24-72小时进行。
低密度转染细胞可以使转染和分析之间更长的间隙更长，从而使由于细胞过度生长造成的细胞活性损害减少到最低。
根据靶基因的特性，高密度转染的细胞可能更加适合条件的优化。
3 不要在转染时的培养基中加入抗生素，因为这将会降低细胞转染的效率和导致细胞死亡。
4 为了获得更好的结果，可以使用Opti-MEM® I 低血清培养基（目录号31958-062）在形成复合物前稀释Lipofectamine™ 2000和Stealth™ RNA或者siRNA寡聚物。
lip2000转染说明书
lip2000转染说明书4. 哺乳动物细胞siRNA转染4.1 转染⽅法：将制备好的siRNA、siRNA表达载体或表达框架转导⾄真核细胞中的⽅法主要有以下⼏种：磷酸钙共沉淀；电穿孔法；DEAE-葡聚糖和polybrene；机械法；阳离⼦脂质体试剂。
⽬前⽤的最多的是阳离⼦脂质体法。
4.1.1 磷酸钙共沉淀将氯化钙，RNA(或DNA)和磷酸缓冲液混合，沉淀形成包含DNA且极⼩的不溶的磷酸钙颗粒。
磷酸钙-DNA复合物粘附到细胞膜并通过胞饮进⼊⽬的细胞的细胞质。
沉淀物的⼤⼩和质量对于磷酸钙转染的成功⾄关重要。
在实验中使⽤的每种试剂都必须⼩⼼校准，保证质量，因为甚⾄偏离最优条件⼗分之⼀个pH都会导致磷酸钙转染的失败。
4.1.2 电穿孔法电穿孔通过将细胞暴露在短暂的⾼场强电脉冲中转导分⼦。
将细胞悬浮液置于电场中会诱导沿细胞膜的电压差异，据认为这种电压差异会导致细胞膜暂时穿孔。
电脉冲和场强的优化对于成功的转染⾮常重要，因为过⾼的场强和过长的电脉冲时间会不可逆地伤害细胞膜⽽裂解细胞。
⼀般，成功的电穿孔过程都伴随⾼⽔平（50%或更⾼）的毒性。
4.1.3 DEAE-葡聚糖和polybrene带正电的DEAE-葡聚糖或polybrene多聚体复合物和带负电的DNA分⼦使得DNA 可以结合在细胞表⾯。
通过使⽤DMSO或⽢油获得的渗透休克将DNA复合体导⼊。
两种试剂都已成功⽤于转染。
DEAE-葡聚糖仅限于瞬时转染。
4.1.4 机械法转染技术也包括使⽤机械的⽅法，⽐如显微注射和基因枪（biolistic particle）。
显微注射使⽤⼀根细针头将DNA，RNA或蛋⽩直接转⼊细胞质或细胞核。
基因枪使⽤⾼压microprojectile将⼤分⼦导⼊细胞。
4.1.5 阳离⼦脂质体试剂在优化条件下将阳离⼦脂质体试剂加⼊⽔中时，其可以形成微⼩的（平均⼤⼩约100-400nm）单层脂质体。
这些脂质体带正电，可以靠静电作⽤结合到DNA的磷酸⾻架上以及带负电的细胞膜表⾯。
lip2000转染说明书
4. 哺乳动物细胞siRNA转染4.1 转染方法：将制备好的siRNA、siRNA表达载体或表达框架转导至真核细胞中的方法主要有以下几种：磷酸钙共沉淀；电穿孔法；DEAE-葡聚糖和polybrene；机械法；阳离子脂质体试剂。
目前用的最多的是阳离子脂质体法。
4.1.1 磷酸钙共沉淀将氯化钙，RNA(或DNA)和磷酸缓冲液混合，沉淀形成包含DNA且极小的不溶的磷酸钙颗粒。
磷酸钙-DNA复合物粘附到细胞膜并通过胞饮进入目的细胞的细胞质。
沉淀物的大小和质量对于磷酸钙转染的成功至关重要。
在实验中使用的每种试剂都必须小心校准，保证质量，因为甚至偏离最优条件十分之一个pH都会导致磷酸钙转染的失败。
4.1.2 电穿孔法电穿孔通过将细胞暴露在短暂的高场强电脉冲中转导分子。
将细胞悬浮液置于电场中会诱导沿细胞膜的电压差异，据认为这种电压差异会导致细胞膜暂时穿孔。
电脉冲和场强的优化对于成功的转染非常重要，因为过高的场强和过长的电脉冲时间会不可逆地伤害细胞膜而裂解细胞。
一般，成功的电穿孔过程都伴随高水平（50%或更高）的毒性。
4.1.3 DEAE-葡聚糖和polybrene带正电的DEAE-葡聚糖或polybrene多聚体复合物和带负电的DNA分子使得DNA 可以结合在细胞表面。
通过使用DMSO或甘油获得的渗透休克将DNA复合体导入。
两种试剂都已成功用于转染。
DEAE-葡聚糖仅限于瞬时转染。
4.1.4 机械法转染技术也包括使用机械的方法，比如显微注射和基因枪（biolistic particle）。
显微注射使用一根细针头将DNA，RNA或蛋白直接转入细胞质或细胞核。
基因枪使用高压microprojectile将大分子导入细胞。
4.1.5 阳离子脂质体试剂在优化条件下将阳离子脂质体试剂加入水中时，其可以形成微小的（平均大小约100-400nm）单层脂质体。
这些脂质体带正电，可以靠静电作用结合到DNA的磷酸骨架上以及带负电的细胞膜表面。
Lipofectamine2000细胞转染protocol
Lipofectamine2000细胞转染protocol1、预处理：转染前一天，换液，胰酶消化细胞并计数，25c㎡的培养瓶中长满细胞可达5×10^6/mL，取3-4×10^5细胞铺在2mL的培养基中（不含双抗含血清），使其在转染时密度为90-95%（张老师做法：在细胞传代时用1mL胰酶消化，再加入4mL培养基（不含双抗含血清）中和。
800rpm，离心5min，5Ml培养基（不含双抗含血清）吹散后计数，留取1mL继续培养，其余按所需分装到4个6孔板，没孔加培养基至2mL）。
2、质粒DNA配制：每孔2ug质粒DNA，用无血清双抗OPTI-MEN培养基稀释至250ul；多孔可批量配制。
质粒DNA配好后，涡旋，瞬离。
3、Lipofect配制：每孔5ul lipofect试剂，用OPTI-MEN培养基稀释至250ul温和混匀，温室放置5min；多孔可批量配制。
4、将稀释的质粒DNA和Lipofect，混合在一起（配制后30min内混合），室温保温20min，保证每孔总体积500ul。
溶液可能变浑浊，但不影响转染。
（DNA-Lipofect复合物室温下6小时内保持稳定）。
5、将前天孵育的6孔板取出，处理细胞。
用移液管吸去上清（注意从边缘吸取，尽可能不要吸去贴附细胞）。
6、每孔2mLPBS清洗1遍，注意移液管要对着边缘加液，不可吹起细胞。
7、每孔用1mLDMEM清洗2遍。
8、每孔先加入OPTI-MEN0.9mL，再加500ulDNA-Lipofect复合物，摇动培养版，轻轻混匀（加质粒DNA时注意不要碰管壁）。
9、置入CO2培养箱，在6h后更换培养液，弃去上清，加入2mL不含双抗的DMEM。
10、再次置入CO2培养箱，72小时后，吸收上清至50mL离心管。
500转，10min 离心，取上清1mL/管（1.5mL进口EP管）分装标注，冻存-80°。
另取200ul 至2mLEP管检测HBsAg定量。
Lipofectamine 2000转染说明
CAT. NO. 11668-027 Size:CAT. NO. 11668-019 Size: ml4℃储存（不要冻存）说明：Lipofectamin TM2000是核酸（DNA或RNA）转染真核细胞的一个专用的试剂盒，其有如下优点：对各种细胞及细胞板（如96孔板）都有高的转染效率，在的细胞系数据库中有各种细胞转染成功的实例。
在含有或是不含有血清的培养基中，DNA- Lipofectamin TM 2000复合物能够直接加给细胞。
在转染之后不需要除去复合物以及添加或是更换培养液，但在培养4-6小时后需要除去复合物。
关于转染的一些重要建议：1.不要用即将要介绍的转染程序进行RNAi的转染实验。
在上有转染步骤，登陆后点击说明。
2.对于大多数细胞系，转染复合物中DNA(μg)与Lipofectamine TM 2000(μl)的比例在1：2到1：3之间，最好达到最优化的比例。
注意：在混合之前，我们建议用Opti-MEM I 低血清培养基（Cat: ）（reduced serum medium）稀释Lipofectamine TM2000和DNA.3.为了实现高的转染效率、高的目的基因表达水平以及低水平细胞毒效应，受体细胞最好达到高的浓度：在转染时，细胞的培养液的混浊度建议为90%-95%并最优化混浊度。
此外，在实验过程中保证相同的接种条件。
4.为避免细胞死亡，在培养基中不要加抗生素。
5.由于一些无血清复合物（如CD239、SFM II、VP-SFM）会抑制阳离子脂质体介导的转染，因此有必要检测一下无血清培养基和Lipofectamine TM 2000的相容性。
转染步骤（用于DNA）：按照如下步骤在24孔板中转染哺乳动物细胞。
对于其它种类细胞板请参照转染量度标准。
步骤中均按照一个细胞孔的量给出质量和体积。
1.贴壁细胞：转染的前一天，在500μl无抗生素培养基中接种×105个细胞，以保证在转染时候细胞的混浊度达到90%-95%。
(完整版)LIPOFECTAMINE 2000转染试剂转染步骤
LIPOFECTAMINE 2000转染试剂转染步骤24孔板贴壁细胞的瞬时或稳定转染实验步骤：(在生长培养基中直接加入复合物)1。
转染前一天，胰酶消化细胞并计数,将细胞转至24孔板，控制密度使其在转染日密度接近90％.细胞铺板在0。
5ml含血清，不含抗生素的正常生长的培养基中。
2.对于每孔细胞,使用50μl OPTI—MEMⅠ培养基稀释1μl-3μl LIPOFECTAMINE 2000试剂。
温柔混匀LIPOFECTAMINE 2000,室温温浴5分钟（在5-25分钟内同稀释的DNA混合.保温时间过长会降低活性。
可以批量制备。
）注意：即使LIPOFECTAMINE 2000使用OPTI—MEMⅠ稀释,细胞也可以使用D-MEM培养. 3。
对于每孔细胞，使用50μl无血清培养基（如OPTI—MEMⅠ培养基)稀释0。
8μg-1.0μg DNA。
多孔操作可以批量制备。
4。
混合稀释的DNA（由第3步）和稀释的LIPOFECTAMINE 2000(由第2步).在室温保温20分钟。
注意:溶液可能会混浊,但不会影响转染。
复合物可以在室温保持6小时稳定.5。
直接将复合物（100μl）加入到每孔中，前后（或左右）摇动培养板,轻轻混匀.注意：如果在无血清条件下转染,使用含血清的正常生长培养基进行细胞铺板。
在加入复合物前移去生长培养基，替换为0.2ml无血清培养基。
6.在37℃，5％的CO2中保温18—48小时，无须去掉复合物或更换培养基或者在4—5小时后更换生长培养基也不会降低转染活性。
7.在细胞中加入复合物18—72小时后，分析细胞抽提物或进行原位细胞染色，检测报告基因活性。
这依赖于细胞类型和启动子活性.对稳定表达，在开始转染一天后将细胞传代至新鲜培养基中（1:10），两天后加入筛选抗生素。
进行稳定表达需要数天或数周.。
Lipofectamine 2000转染说明
LipofectamineTM 2000之吉白夕凡创作CAT. NO. 11668019 Size: 1.5 ml4℃储存（不要冻存）说明：LipofectaminTM 2000是核酸（DNA或RNA）转染真核细胞的一个专用的试剂盒，其有如下优点：●对各种细胞及细胞板（如96孔板）都有高的转染效率，在 的细胞系数据库中有各种细胞转染成功的实例。
●在含有或是不含有血清的培养基中，DNALipofectaminTM 2000复合物能够直接加给细胞。
●在转染之后不需要除去复合物以及添加或是更换培养液，但在培养46小时后需要除去复合物。
关于转染的一些重要建议：1.不要用即将要介绍的转染程序进行RNAi的转染实验。
在/rnai上有转染步调，登陆后点击说明。
2.对于大多数细胞系，转染复合物中DNA(μg)与LipofectamineTM 2000(μl)的比例在1：2到1：3之间，最好达到最优化的比例。
注意：在混合之前，我们建议用OptiMEM I 低血清培养基（Cat: NO.31985062）（reducedserum medium）稀释LipofectamineTM 2000和DNA.3.为了实现高的转染效率、高的目的基因表达水平以及低水平细胞毒效应，受体细胞最好达到高的浓度：在转染时，细胞的培养液的混浊度建议为90%95%并最优化混浊度。
此外，在实验过程中包管相同的接种条件。
4.为防止细胞死亡，在培养基中不要加抗生素。
5.由于一些无血清复合物（如CD239、SFM II、VPSFM）会抑制阳离子脂质体介导的转染，因此有需要检测一下无血清培养基和LipofectamineTM 2000的相容性。
转染步调（用于DNA）：依照如下步调在24孔板中转染哺乳动物细胞。
对于其它种类细胞板请参照转染量度尺度。
步调中均依照一个细胞孔的量给出质量和体积。
1.贴壁细胞：转染的前一天，在500μl无抗生素培养基中接种0.52×105个细胞，以包管在转染时候细胞的混浊度达到90%95%。
lipo2000转染操作步骤
Lipo2000 瞬时转染细胞步骤Stealth? RNAi or siRNA Transfection以24孔板为例，其余规格的转染见表11 中板，细胞密度为30-50%适宜。
注意：根据转染后细胞检测时间长短决定细胞中板密度，如果转染后需要长时间后检测，则细胞中板密度适当降低，已避免细胞过度生长导致存活降低。
C 将A B两管混合，放置20min。
转染期间，将24孔板培养基换成无血清培养基，每孔400ul。
将C管mix加入24孔板对应孔中，4-6小时候换成有血清培养基。
Table 1. Culture Shared reagents DNA transfection RNAi transfection像293T细胞，因为半贴壁，换液容易导致细胞飘起来，所以中间不换液。
转染步骤及经验（精华）一、基础理论转染是将外源性基因导入细胞内的一种专门技术。
分类：物理介导方法：电穿孔法、显微注射和基因枪；化学介导方法：如经典的磷酸钙共沉淀法、脂质体转染方法、和多种阳离子物质介导的技术；生物介导方法：有较为原始的原生质体转染，和现在比较多见的各种病毒介导的转染技术。
理想细胞转染方法，应该具有转染效率高、细胞毒性小等优点。
病毒介导的转染技术，是目前转染效率最高的方法，同时具有细胞毒性很低的优势。
生素可以进入细胞。
这降低了细胞的活性，导致转染效率低。
所以，在转染培养基中不能使用抗生素，甚至在准备转染前进行细胞铺板时也要避免使用抗生素。
这样，在转染前也不必润洗细胞。
对于稳定转染，不要在选择性培养基中使用青霉素和链霉素，因为这些抗生素是GENETICIN选择性抗生素的竞争性抑制剂。
另外，为了保证无血清培养基中细胞的健康生长，使用比含血清培养基更少的抗生素量。
3.细胞状态这点非常重要，不要急于求成，一定要让细胞处于最佳的生长状态再做。
有文献说传代不要超过17代。
细胞复苏后的3代左右时细胞状态最好，不要用传了很多代的细胞去做，细胞的形态都会发生变化。
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LIPOFECTAMINE 2000转染试剂转染步骤
24孔板贴壁细胞的瞬时或稳定转染实验步骤：
（在生长培养基中直接加入复合物）
1.转染前一天，胰酶消化细胞并计数，将细胞转至24孔板，控制密度使其在转染日密度接近90%。
细胞铺板在0.5ml含血清，不含抗生素的正常生长的培养基中。
2.对于每孔细胞，使用50μl OPTI-MEMⅠ培养基稀释1μl-3μl LIPOFECTAMINE 2000试剂。
温柔混匀LIPOFECTAMINE 2000，室温温浴5分钟
（在5-25分钟内同稀释的DNA混合。
保温时间过长会降低活性。
可以批量制备。
）
注意：即使LIPOFECTAMINE 2000使用OPTI-MEMⅠ稀释，细胞也可以使用D-MEM培养。
3.对于每孔细胞，使用50μl无血清培养基（如OPTI-MEMⅠ培养基）稀释0.8μg-1.0μg DNA。
多孔操作可以批量制备。
4.混合稀释的DNA（由第3步）和稀释的LIPOFECTAMINE 2000（由第2步）。
在室温保温20分钟。
注意：溶液可能会混浊，但不会影响转染。
复合物可以在室温保持6小时稳定。
5.直接将复合物（100μl）加入到每孔中，前后（或左右）摇动培养板，轻轻混匀。
注意：如果在无血清条件下转染，使用含血清的正常生长培养基进行细胞铺板。
在加入复合物前移去生长培养基，替换为0.2ml无血清培养基。
6.在37℃，5％的CO2中保温18-48小时，无须去掉复合物或更换培养基或者在4-5小时后更换生长培养基也不会降低转染活性。
7.在细胞中加入复合物18-72小时后，分析细胞抽提物或进行原位细胞染色，检测报告基因活性。
这依赖于细胞类型和启动子活性。
对稳定表达，在开始转染一天后将细胞传代至新鲜培养基中（1：10），两天后加入筛选抗生素。
进行稳定表达需要数天或数周。