微生物-第四章 病毒

第四章病毒 P70-92第一节概述一、病毒的发现和研究历史二、病毒的定义与特点1、定义病毒是一类结构极其简单、能够自我复制并具有侵染性的独特非细胞生物体；是既具有化学大分子属性，又具有生物体基本特征，既具有细胞外的感染性颗粒形式，又具有细胞内的繁殖性基因形式的独特生物类群。

病毒分两个阶段（以两种形式）存在：胞外阶段：“毒粒”形式存在，可抵抗几乎所有酶的侵袭，但不能独立于活细胞增殖；胞内阶段：主要以正在复制的核酸形式存在，诱导宿主细胞合成病毒组分；真病毒：至少含核酸和蛋白质二种组分（主要介绍）类病毒：只含具侵染性的RNA组分亚病毒拟病毒：只含不具侵染性的RNA组分朊病毒：只含蛋白质组分2、特性（与细胞型微生物的区别）P711）个体微小，在电子显微镜下才能看见；2）不具有细胞结构，其主要成分为核酸和蛋白质，故称为“分子生物”3）一种病毒只含有DNA或RNA一种类型的核酸；4）绝对的细胞内寄生，在细胞外不能增殖：既无产能酶系，也无蛋白质和核酸合成酶系，只能利用宿主活细胞内现成的代谢系统合成自身的核酸和蛋白质；5）没有个体生长，不能像原核和真核生物一样进行细胞分裂，以核酸复制和蛋白质合成、然后装配的实现其大量繁殖；6）在离体条件下，以无生命的生物大分子状态存在，并保持其侵染性；7）对大多数抗生素不敏感，对干扰素敏感。

三、病毒的分类分类依据：核酸的特征、壳体的对称形式、有无包膜、宿主的种类、引起的疾病种类、复制和释放方式等。

根据宿主种类噬菌体（phage）真菌病毒（mygoviruses）或真菌噬菌体（mycophage）植物病毒（plant viruses）动物病毒（animal viruses）四、病毒的培养和纯化1、病毒的培养（1）标本的采集和处理（含足够量的活病毒，加入抗生素或离心、过滤除菌，研磨或超声波处理破碎细胞，标本经处理后立即接种或置-20℃以下或干冰保存）。

（2）标本的接种与感染表现实验宿主（动物、植物、细菌）、鸡胚或细胞培养A. 噬菌体的培养噬菌体细菌培养物培养液细菌培养液变清亮营养琼脂平板中的细菌培养物噬菌斑（plague）噬菌斑（plague）定义：将少量噬菌体与大量宿主细胞混合后，在合适条件下培养一定时间后，在平板表面布满宿主细胞的菌苔上，出现一个个肉眼可见的透明小圆斑。

（“负菌落”）双层平板法：可对样品中含有侵染性噬菌体粒子的数量（效价）估算下层固体培养基（2%琼脂）上层培养基（1%琼脂，45℃）+敏感菌（浓度高，对数期）+噬菌体样品保温培养约10h，对平板上噬菌斑进行计数。

B. 动物病毒的培养实验动物动物病毒鸡胚各种动物细胞培养致细胞病变效应（显微表现的改变）蚀斑或空斑（培养的细胞单层上形成）病毒包涵体（inclusion body）：定义：在某些感染病毒的宿主细胞质或细胞核内，出现光学显微镜下可见的大小、形状和数量不等的小体。

a病毒感染细胞内出现的特异性染色区域。

不同病毒所形成的包涵体在细胞质和细胞核内的定位不同；其染色性质也不同，即有的嗜酸性染料，有的嗜碱性染料；b大小、形态和数量亦有区别，所以包涵体在病毒的实验诊断具有一定的意义。

包涵体是病毒粒子的聚集体、病毒结构蛋白与感染有关蛋白质等病毒组分的聚集体。

多角体：昆虫细胞内形成的多角形包涵体，可作为病毒杀虫剂。

核型多角体病毒（NPV）：棉铃虫、粘虫桑毛虫昆虫质型多角体病毒（CPV）C. 植物病毒的培养局部坏死斑或称枯斑2、病毒纯化标准：保持感染性理化性质均一方法：蛋白质提纯方法（盐析、等电点沉淀、有机溶剂沉淀、凝胶层析、离子交换等）差速离心，密度梯度离心第二节病毒的形态结构与化学组成毒粒(virion)：又称“病毒粒子”（virus particle），指结构完整的、有感染性的单个病毒。

一、病毒的形态结构1、毒粒的形状和大小大小：nm，电镜下观察形状：球形或拟球形（大多数动物病毒）；杆状（植物病毒和昆虫病毒）；复杂形状：蝌蚪状（大肠杆菌T偶数噬菌体）弹状（狂犬病毒）、砖块状（痘病毒）、丝状（大肠杆菌f1、fd、M13噬菌体）等2. 病毒的结构和衣壳（capsid）的对称性（1）病毒毒粒的结构基本构造：核衣壳（nucleocapsid）核心（core）：DNA或RNA衣壳（capsid）：蛋白质非基本构造：包膜（envelope）：脂蛋白或类脂糖蛋白刺突裸露毒粒（naked virion）：仅由核衣壳构成有包膜的病毒（2）衣壳（capsid）的结构大量壳体蛋白质亚基通过次级键、按对称形式、有规律地排列而成。

螺旋对称衣壳）代表：TMV衣壳结构二十面体对称衣壳代表：腺病毒复合对称衣壳头部：二十面体对称代表：大肠杆菌T偶数噬菌体尾部：螺旋对称二、病毒（毒粒）的化学组成核酸基本组成蛋白质脂类糖类1、病毒的核酸一种病毒的毒粒只含有一种核酸：DNA或是RNA；病毒核酸类型多样。

ss DNA四种基本类型 ds DNAss RNAds RNA正链RNA（plus strand RNA）：若病毒的ssRNA可以作为mRNA直接翻译，则规定为+RNA；负链RNA（minus strand RNA）：若病毒的ssRNA序列与其mRNA互补，则规定为-RNA。

小DNA病毒的基因组为单链DNA，如φX174，M13；大多数DNA病毒的基因组为双链DNA。

大多数RNA病毒基因组为单链RNA，少数病毒为双链RNA基因组，它们均为分段基因组。

2、病毒的蛋白质非结构蛋白（病毒基因组编码，在病毒复制中产生并具有一定功能，但并不结合于毒粒中）结构蛋白（构成一个形态成熟的有感染性的病毒粒所必需的蛋白质）衣壳蛋白包膜蛋白存在于病毒中的酶类（T4噬菌体的溶菌酶，逆转录酶流感病毒刺突中的唾液酸苷酶）第三节病毒的增殖（主要介绍T4噬菌体）潜伏期：不同病毒的潜伏期长短不同，噬菌体以分钟计；动物病毒和植物病毒以小时或天计。

裂解量：噬菌体的裂解量一般为几十到上百个；植物病毒和动物病毒可达数百至上万个。

一部生长曲线：以适量的病毒接种于标准培养的高浓度的敏感细胞，待病毒吸附后，离心除去未吸附的病毒，或以抗病毒抗血清处理病毒—细胞培养物以建立同步感染，然后继续培养并定时取样测定培养物中的病毒效价，并以感染时间为横坐标，病毒的感染效价为纵坐标，绘制出病毒特征性的繁殖曲线，即一步生长曲线。

一、一步生长曲线（one step growth curve）研究病毒复制的经典实验1、实验方法①将噬菌体和敏感细胞以1：10混合；②数分钟后，高倍稀释病毒-细胞培养物，或加入一定量的该噬菌体的抗血清（以除去未吸附的噬菌体，以建立同步感染）；③保温培养，定时取样测定培养物中的噬菌体效价；④以感染时间为横坐标，噬菌体的感染效价为纵坐标，绘制出定量描述烈性噬菌体生长规律的曲线；2、烈性噬菌体在宿主细胞中复制的不同阶段：①潜伏期（latent period）：该阶段无病毒粒子释放隐蔽期：无成熟的噬菌体粒子胞内积累期②裂解期（rise period）：宿主细胞迅速裂解，并大量释放侵染性病毒。

③平稳期（plateau period）：指受染细胞已全部裂解，此时不再有病毒粒子释放。

3、二个特征性数据：①潜伏期②裂解量：每个受染细胞所产生的子代病毒颗粒的平均数目。

裂解量=全部释放的子代病毒数目÷被感染的敏感细胞数目（其值等于稳定期病毒效价与潜伏期病毒效价之比）二、病毒的复制周期（replicative circle）T4噬菌体，5个阶段：1、吸附病毒吸附蛋白（viral attachment potein,VAP），亦称“反受体”：能特异性地识别细胞受体并与之结合的病毒表面的结构蛋白。

细胞受体：能被病毒吸附蛋白特异性地吸附并与之结合，介导病毒侵入的宿主细胞表面的成分。

其大多数是蛋白质。

2、侵入与脱壳区别：内裂解：宿主细胞内大量噬菌体分泌酶引起的细胞裂解，释放大量噬菌体。

自外裂解（lysis from without）：如果大量噬菌体在短时间内吸附于同一细胞上，使细胞壁产生许多小孔而引起细胞裂解。

3、病毒大分子的合成病毒复制的时序性主要表现为基因组转录的时间组织。

4、装配（4个独立的亚装配途径）5、释放T4：裂解细胞方式；丝杆噬菌体（如M13或fd）：以分泌方式第四节噬菌体 P77一、烈性噬菌体（virulent phage）定义：感染宿主细胞后能在细胞内正常复制并引起宿主细胞迅速裂解的噬菌体。

二、温和噬菌体（temperate phage）1、定义：感染宿主细胞后，噬菌体基因组长期存在于宿主细胞内（整合于宿主的基因组上或以质粒形成独立存在），并随宿主基因组的复制而同步复制，没有成熟噬菌体产生，不引起宿主细胞裂解的噬菌体。

这种噬菌体与宿主之间的关系称为溶源性（lysogeny）。

凡能引起溶源性的噬菌体称为温和噬菌体，其宿主称为溶源菌。

2、温和噬菌体的存在形式有3种：游离态：指成熟后被释放并有侵染性的游离噬菌体粒子整合态：已整合到宿主基因组上的噬菌体核酸，称为前噬菌体（prophage ）。

营养态：指前噬菌体经外界理化因子诱导后，脱离宿主核基因组而处于积极复制、合成和装配的状态3、λ噬菌体：了解最充分的一种温和噬菌体大肠杆菌K12为宿主；头部为二十面体，非收缩性长尾；线状dsDNA，具有12个碱基的粘性末端，进入宿主细胞后形成环状。

噬菌体是进入裂解循环还是整合到宿主染色体上形成溶源态，主要取决于CI 蛋白与Cro蛋白的合成及它们的调控作用。

三、溶源菌（lysogen或 lysogenic bacteria）表示：E. coli K12(λ) P821、定义：含有温和噬菌体的宿主细胞，称为溶源菌。

（或：在核基因组上整合有前噬菌体并能正常生长繁殖而不被裂解的宿主细胞。

）2、溶源性感染对细胞的影响：（1）免疫性（原噬菌体的同源噬菌体）（2）溶源转变(lysogenic conversion)：原噬菌体引起的溶源菌除免疫性以外的其他表形改变，包括细胞表面性质的改变和致病性转变。

第六节亚病毒一、类病毒（viroids）P891、定义：低相对分子质量的侵染性RNA、没有蛋白质外壳，亦不具编码的功能，在感染的细胞内利用宿主酶独立复制。

2、致病性：马铃薯纺锤形块茎病3、与其它病毒不同点：1）没有衣壳；2）闭合ssRNA (250-370bp)；3）碱基配对的杆状区与未配对的环状区相间排列（棒状闭合环状分子）4）不作mRNA指导蛋白质合成；能在宿主细胞内自我复制。

二、拟病毒（virusoids）P901、定义：一类包裹在真病毒粒子中的有缺陷的类病毒（基因组缺陷，必须依赖辅助病毒才能复制，但辅助病毒的复制不需其参与，与辅助病毒基因组无明显的同源性）卫星RNA：必须依赖辅助病毒进行复制的小分子ssRNA片段，它们被包装在辅助病毒的壳体中。