致病性大肠杆菌的分离鉴定及药敏试验 20140220

致病性大肠杆菌的分离鉴定及药敏试验
1.材料与方法
1.1实验材料
1.1.1器材设备：剪刀、镊子、手术刀、接种环、接种针、涂布棒、酒精灯、载玻片、盖玻片、染色缸、染色架、革兰氏染液、光学显微镜、香柏油、恒温培养箱、游标卡尺等。

1.1.2病料采集：根据临床症状、流行病学采集疑似发病未死猪或刚死亡猪只的肝脏、脾脏、心脏、肺脏、大肠、排泄物等并冷藏运输于3h内送至实验室，待检。

1.1.3培养基与试剂：普通营养琼脂、麦康凯琼脂、伊红美蓝琼脂、微量生化反应管、药敏片、青霉素等抗生素。

1.2试验方法
1.2.1细菌的形态学检查：触片镜检，用镊子夹取待检病料一端，再用灭菌过的剪刀剪出一个切面，将新鲜的切面在干净的载玻片上轻触几下，载玻片自然干燥后进行瑞氏染色或美兰染色并镜检。

可初步判断待检病料中是否含有细菌。

触片也可以是排泄物悬浮液或研磨后的组织液，注意，为避免细胞碎片影响观察，涂片或触片时一定要均匀、薄。

1.2.2分离培养：将手术刀灼烧趁热在待检病料表面烫一下，以杀灭其表面杂菌；用无菌剪刀在烫面剪出一个小口，用灭菌过的接种环从其切面伸入并旋转勾取组织，用分区划线的方法接种于普通营养琼脂培养基、麦康凯培养基和伊红美蓝培养基上；或将组织研磨后用灭菌
生理盐水或灭菌PBS液稀释，再用接种环勾取悬浮液使用分区划线的方法接种于普通营养琼脂培养基、麦康凯培养基和伊红美蓝培养基上，置37℃恒温箱培养18-24h后观察菌落形态。

在普通营养琼脂培养基上长出灰白色光滑圆形菌落，麦康凯培养基上长出粉红色或砖红色光滑圆形菌落，在伊红美蓝培养基上长出紫黑色并有金属光泽的光滑圆形菌落。

注：麦康凯培养基和伊红美蓝培养基为鉴别培养基。

1.2.3培养物革兰氏染色：用接种环取一滴灭菌生理盐水于载玻片上→用接种环挑去麦康凯培养基上单个中等大小的红色菌落于生理盐水中混匀→均匀涂布成直径约为1cm的薄层→那载玻片在酒精灯上方30-40cm处干燥→使用酒精灯外焰固定→滴加一滴草酸结晶紫1min→水洗→加革兰氏碘液2-3min→水洗→95%酒精脱色0.5-1min →水洗→滴加石炭酸复红0.5-1min，用滤纸吸干，油镜镜检。

1.2.4培养物的纯培养：在1.2.2步骤中无菌勾取可疑菌落使用分区划线的方法接种于普通营养琼脂平板上，将平板倒置于37℃恒温箱中培养18-24h，重复2-3遍。

1.2.5生化试验：（1）糖发酵实验：将待检细菌纯培养物分别接种于五糖发酵管（葡乳麦甘蔗），37℃培养18-24h。

（2）M.R实验：将待检细菌纯培养物接种于葡萄糖蛋白胨水培养基，37℃培养48h。

（3）H2S实验：将待检细菌纯培养物接种于三铁糖试管斜面培养基上（穿刺接种），37℃培养18-24h，观察并记录结果。

1.2.6致病性实验：将上述已经经过鉴定的大肠杆菌纯培养物用灭菌的生理盐水洗下并混匀，取健康小鼠3只，两只作为对照，实验组小
鼠腹腔注射2ml细菌悬浮液，对照组分别注射无菌生理盐水和标准阳性菌液。

观察并记录结果。

注：对于我们实验室来讲，实验进行到1.2.5步骤细菌就已经鉴别出来，1.2.6步骤是为了验证鉴别出来的细菌是否为导致猪只发病的致病菌。

1.2.7药敏试验：用灭菌的涂布棒无菌操作蘸取纯培养细菌的菌落并均匀接种于普通营养琼脂培养基上，用眼科镊无菌操作贴药敏片每个药敏片应当做2-3个重复，药敏片之间的中心距离不小于24mm，药敏片与培养皿边缘距离不小于15mm，药敏片贴好后用镊子压实，贴好药敏片的平皿倒置于37℃温箱培养18-24h后观察并记录结果。

2.结果与分析
2.1细菌形态染色结果：涂片镜检发现视野中存在中等大小的杆状形态的菌体，这一现象为接下来的分离培养做了基础。

培养物经过革兰氏染色后镜检发现视野中均为红色的中小杆菌，两端钝圆，无芽孢，两端着色较深。

符合大肠杆菌的形态特征。

2.2细菌的培养性状：实验发现待检菌在普通营养琼脂培养基上长出灰白色、湿润、圆形光滑的菌落；在麦康凯培养基上长出粉红色或砖红色菌落；在伊红美蓝培养基上长出紫黑色并带有金属光泽的菌落。

符合大肠杆菌的培养特性。

2.3生化实验结果：待检菌培养物可分解葡萄糖产酸产气，还可以分解乳糖、麦芽糖、甘露醇；MR实验阳性（在葡萄糖蛋白胨水培养基内滴加甲基红试剂变红）；H2S实验阴性（三铁糖试管斜面培养基上没有变黑没有沉淀）。

均符合大肠杆菌的生化特性证实分离菌为大肠
杆菌。

2.4药敏试验结果：由于市场上滥用抗生素情况严重，大肠杆菌已对大部分抗生素产生耐药，分离的大肠杆菌具体对哪些药物敏感还需实际操作判断结果。

附：上述实验中涉及的培养基原料、微量生化反应管、试剂等可查阅杭州天和微生物实际有限公司官网。