蛋白质谷氨酰胺酶的重组表达与发酵条件优化

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㊀2021Vol.47No.3(Total 423)
DOI:10.13995/ki.11-1802/ts.026006
引用格式:李静竹,胡梦君,张建华.蛋白质谷氨酰胺酶的重组表达与发酵条件优化[J].食品与发酵工业,2021,47(3):294-301.
LI Jingzhu,HU Mengjun,ZHANG Jianhua.Recombinant expression of protein-glutaminase and optimization of fermentation conditions[J].Food and Fermentation Industries,2021,47(3):294-301.
蛋白质谷氨酰胺酶的重组表达与发酵条件优化
李静竹,胡梦君,张建华∗
(上海交通大学农业与生物学院,上海,200240)
摘㊀要㊀蛋白质谷氨酰胺酶(protein-glutaminase ,PG )对植物蛋白具有高效的脱酰胺作用,可提高蛋白的溶解度,进而改善其起泡性㊁凝胶性等功能性质,在植物性食品中有巨大的应用前景㊂但由于原始菌株解脘金黄杆菌PG 产量低,需异源重组表达以提高产量㊂将PG 基因重组到质粒pHT43,采用强组成型启动子P 43替换pHT43的诱导型启动子P grac ,并将重组质粒转化至大肠杆菌BL 21(DE3)菌株,获得表达菌株pHT43:pro-mPG (P 43)/BL 21(DE3)㊂将发酵16h 的重组菌超声破碎,菌体上清液中含有带前导肽的PG ,经镍柱纯化㊁脱盐及浓缩后,用0.3mg /mL 的胰蛋白酶酶切,得到成熟的PG ㊂SDS-PAGE 显示PG 消化前后分子量分别约为38kDa 和20kDa ,West-
ern-blot 结果表明两者均能与his-tag 抗体结合显色㊂成熟PG 的酶活力为0.250U /mL ,酶反应的最适条件为45ħ㊁pH 6.5㊂发酵条件优化后的最佳产酶培养基配方为:4g /L 谷氨酰胺,4g /L 蔗糖,1g /L 酵母提取物,8g /L 酵母浸粉,2g /L 胰蛋白胨,10g /L NaCl ,3g /L CaCl 2㊂37ħ㊁pH 6.5条件下发酵16h ,最终酶活力提高至0.761U /mL ㊂
关键词㊀蛋白质谷氨酰胺酶;启动子;重组表达;酶活力;发酵条件优化
第一作者:硕士研究生(张建华副研究员为通讯作者,E mail:zhangjh@)
收稿日期:2020-12-02
㊀㊀植物蛋白相较动物蛋白有较多的营养素和更少的卡路里,因此近年来以植物蛋白为原料的相关食品深受健康人士的推崇[1]㊂然而核桃㊁杏仁等植物蛋白饮品在加工过程中易受pH 和化学添加剂等因素
的影响,从而出现不同程度的分层㊁絮凝㊁沉淀等现象[2]㊂尽管在偏酸性液态食品中pH 与植物蛋白的pI 接近是诱因之一[3],但其主要原因是大多数植物蛋白含有大量的谷氨酰胺残基和天冬酰胺残基,易形成氢键使得蛋白质聚集沉淀[4],进而影响蛋白的乳化性㊁气泡性和凝胶性等功能性质,降低产品品质[5]㊂为有效解决植物蛋白生产加工中的上述难题,一般采用脱酰胺的方法对植物蛋白进行处理㊂
目前,工业上广泛采用酸碱湿热法和酶法对植物蛋白进行脱酰胺处理㊂酸法处理常会涉及高温,易引起蛋白质的水解,从而产生不良风味,影响产品品质㊂酶法处理可以有效脱去大豆蛋白和燕麦蛋白等植物蛋白的谷氨酰胺残基上的氨基,提高蛋白的溶解度㊂常用的酶有胰凝乳蛋白酶[6]㊁转谷氨酰胺酶[7]和肽谷氨酰胺酶等,但这些酶有一定的局限性,如转谷氨酰胺转氨酶底物专一性不强[8],肽谷氨酰胺酶对大分子蛋白质作用甚微[9]㊂因此,专一性强和底物特
异性好的蛋白质谷氨酰氨酶(protein-glutaminase,PG)引起了越来越多的关注㊂
PG 最初是在2001年被日本学者YAMIGHCHI
等[10]从土壤中的解脘金黄杆菌发酵液分离得到㊂PG 一般以含有信号肽的前体形式表达,需经酶切为分子量约20kDa 的成熟酶分子后才有活性[11]㊂研究发现PG 对羟基苯氧基-谷氨酰胺-甘氨酸(Cbz-Gln-Gly)和酪蛋白等底物有脱酰胺活性[10],且不会造成蛋白质的水解,底物专一性很强,安全有效㊂PG
对米谷蛋白[11-12]㊁燕麦蛋白[13]等均有良好的脱酰胺作用,且处理后其起泡性㊁凝胶性和溶解度等功能性质均得到一定改善㊂目前PG 已作为国家批准的食品添加剂,但其生产菌解脘金黄杆菌发酵液中PG 的酶活力仅为0.258U /mL [10],难以工业应用,因此提高菌株产PG 的能力非常重要㊂
对PG 重组表达已有诸多研究,KIKUCHI 等[14]
置换PG 信号肽,构建谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum )pPK4:pro-mPG 表达体系,表达的带前导肽(leader peptide,pro)的PG 经丝氨酸蛋白酶酶切后成功获得成熟肽(mature peptide,mPG);汪正华等[15]通过重叠延伸PCR 法合成PG 的全长基因,构建
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㊀BL 21/pET32a(+):mPG 表达体系,经诱导后得到以包涵体的形式表达的mPG,再经变性㊁复性处理后测得该mPG 的酶活力为0.371U /mL㊂以上研究构建的菌株或需IPTG 诱导表达,或产酶量不高,无法达到商业化生产的要求㊂因此,构建可以较高效表达此酶且无需诱导剂的表达体系尤为重要㊂
本文以大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭质粒pHT43为表达载体,并将其诱导型启动子P grac 替换为强组成型启动子P 43[17-18],构建重组质粒pHT43:pro-mPG (P 43),将其转化至BL 21(DE3)[19]中,实现pro-mPG 的胞内可溶性表达㊂采用胰蛋白酶对pro-mPG 酶切,
获得具有一定酶活力的成熟mPG㊂通过培养基配方和培养条件优化,进一步提高酶活㊂
1㊀材料与方法
1.1㊀材料与试剂
大肠杆菌Top 10,BL 21(DE3)为本实验室保藏;质粒pHT43,淼灵生物有限公司;pHT43:pro-mPG (P 43)为本实验构建㊂
胰蛋白胨㊁酵母提取物㊁琼脂糖㊁氨苄西林,日本
OXIDE 公司;UNIQ-10质粒提取试剂盒㊁胶回收试剂盒㊁丙烯酰胺㊁3-Truecolor 预染蛋白Marker㊁限制性内切酶Kpn I 和Sma I㊁T4连接酶㊁脱脂奶粉㊁10ˑTBST㊁异丙基-β-D 巯基半乳糖苷,上海生物工程有限公司;MixPCR㊁核酸染料㊁200bp Marker 购自TaKara;His-
tag 单克隆抗体㊁羊抗鼠抗体㊁ECL 显色发光试剂盒,上海翊圣生物有限公司;其他培养基及有机㊁无机试剂均为国产分析纯㊂1.2㊀仪器与设备
电子天平,瑞士Mettler Toledo 公司;超纯水系统,美国Mili-Q 公司;高压灭菌锅,日本Tomy 公司;恒温培养摇床,深圳市显控自动化技术有限公司;微量台式离心机,德国Eppendorf 公司;超声波细胞破碎仪,SON-ICS 公司;超微量分光光度NanoDrop 2000c,美国Thermo Forma 公司;PCR 仪,Bio-Rad Laboratory;微波炉,韩国LG 公司;酶标仪,TECAN;电泳仪,Bio-Rad Laboratory;转膜仪,Bio-Rad Laboratory;显影仪,ChemiDoc XRS +㊂1.3㊀方法
1.3.1㊀PG 基因的片段合成设计及其表达载体的构建利用pHT43构建表达质粒㊂选用强组成型启动
子P 43替换pHT43上的原有的启动子P grac [20],P 43序列后紧接着pHT43中自带的核糖体结合位点(ribo-
somebinding site,RBS)和信号肽S amyQ 序列,其后为编
码PG 的前导肽和成熟肽序列(Genbank:AB046594),并在成熟肽N 端添加6个组氨酸,片段全长1359bp,由上海派森诺基因科技公司人工合成㊂选择质粒上的Kpn I 和Sma I 作为酶切位点,将合成的目的片段与被Kpn I 和Sma I 酶切的pHT43通过T4连接酶连接,构建重组质粒pHT43:pro-mPG(P 43)㊂双酶切及酶连接体系参照韦雪芳等[21]的方法㊂
1.3.2㊀PG 基因的克隆及其质粒酶切鉴定
将重组质粒pHT43:pro-mPG (P 43)及pHT43空
载分别转化至E.coli Top 10感受态细胞中,加入600μL 的LB 液体培养基,在37ħ㊁200r /min 培养1h㊂取出复苏的Top 10感受态细胞并接种于含100μg /mL 氨苄西林的5mL LB 液体培养基中,37ħ过夜培养㊂次日提取质粒并进行酶切验证㊂1.3.3㊀PG 基因重组表达菌E.coli BL 21的转化及其
阳性转化子的鉴定
将重组质粒和空载分别转化至E.coli BL 21(DE3)感受态细胞中,转化方法与培养条件同1.3.2㊂将复苏液均匀涂布于含100μg /mL 氨苄西林的LB 平板上,37ħ过夜培养㊂次日挑取平板上的单菌落转接至1mL LB(含100μg /mL 氨苄西林)液体培养基中,37ħ㊁200r /min 培养12h㊂取500μL 加热煮沸15min,作为DNA 模板进行PCR 扩增检测㊂利用生物软件oligo 设计上下游引物,分别为F2499:5 -CTTTCAGCCGACT CAAACATCA-3 ;R3013:5 -GTA-AGGTATAAACTTTTCAGTTGCAGA-3 ㊂
PCR 反应体系为:菌液DNA 模板1μL,上下游
引物各1μL,Mix master 12.5μL,加无菌水补足至25μL㊂扩增反应条件:94ħ预变性2min,95ħ变性15s,60ħ退火30s,72ħ延伸30s,共30个循环,
72ħ延伸5min㊂将目的条带切胶回收并测序㊂测序完全正确的阳转子-80ħ保存备用㊂1.3.4㊀E.coli BL 21阳转子的诱导表达与发酵液超
声处理
将重组菌和空载菌株在LB 平板上划线活化㊂挑取单菌落,接种于4mL 含100μg /mL 氨苄西林的LB 液体培养基,在37ħ㊁200r /min 过夜培养㊂以
5%接种量将上述两种菌液分别转接至LB 液体培养基中(100μg /mL 氨苄西林),于37ħ㊁200r /min 摇床培养至OD 600为0.8左右开始计时,分别取上述菌株培养4㊁8㊁24h 的菌液各1mL,4ħ㊁10000r /min
离心2min,弃去上清,用1ˑPBS(pH 7.2)缓冲液洗涤菌体沉淀2次㊂再加入500μL 的1ˑPBS 充分重
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悬菌体,将其置于冰上进行超声破碎(功率为40%,10s /10次)㊂超声后菌液于4ħ㊁8000r /min 离心1min,沉淀用1ˑPBS 溶解㊂采用Nanodrop 测定重组
菌的超声破碎全菌液㊁上清液及沉淀的蛋白浓度㊂1.3.5㊀E.coli BL 21阳转子的SDS-PAGE 分析、镍柱
纯化以及Western blot 验证
将蛋白样品浓度调整为5~6mg /mL,与4ˑSDS 蛋白上样缓冲液按体积比3ʒ1混合㊁煮沸,进行SDS-PAGE 凝胶电泳:设置恒压80V,待样品中的溴酚蓝到达浓缩胶与分离胶的界线时,将电压调至120V㊂
采用NTA-Ni 柱对蛋白样品进行纯化,采用不同浓度的咪唑溶液(20㊁50㊁100㊁250mmol /L)分步洗脱,间接取样进行SDS-PAGE 分析,收集含有单一目的蛋白的洗脱液进行脱盐,用1ˑPBS(pH 7.2)缓冲液替换洗脱液中的咪唑,浓缩后通过BCA 法测定其蛋白浓度㊂参照陈俊等[22]的方法对未经考马斯亮蓝染色的PAGE 胶进行湿法转膜,恒流116mA 条件下电转40min㊂Western-blot 相关操作参照HU 等[23]的方法,采用ECL 显色发光试剂盒对膜进行孵育,显影仪自动曝光1min,观察免疫印迹结果㊂
1.3.6㊀酶活测定条件确定以及酶学性质分析
含前导肽的PG 先用胰蛋白酶消化,消化试验采用何灿等[24]的方法进行适当修改,具体如下:配制不同质量浓度的胰蛋白酶稀释液(0.03㊁0.1㊁0.3㊁0.9㊁2.7mg /mL),与纯化后的pro-mPG 按1ʒ10混匀,消化不同时间(0~50min,每间隔10min),进行SDS-
PAGE 分析和酶活力测定㊂根据SDS-PAGE 条带灰度分析和酶活力测定结果确定胰蛋白酶的最佳消化时间㊂
酶活力测定方法在汪正华等[15]的基础上进行部分调整,将消化后的酶液与底物反应不同时间(0~30min,每间隔5min),进行靛酚显色,确定消化酶液与底物的最佳反应时间㊂根据酶活力结果,选择以100μL 酶液,用0.03mg /mL 胰蛋白消化10min,底物反应时间20min 为酶活测定条件㊂
对纯化的PG 进行酶学性质分析,分别在不同pH(3.5~9.5)和不同温度(25~70ħ)下,将mPG 孵育60min 后测定酶活力,探究PG 的最适酶反应条件㊂
1.3.7㊀优化培养基配方和发酵产酶条件
以添加质量分数0.4%的谷氨酰胺[25]的LB 培
养基为基础,选用不同碳源(葡萄糖㊁蔗糖㊁麦芽糖㊁淀粉㊁山梨糖醇㊁甘油)替代LB 中80%酵母提取物,不同氮源(牛肉浸膏㊁蛋白胨㊁酵母浸粉㊁大豆蛋白胨㊁安琪酵母粉㊁甘氨酸)替代LB 中80%胰蛋白胨,分别添加质量分数为0.1%和0.3%的金属离子(K +㊁Mg 2+㊁Ni 2+㊁Mn 2+㊁Cu 2+㊁Fe 2+㊁Ca 2+)[26],探究不同碳㊁氮源和金属离子对产酶的影响,并选择不同的温度(25ħ㊁30ħ㊁33ħ㊁37ħ㊁40ħ)和不同的初始pH(5.0㊁5.5㊁6.0㊁6.5㊁7.0)分别培养重组菌,探究培养条件对产酶的影响㊂1.3.8㊀数据分析
酶的纯化及发酵条件优化等实验均进行3次重
复,采用prism 统计软件进行数据处理及显著性分析㊂
2㊀结果与分析
2.1㊀目的片段的合成与重组载体的构建
由于产PG 的解脘金黄杆菌与大肠BL 21亲缘关系较远,为实现PG 在BL 21中的有效表达,本研究不使用编码PG 自身的信号肽[20,27],而是利用大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭质粒pHT43及其本身含有的信号肽S
amyQ 构建重组质粒㊂图1,为本研究构建的重组质粒pHT43:pro-mPG(P 43)㊂
图1㊀pHT43:pro-mPG(P 43)重组质粒图
Fig.1㊀Schematic diagram of recombinant plasmidpHT43:pro-mPG(P 43)
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㊀1.2㊀PG 基因的克隆菌和重组表达菌的转化及鉴定
将重组质粒转化至Top 10感受态细胞中,对质粒进行双酶切验证㊂结果如图2-a 所示,泳道1为重组质粒经Mlu I 酶切后得到的片段,其片段大小与预期的7288bp 和1827bp 相符㊂将疑似阳性的重组质粒进行测序,与目的序列一致性为100%,证明成功构建了PG 基因的克隆菌株㊂同理,提取Top 10克隆菌株的重组质粒转化至BL 21(DE3)感受态细胞中,采用F2499/R3013引物对BL 21转化子进行菌液PCR 验证㊂结果如图2-b 所示,阳性转化子PCR 产物与阳性对照(重组质粒)条带大小一致,在1300bp
附近有单一的特异性扩增条带,将PCR 产物胶回收后并进行测序验证,经BLAST 比对结果显示一致性为100%,证实PG 重组表达菌株构建成功㊂1.3㊀pro-mPG 的表达、纯化及Western blot 验证
对菌体破碎上清液进行SDS-PAGE 分析,结果如图3-a 所示
,35kDa 上方出现一条带,与DNAMAN 软件预测的pro-mPG 分子量37.54kDa 相符,可能为成a-pHT43:pro-mPG(P 43)质粒酶切b-阳性菌液PCR 扩增产物
a:M-1kbMarker,1-酶切后质粒,2-未切割质粒;b:M-100bp Marker,
1-阳性转化子PCR 产物,2-阳性对照
图2㊀pHT43:pro-mPG(P 43)克隆及PCR 验证
Fig.2㊀Verification ofpHT43:pro-mPG (P 43)clone and
recombinant transformant by PCR
功表达的可溶性pro-mPG㊂镍柱纯化的结果如图3-b 所示
,结果表明,蛋白可以被镍柱吸附,在20mM 的咪唑下可被洗脱,且能够与鼠抗组氨酸标签抗体特异性识别并产生免疫印迹,因此确认该蛋白为pro-mPG㊂
a-pro-mPG 的表达及纯化b-Western blot 验证图
a:1㊁2-重组菌全菌液,3-重组菌1的超声破碎上清液,4~7-20mmol /L 咪唑洗脱液,8㊁9-250mmol /L 咪唑洗脱液;
b:1㊁3-20mmol /L 咪唑洗脱液,2㊁4-250mmol /L 咪唑洗脱液,M-蛋白Marker
图3㊀菌体破碎液及镍柱洗脱液中pro-mPG 的SDS-PAGE 图及Western blot 验证
Fig.3㊀SDS-PAGE image and Western blot verification of pro-mPG in the disrupted cells and elute from nickel column
1.4㊀pro-mPG 的消化及其产物分析
pro-mPG 经胰蛋白酶消化的结果如图4-a 显示,
消化后出现两条低分子量(约20㊁30kDa)的条带,与刘英杰报道的一致[28]㊂在消化时间0~50min 内,随着反应的进行,pro-mPG 逐渐由37.54kDa 降解到20kDa,且20kDa 处的条带在消化10min 后灰度最
深㊂该蛋白疑似为切割掉前导肽后的成熟PG 酶(mPG)㊂酶活力测定结果表明消化10min 的PG 酶活力最高为0.250U /mL㊂消化10min 后的酶液经镍柱纯化,得到单一条带(图4-b),Western-blot 分析发现该条带同样能与鼠抗His-tag 产生特异性的免疫印迹反应,确认为mPG㊂1.5㊀mPG 的酶学性质分析
图5-a 为不同pH 条件下测定纯化mPG 酶活力的结果,发现pH 6.5时,酶活最高㊂不同温度下的PG 酶活力结果如图5-b 所示,在45ħ条件下出现最高酶活力㊂且随着温度的升高,酶活力呈现先上升后下降的趋势,在70ħ时几乎丧失活性㊂2.6㊀PG 发酵条件优化
2.6.1㊀不同碳源、氮源对工程菌产酶的影响
对照组采用粗酶液进行测定,酶活力为0.417
U /mL,比纯化的PG 测得的酶活力高,这可能由于背景值较高以及谷氨酰胺添加的影响所致㊂由6-a 可知,以蔗糖和麦芽糖为主要碳源的培养基产酶高于对照组,其中蔗糖组差异显著(P <0.05),最高酶活为0.490U /mL,这可能是由于菌株对不同碳源的利
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a-胰蛋白酶消化pro-mPGb-消化产物Western blot分析
a:M-蛋白Marker;1~6-胰蛋白酶消化不同时间(0㊁10㊁20㊁30㊁40㊁50min)的pro-mPG;b:M-蛋白Marker1㊁2-镍柱纯化
后的mPG的SDS-PAGE图,3㊁4-Western blot分析
图4㊀胰蛋白酶水解的pro-mPG的SDS-PAGE图及Western blot分析
Fig.
4㊀SDS-PAGE image and Western blot verification analysis of trypsin hydrolysis of pro-mPG
图5㊀pH和温度对PG酶活力的影响
Fig.5㊀Effect of pH and temperature on PG activity
用度不同导致产pro-mPG的量有差异㊂而以麦芽糖和淀粉为主要碳源的培养基对pro-mPG酶活力的影响不大,山梨糖醇和甘油对PG的酶活力的抑制作用显著(P<0.05)㊂
在以蔗糖为主要碳源的培养基中,考察不同氮源对产酶的影响,结果如图6-b所示,酵母浸粉对重组菌产酶影响显著(P<0.05),酶活在碳源优化的基础上进一步提高至0.603U/mL㊂
2.6.2㊀金属离子对工程菌产酶的影响
在上述最佳碳源和氮源的基础上,考察不同浓度的金属离子对产酶的影响㊂结果如图7所示,添加Mn2+和Ca2+均对产酶有促进作用(P<0.05),而K+㊁Ni2+和Mg2+对产酶的影响不显著(P>0.
05), Cu2+和Fe2+的添加反而抑制了产酶㊂添加质量分数
a-碳源;b-氮源
图6㊀不同碳源和氮源对工程菌产酶的影响Fig.6㊀Effect of different carbon and nitrogen sources on the pro-mPG production from engineering bacteria 0.3%的Ca2+培养基最高酶活力为0.760U/
mL,与对照组相比,提高了0.157U/mL左右㊂
图7㊀不同金属添加量对工程菌产酶的影响Fig.7㊀Effect of different metal additions on the production
of pro-mPG from engineering bacteria
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㊀2.6.3㊀培养条件对pro-mPG 酶活力的影响
25ħ㊁30ħ㊁33ħ㊁37ħ㊁40ħ条件下工程菌产
PG 的酶活力分别为0.333U /mL㊁0.481U /mL㊁0.623
U /mL㊁0.764U /mL㊁0.640U /mL,37ħ为最适温度,如图8-a 所示㊂不同pH 条件下测得的酶活力差异不
显著(P >0.05),说明pH 对工程菌产PG 影响较小,
如图8-b 所示㊂
图8㊀温度和pH 对工程菌产酶的影响
Fig.8㊀Effect of temperature and pH on the production
of pro-mPG from engineering bacteria
3㊀讨论
目前PG 已作为国家批准的食品添加剂[29],其生
产来源仍然依赖解脘金黄杆菌
[16]
,但是该原始菌发
酵产酶量少,限制了该酶的工业化生产应用㊂现有的工程菌过表达PG 的研究,大多采用IPTG 作为诱导剂
[30]
㊂但IPTG 价格较昂贵,且对微生物和人体有一
定毒性,故减少或避免其使用对食品酶的表达有重要的现实意义㊂因此,本研究采用强组成型启动子P 43代替pHT43本身的诱导型启动子P grac ,利用细菌的群体感应表达PG,不使用IPTG,提高了目标酶在食
品中应用的安全性㊂
由于PG 在植物蛋白脱酰胺方面有良好的应用前景,近年来,重组表达PG 的相关研究已有一些进展,如汪正华等
[15]
诱导表达了包涵体形式的mPG,再
经变性㊁复性处理后测得酶活力为0.371U /mL㊂刘英杰[28]构建的pHT43-pp /Bacillus subtilis 168和pHT43-pp /Bacillus subtilis DB403,在IPTG 诱导下均可
表达mPG,最终在浓缩发酵胞外液中获得约0.700U /mL 的酶活,其菌株产酶量为36.84mg /mL㊂本文构建的表达菌株菌体上清液纯化后质量浓度为181.68μg /mL,根据浓缩倍数计算出发酵液中酶量为47.19mg /mL,比上述报道高10.39mg /mL㊂尽管产酶量有一定的提高,但未实现胞外的可溶性表达㊂另外,本实验表达的酶仍需要通过外界酶进行加工,才可以释放有活性的PG㊂因此,建立高效表达PG 的体系是实现PG 大规模商业化应用的基础,也是今后的研究重点㊂
4㊀结论
本实验采用强组成型启动子P 43与pro-mPG 序列
连接成功构建重组质粒pHT43:pro-mPG (P 43),通过化学转化法成功获得BL 21阳性工程菌,经PCR 和基因测序验证正确㊂经Western blot 验证和酶活性测定,证明菌体在发酵生长对数后期可通过群体感应自诱导表达目的蛋白,避免了IPTG 的使用㊂通过对LB 培养基中碳源㊁氮源的替换以及金属离子的添加,将酶活力由0.417U /mL 提高至0.761U /mL㊂酶学性质研究表明,酶最适反应条件为45ħ㊁pH 6.5㊂
参
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Recombinant expression of protein-glutaminase and optimization
of fermentation conditions
LI Jingzhu,HU Mengjun,ZHANG Jianhua ∗
(School of Agriculture and Biology,Shanghai Jiao Tong University,Shanghai 200240,China)
ABSTRACT ㊀Protein-glutaminase (PG)has an efficient deamidation effect on plant proteins,which can increase the solubility of the protein and improve its functional properties,such as foaming and gelation.Therefore,it has huge application prospects in the industrial production of plant foods.However,due to the low fermentation yield of the original strain of PG-producing Chryseobacterium proteolytic-
um ,heterologous recombinant expression is required to increase its yield.In this study,the PG gene was recombined into the plasmid pHT43,and the inducible promoter P grac of pHT43was replaced by a strong constitutive promoter P 43.Then,the recombinant plasmid was transformed into E.coli BL 21(DE3)strain to obtain an expression strain-pHT43:pro-mPG (P 43)/BL 21(DE3).After cultured for 16hours,the cells were collected and ultrasonically disrupted to release PG with a leader peptide.After centrifugation,the supernatant was purified by a nickel column,after desalination and concentration,the suspension was digested with 0.3mg /mL trypsin to be catalyzed into a mature PG.The results of SDS-PAGE showed that the molecular weights of PG before and after trypsin hydrolysis were 38kDa and 20kDa,respectively.Western-blot results showed that both of them could bind to his-tag antibody.The enzyme activity of mature PG was
0.250U /mL,and the optimal conditions for enzyme activity determination were 45ħand pH 6.5.The final optimized fermentation con-ditions were as follows:4g /L glutamine,4g /L sucrose,1g /L yeast extract,8g /L yeast extract,2g /L tryptone,10g /L sodium chlo-ride,3g /L calcium chloride.Under above fermentation conditions for 16h at 37ħand pH 6.5,a final enzyme activity of 0.761U /mL was achieved.
Key words ㊀protein-glutaminase;promoter;recombinant expression;enzyme activity;optimization of fermentation conditions。