感受态细胞的制备和质粒的转化
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感受态细胞的制备和质粒的转化
感受态细胞的制备
• 实验目的：学习感受态细胞的制备过程 • 实验材料：大肠杆菌菌株DH5或DH10B • 实验原理：电转化法是利用瞬间高压在细胞上打
孔，因而需用冰冷的超纯水多次洗涤处于对数生 长前期的细胞，以使细胞悬浮液中应含有尽量少 的导电离子。转化效率为109～1010 转化子/µg DNA； • 对于热激法，是利用冰冷的CaCl2/TSS处理对数 生长期的细胞，可以诱导其产生短暂的“感受 态”，易于摄取外源DNA。转化效率为106 ～ 107转化子/µg DNA。
击；
• 立即加1ml SOC培养基到转化杯中重悬细胞； • 将细胞转入合适的培养管中37ºC培养1小时； • 吸取合适体积的菌液涂布已倒好的选择培养基平板； • 37ºC培养过夜，观察结果。
• 附注：
• 利用氨苄青霉素抗性筛选转化子时，用转 化细胞铺平板的密度要低（90mm平板上不 得超过105个菌落），同时37℃培养不应超 过20小时，具氨苄青霉素抗性的转化体可 将－内酰胺酶分泌到培养基中，迅速灭活 菌落周围的抗生素，从而导致对氨苄青霉 素敏感的卫星菌落的出现。
打匀，使细胞重新悬浮； • 细胞悬浮液可立即用于转化实验或添加冷冻保护剂（15% - 20%甘油）
后超低温冷冻贮存备用（－70℃）。
电转化法制备大肠杆菌感受态细胞的实 验步骤
– 前夜接种受体菌（DH5或DH10B），挑取单菌落于LB培养基中37℃摇 床培养过夜；
– 取2ml过夜培养物转接于200ml LB培养基中，在37℃摇床上剧烈振荡培养 至OD600＝0.6（约2.5-3小时）；
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
质粒的转化及转化子的鉴定
• 质粒的转化是指将质粒或以它为载体构建 的重组子导入细菌的过程。将连接产物转 化到感受态细胞中，实现重组克隆的增殖， 便于后续分子操作。可以采用多种方法筛 选和鉴定目的克隆。
• 实验目的：掌握热激法或电转化法转化大肠杆菌感受态细 胞及转化子的鉴定方法。
• 实验材料：外源片段与载体的连接产物；大肠杆菌感受态 细胞。
• 质粒电转化大肠杆菌感受态细胞操作步骤 • 制备选择性培养基平板：在融化的250ml LA培养基中250 l Amp
（100mg/ml），250 l X-gal (20mg/ml)，25 l IPTG (200mg/ml)， 混匀后倒入灭菌培养皿中；
• 取出制备好的感受态细胞，放在冰上融化； • 每管感受态细胞加入1l连接产物，用移液器轻轻吸打均匀，置冰上； • 电转化仪选择1800V作为输出电压； • 将要转化的混合物加入预冷的1 mm的电转化杯中，立即按下按纽电
• 取出3管制备好的感受态细胞，放在冰上融化； • 每100 ul感受态细胞加入约20ng质粒DNA，3管分别加连接产物、标
准超螺旋质粒DNA（阳性对照）及不加入任何DNA（阴性对照），用 移液器轻轻吸打均匀，在冰上放置30分钟； • 热击：将离心管放置42℃水浴，热击90秒，注意：勿摇动离心管； • 冰镇：快速将离心管转移至冰浴，放置1－2分钟； • 复苏：每管加400 ul LB培养基，在37℃摇床温和摇动温育45分钟， 使细菌复苏； • 布皿：取适当体积均匀涂布于含有、抗生素（Amp）的LA平板； • 培养：倒置培养皿，于37℃培养12－16小时 即可观察菌落
细胞重新悬浮； – 4℃下3000g冷冻离心5分钟 – 加入20ul冰冷10%的甘油，用移液器轻轻上下吸动打匀，使细胞重新悬浮； – 立即使用或迅速置于-70ºC超低温保存。
附注
• 影响感受态细胞转化效率的因素及实际操作过程中应注意的事项： • 细菌的生长状态：实验中应密切注视细菌的生长状态和密度，尽量使
• 吸取1.5ml培养好的菌液至1.5ml离心管中，在冰上冷却10分钟； • 4℃下3000 g冷冻离心5分钟； • 弃去上清，加入100ul预冷0.1M CaCl2溶液，用移液枪轻轻上下吸动
打匀，使细胞重新悬浮，在冰放置20分钟； • 4℃下3000 g冷冻离心5分钟； • 弃去上清，加入100ul预冷0.1M CaCl2溶液，用移液枪轻轻上下吸动
• （2）电转化法：外加于细胞膜上的电场造成细胞膜的不 稳定，形成电穿孔，不仅有利于离子和水进入细菌细胞， 也有利于孔DNA等大分子进入。同时DNA在电场中形成的 极性对于它运输进细胞也是非常重要的。
热激法转化实验步骤
• 制备选择性培养基平板：在融化的250ml LA培养基中250 ul Amp （100mg/ml），混匀后倒入灭菌培养皿中；
• 实验原理：（1）热激法：大肠杆菌在0℃ CaCl2低渗溶液 中，菌细胞膨胀成球形，转化混合物中的DNA形成抗 DNase的羟基－钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经42℃短 时间热冲击处理，促进细胞吸收DNA复合物，在丰富培养 基上生长数小时后，球状细胞复原并分裂增殖。在被转化 的细胞中，重组子基因得到表达，在选择性培养基平板上 可挑选所需的转化子。
用对数生长期的细胞（一般通过检测OD600来控制。DH5菌株 OD600为0.5时细胞密度是5×107/ml）； • 所有操作均应在无菌条件和冰上进行； • 经CaCl2处理的细胞，在低温条件下，一定的时间内转化率随时间的 推移而增加，24小时达到最高，之后转化率再下降（这是由于总的活 菌数随时间延长而减少造成的）； • 化合物及无机离子的影响：在Ca2+的基础上联合其他二价金属离子 （如Mn2+或Co2+）、DMSO或还原剂等物质处理细菌，可使转化效 率大大提高（100-1000倍）； • 所使用的器皿必须干净。迹量的去污剂或其它化学物质的存在可能大 大降低细菌的转化效率； • 质粒的大小及构型的影响：用于转化的应主要是超螺旋的DNA； • 一定范围内，转化效率与外源DNA的浓度呈正比；
– 将菌液迅速置于冰上。以下步骤务必在超净工作台和冰上操作 – 吸取1.5ml培养好的菌液至1.5ml离心管中，在冰上冷却10分钟； – 4℃下3000g冷冻离心5分钟； – 弃去上清，加入1500ul冰冷的10%甘油，用移液枪轻轻上下吸动打匀，
使细胞重新悬浮； – 4℃下3000g冷冻离心5分钟 – 弃去上清，加入750ul冰冷的10%甘油，用移液枪轻轻上下吸动打匀，使
CaCl2感受态细胞的制备实验步骤
• 前夜接种受体菌（DH5或DH10B），挑取单菌落于LB培养基中37℃ 摇床培养过夜（约16小时）；
• 取1ml过夜培养物转接于100ml LB培养基中，在37℃摇床上剧烈振荡 培养约2.5-3小时（250-300rpm）；
• 将0.1M CaCl2溶液置于冰上预冷；以下步骤需在超净工作台和冰上操 作
感受态细胞的制备
• 实验目的：学习感受态细胞的制备过程 • 实验材料：大肠杆菌菌株DH5或DH10B • 实验原理：电转化法是利用瞬间高压在细胞上打
孔，因而需用冰冷的超纯水多次洗涤处于对数生 长前期的细胞，以使细胞悬浮液中应含有尽量少 的导电离子。转化效率为109～1010 转化子/µg DNA； • 对于热激法，是利用冰冷的CaCl2/TSS处理对数 生长期的细胞，可以诱导其产生短暂的“感受 态”，易于摄取外源DNA。转化效率为106 ～ 107转化子/µg DNA。
击；
• 立即加1ml SOC培养基到转化杯中重悬细胞； • 将细胞转入合适的培养管中37ºC培养1小时； • 吸取合适体积的菌液涂布已倒好的选择培养基平板； • 37ºC培养过夜，观察结果。
• 附注：
• 利用氨苄青霉素抗性筛选转化子时，用转 化细胞铺平板的密度要低（90mm平板上不 得超过105个菌落），同时37℃培养不应超 过20小时，具氨苄青霉素抗性的转化体可 将－内酰胺酶分泌到培养基中，迅速灭活 菌落周围的抗生素，从而导致对氨苄青霉 素敏感的卫星菌落的出现。
打匀，使细胞重新悬浮； • 细胞悬浮液可立即用于转化实验或添加冷冻保护剂（15% - 20%甘油）
后超低温冷冻贮存备用（－70℃）。
电转化法制备大肠杆菌感受态细胞的实 验步骤
– 前夜接种受体菌（DH5或DH10B），挑取单菌落于LB培养基中37℃摇 床培养过夜；
– 取2ml过夜培养物转接于200ml LB培养基中，在37℃摇床上剧烈振荡培养 至OD600＝0.6（约2.5-3小时）；
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
质粒的转化及转化子的鉴定
• 质粒的转化是指将质粒或以它为载体构建 的重组子导入细菌的过程。将连接产物转 化到感受态细胞中，实现重组克隆的增殖， 便于后续分子操作。可以采用多种方法筛 选和鉴定目的克隆。
• 实验目的：掌握热激法或电转化法转化大肠杆菌感受态细 胞及转化子的鉴定方法。
• 实验材料：外源片段与载体的连接产物；大肠杆菌感受态 细胞。
• 质粒电转化大肠杆菌感受态细胞操作步骤 • 制备选择性培养基平板：在融化的250ml LA培养基中250 l Amp
（100mg/ml），250 l X-gal (20mg/ml)，25 l IPTG (200mg/ml)， 混匀后倒入灭菌培养皿中；
• 取出制备好的感受态细胞，放在冰上融化； • 每管感受态细胞加入1l连接产物，用移液器轻轻吸打均匀，置冰上； • 电转化仪选择1800V作为输出电压； • 将要转化的混合物加入预冷的1 mm的电转化杯中，立即按下按纽电
• 取出3管制备好的感受态细胞，放在冰上融化； • 每100 ul感受态细胞加入约20ng质粒DNA，3管分别加连接产物、标
准超螺旋质粒DNA（阳性对照）及不加入任何DNA（阴性对照），用 移液器轻轻吸打均匀，在冰上放置30分钟； • 热击：将离心管放置42℃水浴，热击90秒，注意：勿摇动离心管； • 冰镇：快速将离心管转移至冰浴，放置1－2分钟； • 复苏：每管加400 ul LB培养基，在37℃摇床温和摇动温育45分钟， 使细菌复苏； • 布皿：取适当体积均匀涂布于含有、抗生素（Amp）的LA平板； • 培养：倒置培养皿，于37℃培养12－16小时 即可观察菌落
细胞重新悬浮； – 4℃下3000g冷冻离心5分钟 – 加入20ul冰冷10%的甘油，用移液器轻轻上下吸动打匀，使细胞重新悬浮； – 立即使用或迅速置于-70ºC超低温保存。
附注
• 影响感受态细胞转化效率的因素及实际操作过程中应注意的事项： • 细菌的生长状态：实验中应密切注视细菌的生长状态和密度，尽量使
• 吸取1.5ml培养好的菌液至1.5ml离心管中，在冰上冷却10分钟； • 4℃下3000 g冷冻离心5分钟； • 弃去上清，加入100ul预冷0.1M CaCl2溶液，用移液枪轻轻上下吸动
打匀，使细胞重新悬浮，在冰放置20分钟； • 4℃下3000 g冷冻离心5分钟； • 弃去上清，加入100ul预冷0.1M CaCl2溶液，用移液枪轻轻上下吸动
• （2）电转化法：外加于细胞膜上的电场造成细胞膜的不 稳定，形成电穿孔，不仅有利于离子和水进入细菌细胞， 也有利于孔DNA等大分子进入。同时DNA在电场中形成的 极性对于它运输进细胞也是非常重要的。
热激法转化实验步骤
• 制备选择性培养基平板：在融化的250ml LA培养基中250 ul Amp （100mg/ml），混匀后倒入灭菌培养皿中；
• 实验原理：（1）热激法：大肠杆菌在0℃ CaCl2低渗溶液 中，菌细胞膨胀成球形，转化混合物中的DNA形成抗 DNase的羟基－钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经42℃短 时间热冲击处理，促进细胞吸收DNA复合物，在丰富培养 基上生长数小时后，球状细胞复原并分裂增殖。在被转化 的细胞中，重组子基因得到表达，在选择性培养基平板上 可挑选所需的转化子。
用对数生长期的细胞（一般通过检测OD600来控制。DH5菌株 OD600为0.5时细胞密度是5×107/ml）； • 所有操作均应在无菌条件和冰上进行； • 经CaCl2处理的细胞，在低温条件下，一定的时间内转化率随时间的 推移而增加，24小时达到最高，之后转化率再下降（这是由于总的活 菌数随时间延长而减少造成的）； • 化合物及无机离子的影响：在Ca2+的基础上联合其他二价金属离子 （如Mn2+或Co2+）、DMSO或还原剂等物质处理细菌，可使转化效 率大大提高（100-1000倍）； • 所使用的器皿必须干净。迹量的去污剂或其它化学物质的存在可能大 大降低细菌的转化效率； • 质粒的大小及构型的影响：用于转化的应主要是超螺旋的DNA； • 一定范围内，转化效率与外源DNA的浓度呈正比；
– 将菌液迅速置于冰上。以下步骤务必在超净工作台和冰上操作 – 吸取1.5ml培养好的菌液至1.5ml离心管中，在冰上冷却10分钟； – 4℃下3000g冷冻离心5分钟； – 弃去上清，加入1500ul冰冷的10%甘油，用移液枪轻轻上下吸动打匀，
使细胞重新悬浮； – 4℃下3000g冷冻离心5分钟 – 弃去上清，加入750ul冰冷的10%甘油，用移液枪轻轻上下吸动打匀，使
CaCl2感受态细胞的制备实验步骤
• 前夜接种受体菌（DH5或DH10B），挑取单菌落于LB培养基中37℃ 摇床培养过夜（约16小时）；
• 取1ml过夜培养物转接于100ml LB培养基中，在37℃摇床上剧烈振荡 培养约2.5-3小时（250-300rpm）；
• 将0.1M CaCl2溶液置于冰上预冷；以下步骤需在超净工作台和冰上操 作