细菌内毒素检查SOP(动态浊度法)

细菌内毒素检查SOP（动态浊度法）
1．目的
为规范细菌内毒素含量测定的操作，特制定本SOP。

2．范围
本SOP适用于细菌内毒素含量测定的操作。

3．定义
3.1.动态浊度法是检测反应混合物的浊度到达某一预先设定的吸光度所需要的反应时间，或是检测浊度增加速度的方法。

3.2.细菌内毒素国家标准品系自大肠埃希菌提取精制而成，用于标定、复核、仲裁鲎试剂灵敏度和标定细菌内毒素工作标准品的效价。

3.3.细菌内毒素工作标准品系以细菌内毒素国家标准品为基准标定其效价，用于试验中的鲎试剂灵敏度复核、干扰试验及各种阳性对照。

3.4.细菌内毒素检查用水系指内毒素含量小于0.015 EU/ml（用于凝胶法）或0.005 EU/ml （用于光度测定法）且对内毒素试验无干扰作用的灭菌注射用水。

4．职责
4.1.QC负责本规程的起草、修订、培训及执行。

4.2.QA、QC组长、质量管理部经理负责本规程的审核。

4.3.质量负责人/质量受权人负责本规程的批准。

4.4.QA负责本规程执行的监督。

5．引用标准
《中华人民共和国药典》2020年版三部。

6．材料
6.1.仪器设备
细菌内毒素测定仪、漩涡混合器、干烤箱
6.2.试剂及溶液
6.2.1.鲎试剂
6.2.2.细菌内毒素工作标准品：国家标准品或经过国家标准品标定的工作标准品。

6.2.3.细菌内毒素检查用水：内毒素含量应小于0.005EU/ml。

6.3.使用的器具
移液器、无热原稀释管和反应管、无热原枪头。

7．流程图
无
8．程序
8.1.原理
细菌内毒素能激活鲎试剂(TAL)中的酶系统，使凝固酶原变成凝固酶，进而凝固酶再激活其中的凝固蛋白原变成凝固蛋白，呈现凝胶反应，动态浊度法是检测反应混合物的浊度到达某一预先设定的吸光度所需要的反应时间，计算内毒素浓度与反应时间关系的双对数标准曲线，利用标准曲线对供试品的内毒素含量进行定量测定。

8.2.试验前准备
8.2.1.采样管用硅胶塞塞口，经180℃干烤2小时，除内毒素备用。

8.2.2.试验用稀释管、反应管等玻璃器皿应在试验前1～2天内包好，经180℃干烤2
小时除内毒素,72小时内可用。

8.3.供试品稀释
8.3.1.取出供试品溶解，或平衡至室温。

8.3.2.供试品摇匀后用内毒素检查用水按10倍系列或倍倍系列稀释。

8.3.3.鲎试剂溶解：鲎试剂安瓶经75%酒精棉拭擦，砂轮锯开，按规定规格加入细菌内
毒素检查用水溶解，然后分装于反应管内，每管分装0.1ml。

8.4.标准曲线的测定
将细菌内毒素工作标准品按标示量细菌内毒素检查用水溶解，在漩涡混合器上混匀15分钟，然后制成2.0EU/ml 、0.5 EU/ml、0.125 EU/ml、0.03125EU/ml四个浓度的内毒素标
准溶液，每稀释一步均应在漩涡混合器上混匀。

分别取0.1ml加入均含有0.1ml鲎试剂的反应管中，每一个内毒素浓度做2管平行。

同样取0.1ml细菌内毒素检查用水加入含有0.1ml 鲎试剂的反应管中作为阴性对照，2管平行。

将反应管中溶液轻轻混匀后，放入细菌内毒素测定仪中，开始检测。

8.5.供试品的测定
根据供试品的细菌内毒素限值计算出供试品的最大有效稀释倍数和干扰试验中供试品的稀释倍数，并据此对供试品进行稀释。

一组为不含内毒素标准溶液的供试品稀释系列，一组为含有内毒素标准溶液（0.5EU/ml）的供试品稀释系列，作为供试品干扰试验中添加的细菌内毒素浓度。

稀释好的供试品均取0.1ml加入含有0.1ml鲎试剂的反应管中，每个供试品浓度做2管平行。

两平行管的变异系数CV≤10%。

将反应管中溶液轻轻混匀后，放入细菌内毒素测定仪中，开始检测。

内毒素的回收率要在50%～200%的范围内。

8.6.结果判定
8.6.1.标准曲线：分别计算平行管反应时间，将各稀释标准的反应时间的对数与相应的
内毒素浓度进行线性回归处理，求出其回归方程。

标准曲线的相关系数(r)的绝对值应大于或等于0.980，试验方为有效。

否则须重新试验。

8.6.2.供试品细菌内毒素含量计算：分别计算平行管平均反应时间，带入回归方程，计
算出相应的值，本数值乘以相应的稀释倍数即为样品的细菌内毒素含量。

试验完毕后填写《细菌内毒素检查（动态浊度法）记录》。

8.7.合格标准
多糖原液：每1µg多糖细菌内毒素含量应不高于10EU；
多糖原液：每1µg多糖细菌内毒素含量应不高于10EU。

9．EHS
无
10．派生记录
无
11．相关文件
无
12．注意事项
12.1 阴性对照的反应时间应大于标准曲线最低浓度的反应时间。

12.2 标准曲线中最低内毒素浓度不得低于所用鲎试剂的标示检测限。

12.3 操作时应尽量避免周围空气的流动。

12.4 相邻浓度间稀释倍数不得大于10。