利用甲型流感病毒阳性临床标本制备质控品

利用甲型流感病毒阳性临床标本制备质控品
李瑜霞;石翰铂;余斐;郑书发;崔大伟;曹红翠
【摘要】目的制备一种能适用于甲型流感病毒核酸提取和PCR检测全过程的质控品.方法采用TRIzol试剂灭活高、中、低3种浓度的甲型流感病毒阳性的痰液标本,分析TRIzol试剂对检测结果的影响;放置于35℃以及反复冻融,评估灭活后标本的稳定性;并在不同实验室间采用不同试剂进行适用性评价.结果 TRIzol试剂对核酸检测无影响,处理后的高、中、低浓度标本反复冻融40次病毒浓度无明显降低,变异系数分别为1.26％、1.54％、1.54％,均低于试剂盒批内精密度.TRIzol试剂处理的标本在35℃环境保存40 d后高、中、低浓度变异系数分别为3.13％、
2.77％、2.20％,变异系数均低于试剂盒批间精密度.在不同单位采用不同试剂均能检测出高、中、低不同浓度质控品.结论采用TRIzol试剂灭活甲型流感病毒阳性标本制备的质控品在瓶间差、热稳定和长期保存时效等方面性能较优,可成为日后临床实验室开展甲型流感病毒核酸检测的理想质控品.
【期刊名称】《临床检验杂志》
【年(卷),期】2018(036)008
【总页数】3页(P634-636)
【关键词】甲型流感病毒;TRIzol;病毒灭活;质控品
【作者】李瑜霞;石翰铂;余斐;郑书发;崔大伟;曹红翠
【作者单位】浙江大学医学院附属第一医院检验科,杭州310003;浙江大学医学院附属第一医院浙江省肝胆胰肿瘤精准诊治研究重点实验室,杭州310003;浙江大学医学院附属第一医院检验科,杭州310003;浙江大学医学院附属第一医院检验科,杭
州310003;浙江大学医学院附属第一医院输血科,杭州310003;浙江大学医学院附
属第一医院传染病诊治协同创新中心,杭州310003
【正文语种】中文
【中图分类】R446
核酸检测技术是目前临床实验室检测流感病毒较常使用的方法，具有灵敏度高、特异性好等优点[1]，但检测样本中的抑制物、核酸提取过程中的残留试剂等可能会
影响PCR扩增的效率，造成结果的偏差，因此需要对检测全过程进行质量控制[2]。

但是，目前大部分流感病毒核酸检测试剂盒仅自带质粒阳性对照，不参与核酸提取步骤，从而无法对核酸检测全过程进行质量控制[3-4]，因此制备一种能全程监控
流感病毒核酸提取和扩增检测过程的与临床样本同基质的质控品非常重要。

近年来，TRIzol用于灭活病毒已成为国际标准方法[5]。

本研究拟通过TRIzol试剂对临床甲型流感病毒标本进行灭活处理，并评估TRIzol试剂灭活后标本的稳定性，以期制
备一种理想的甲型流感病毒质控品。

1 材料与方法
1.1 样本来源在2016—2017年间浙江大学医学院附属第一医院经上海之江生物
科技有限公司甲型流感病毒分型检测试剂盒检测结果为H1N1和H3N2阳性的样
本中，分别随机选择Ct值小于25(高浓度)、25<Ct值≤30(中浓度)和Ct值大于
30(低浓度)的痰液样本各5份，共30份样本。

1.2 主要仪器和试剂 ABI 7500型实时荧光定量PCR仪(美国ABI公司)。

核酸半自动提取试剂盒(磁珠法，上海之江生物科技公司)；3种甲型流感病毒检测试剂盒分
别购自上海之江生物科技公司、广州达安生物科技公司、江苏辉睿生物科技公司；TRIzol试剂(Invitrogen公司)。

1.3 方法
1.3.1 TRIzol对核酸检测影响的评估将选择的高、中、低浓度的30份样本各取400 μL，将取出的样本均分为2份，其中一份按照样本与TRIzol试剂体积比4∶1的比例加入TRIzol试剂，另一份按同等比例加入生理盐水，震荡混匀后静置10 min，并进行PCR检测，记录Ct值。

1.3.2 质控品制备按照高、中、低浓度不同，分别将浓度相近的10个样本各取1 mL进行混合，震荡混匀后按照样本与TRIzol试剂体积比4∶1的比例向3管混合液中分别加入TRIzol试剂，震荡混匀，静置10 min，分别将样本分装40管(205 μL/管)。

1.3.3 核酸提取及荧光定量PCR检测核酸提取采用上海之江生物科技公司核酸半
自动提取试剂盒(磁珠法)，严格按照说明书进行操作；荧光定量PCR检测试剂盒
采用上海之江生物科技公司甲型流感病毒检测试剂盒，具体步骤参见试剂盒说明书。

当检测样本Ct值≤38时，结果判定为阳性；若样本Ct值>38且<40时，进行重复检测，若复检Ct值<38者，则判定为阳性，其余则均报告为阴性。

1.3.4 瓶间差评价从制备的高、中、低质控品中各随机取出10管，同时提取核酸
后进行PCR检测，记录Ct值，分析不同管间的差异。

1.3.5 长期保存时效评价从制备的高、中、低3组质控品中各随机取出10份，置于-20 ℃冰箱放置，每日全部拿出放置室温中，待其自然融化后平衡30 min，每
冻融4次取出1管提取核酸并进行PCR检测，记录Ct值，观察Ct值变化情况。

1.3.6 热稳定性评价从制备的高、中、低3组质控品中各随机取出10份，置于
35 ℃温箱放置，每隔4 d分别取1管提取核酸并进行PCR检测，记录Ct值，观察Ct值变化情况。

1.3.7 适用性评价从制备的高、中、低3组质控品中选择3份随机分发至浙江大
学医学院附属第四医院、湖州市中心医院和义乌市中心医院，各自采用广州达安生
物科技公司、上海之江生物科技公司和江苏辉睿生物科技公司的流感检测试剂分别进行核酸提取和PCR检测，记录Ct值，观察Ct值变化情况。

1.4 统计学分析用SPSS 18.0和Excel软件进行。

不同浓度临床样本分别经TRIzol和生理盐水稀释后Ct值之间的比较采用配对样本t检验，以P<0.05为差
异有统计学意义。

2 实验与结果
2.1 TRIzol对核酸检测影响的评价高、中、低3个浓度临床样本分别经TRIzol和生理盐水稀释后Ct值之间差异无统计学意义(t=0.705，P=0.490；t=0.108，
P=0.915；t=0.187，P=0.854)，表明TRIzol处理对核酸检测结果无影响。

见表1。

表1 TRIzol处理对核酸检测结果的影响分组Ct值(n=10)CV(%)高浓度
TRIzol21.56±0.331.53生理盐水21.67±0.351.62中浓度TRIzol27.17±0.331.21生理盐水27.15±0.371.36低浓度TRIzol32.41±0.431.33生理盐水
32.38±0.431.33
2.2 瓶间差评价高、中、低浓度变异系数分别为1.26%、0.99%、0.71%，见表2。

表2 不同浓度组样本管间差异评价结果组别Ct值(n=10)CV(%)高浓度组
21.35±0.271.26中浓度组27.14±0.270.99低浓度组32.35±0.230.71
2.3 长期保存时效评价不同浓度样本反复冻融40次之后，高浓度组、中浓度组和低浓度组变异系数分别为1.26%、1.54%和1.54%，绘制Ct值波动曲线，见图1。

2.4 热稳定性评价不同浓度样本放置35 ℃，40 d内每4 d检测1次，高浓度组、中浓度组、低浓度组变异系数分别为
3.13%、2.77%和2.20%，绘制Ct值波动曲线，见图2。

2.5 适用性评价在不同单位采用不同试剂均能检测出高、中、低不同浓度质控品，结果均一致，见表3。

图1 不同浓度组样本反复冻融Ct值变化
图2 不同浓度组样本35 ℃保存Ct值变化表3 不同试剂盒的适用性评价结果
组别检测试剂上海之江广州达安江苏辉睿高浓度组
22.08±0.3120.12±0.4023.69±0.37中浓度组
27.15±0.3725.09±0.3428.12±0.33低浓度组
32.36±0.4230.28±0.4233.18±0.39
3 讨论
在本研究中，我们发现采用TRIzol试剂稀释后不影响核酸检测的Ct值，证实TRIzol处理对核酸检测结果无影响，与李伟红[6]的研究结果一致。

本实验用TRIzol试剂对临床甲型流感病毒阳性样本进行灭活处理，然后对管间差
异进行比较，发现处理后的高、中、低浓度样本的变异系数分别为1.26%、
0.99%、0.71%，均低于该试剂盒批内精密度(1.57%)。

为进一步评价质控品热稳
定性，我们发现在反复冻融40次后，高、中、低浓度的样本均能检测出病毒核酸，而且Ct值变化较小，变异系数分别为1.26%、1.54%、1.54%，均低于该试剂盒
批内精密度(1.57%)，表明反复冻融对本质控品稳定性影响较小。

而在35 ℃环境
下放置40 d后，高、中、低3种浓度样本的变异系数分别为3.13%、2.77%、2.20%，均低于该试剂盒批间精密度(3.90%)。

说明在35 ℃环境长时间放置对质
控品无影响。

在本研究中，我们明确了经TRIzol试剂处理的临床样本对核酸检测结果无影响；
成功建立了采用TRIzol试剂稀释阳性样本制备的甲型流感病毒质控品，发现该质
控品在瓶间差、热稳定和长期保存时效等方面性能较优。

且通过适用性评价证实，该质控品适合在不同实验室对不同检测试剂盒进行质量控制。

此外，由于实验样本通过临床样本制备，其溶剂背景与日常样本极为贴近，制作简易，因此经TRIzol
试剂处理的临床样本有望成为日后临床实验室开展甲型流感病毒核酸检测的理想质
控品。

4参考文献
【相关文献】
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