31种石斛属植物及金石斛遗传多样性SRAP分析及DNA指纹图谱研究

31种石斛属植物及金石斛遗传多样性SRAP 分析及DNA指纹图谱研究
作者：张迎辉凡莉莉杜溶讫谢德金杨旺利陈礼光郑郁善
来源：《热带作物学报》2022年第10期
摘要：石斛屬（Dendrobium Sw.）为兰科（Orchidaceae）兰亚科（Subfam. Orchidoideae）植物，在我国有着广泛的分布与应用，多用于名贵中药材和观赏植物，具有较高的经济价值。

由于苛刻的生长条件加上过度的开发利用，导致野生石斛资源破坏严重，大部分种类已近枯竭，这也导致市场上出现的石斛种质混杂、真伪鉴定困难等问题亟待解决。

石斛属植物遗传多样性的研究和数字指纹图谱的建立，可以为石斛的品种鉴定与分类、良种选择与保护提供理论依据，对保护药用植物生物多样性也具有十分重要的意义。

以31种石斛属植物及金石斛（Flickingeria comata）为研究对象，应用SRAP-PCR分子标记技术对其开展遗传多样性分析并构建DNA指纹图谱。

结果表明：利用筛选出来的15对引物进行扩增，共扩增出264个位点，其中多态性位点为251个，平均每对引物扩增出16.73个多态性位点，多态比率达
95.08%，其中Me2-Em5、Me4-Em3、Me4-Em5、Me7-Em3、Me7-Ee7等5对引物的多态百分率均为100%，这些引物组合对石斛种类的鉴别效率较高；经过计算31种石斛属植物与金石斛间的观测等位基因数（N a）为1.784，有效等位基因数（N e）为1.430，Nei’s基因多样性指数（H）为0.202，Shannon’s信息指数（I）为0.386，石斛种间存在较高的遗传变异度与丰富的
遗传多样性水平；其遗传相似系数的变化范围为0.591～0.851，亲缘关系较近，当遗传相似性系数为0.660时，金石斛单独聚为一类，当遗传相似性系数为0.724时，可将31个石斛属植物进一步分为10组；构建DNA指纹图谱可单独鉴别出31种石斛属植物以及金石斛，为石斛遗传背景分析和快速鉴别石斛种类提供科学依据。

关键词：石斛属；SRAP标记；遗传多样性；DNA指纹图谱中图分类号：S567.239文献标识码：A
SRAP Analysis and DNA Fingerprinting of Genetic Diversity of 31 Species of Dendrobium and Flickingeria comata
ZHANG Yinghui FAN Lili DU Rongqi XIE Dejin YANG Wangli CHEN Liguang ZHENG Yushan
1.Fujian Vocational College of Agriculture， Fuzhou， Fujian 350007， China;
2. College of Forestry， Fujian Agriculture and Forestry University， Fuzhou， Fujian350002， China;
3. Forestry Bureau of Fu’an City，Fu’an， Fujian 355000， China
Abstract：Dendrobium Sw. belongs to the Orchidaceae （Subfam. Orchidoideae）， whichhas a wide distribution and application in China. Most are precious Chinese medicinal materials and ornamental plants with high economic values. Due to harsh growth conditions and excessive development and utilization， wild Dendrobium resources have been severely damaged， and most species have been nearly depleted， which also leadto problems such as mixed germplasm of Dendrobium in the market and difficulties in authenticity identification. The research on the genetic diversity of Dendrobium plants and the establishment of digital fingerprints can provide a theoretical basis for the identification and classification of Dendrobium species， the selection， and protection of fine varieties， and it is also of great significance to protect the biodiversity of
Dendrobium resources. Taking 31 species of Dendrobium and Flickingeria comata as the research objects， the genetic diversity was analyzed by the SRAP-PCR molecular marker technology and DNA fingerprints were constructed. 15 pairs of primers were used for amplification， and a total of 264 loci were amplified， including 251 polymorphic loci， and an average of 16.73 polymorphic loci with a 95.08% ratio were amplified for each pair of primers. The polymorphism percentage of 5 pairs of primers including Me2-Em5， Me4-Em3， Me4-Em5， Me7-Em3， Me7-Ee7 was100%，and the primer combinations had higher identification efficiency for Dendrobium species. After calculation， the number of observed alleles （N a） between 31 species of Dendrobium and F. comata was 1.784， the number of effective alleles （N e） was 1.430，the Nei’s gene diversity index （H） was 0.202，and Shannon’s information index （I） was 0.386， which showed there was a high degree of genetic variability and rich genetic diversity among Dendrobium species. The variation range of the genetic similarity coefficient was 0.591–0.851， and the genetic relationship was relatively close. When the genetic similarity coefficient was 0.66，Dendrobium couldbe clustered
into one group. When the genetic similarity coefficient was 0.724， 31 Dendrobium species couldbe divided into 10 groups. The DNA fingerprints constructed by three pairs of primers， including Me1-Em3， Me3-Em3， and Me1-Em6， couldidentify 31 species of Dendrobium and F.
comata independently， providing a scientific basis for the analysis of the genetic background and the rapid identification of D. species.
Keywords：Dendrobium; SRAP markers; genetic diversity; DNA fingerprint
DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2022.10.008
石斛属（Dendrobium）为兰科（Orchidaceae）植物最大的属之一，约含1000个种，其中我国分布有74个种，2个变种[1]。

虽然我国石斛属资源在世界上的占有率较低，但因其具有较高的观赏价值[2-3]和药用价值[4-5]，在资源开发与利用方面一直走在前沿。

石斛作为传统珍贵中药材，在我国已有2000多年的使用历史。

石斛是典型的多基源药材，《中国药典》中收载的石斛来源为兰科植物金钗石斛（Dendrobiumnobile）、霍山石斛（D.huoshanense）、鼓槌石斛（D. chrysotoxum）或流苏石斛（D. fimbriatum）的栽培种及其同属植物近似种和铁皮石斛（D. officinale）的茎[6]。

但由于资源缺乏，目前我国商品流通的药用石斛植物来源有近40种，因此石斛属植物种质混杂、真伪鉴定困难等问题亟待解决。

DNA分子标记技术具有操作简单、多态性和重复性好等优点，已被广泛应用于石斛亲缘关系鉴别、基因库构建、指纹图谱库等领域[7-10]。

崔学强等[11]采用iPBS分子标记技术分析并构建48份石斛兰种质资源DNA指纹图谱，且利用2对引物可单独进行鉴别。

宋爽等[12]利用ISSR和AFLP两种分子标记方法分析了石斛种质资源的遗传多样性，均能有效地将研究材料进行鉴别。

蔡莉等[13]对15份金钗石斛栽培种样品运用SRAP分子标记法检测其遗传多样性，认为SRAP分子标记法能有效地反映金钗石斛栽培种的遗传多样性。

樊洪泓等[14]利用SRAP和RAPD两种分子标记技术对9份石斛种质进行遗传多样性研究，发现SRAP标记在石斛的遗传多样性与亲缘关系的研究中表现出了极大的优越性。

本研究以31种石斛属植物及金石斛为试验材料，应用SRAP-PCR分子标记技术对其开展遗传多样性分析并构建DNA指纹图谱，将为石斛的品种鉴定与分类提供理论和技术依据。

1.1 材料
供试的32种石斛样品采自福建省福安旺盛经济林研究所石斛种质资源圃（表1）。

每种石斛取样7～10株，每株3～5片嫩叶，混合后装入自封袋中，用变色硅胶（硅胶与叶片体积比例至少10∶1）迅速干燥放入冰盒中，将干燥的样品快速带回实验室，置于–80℃超低温冰箱中保存备用。

1.2 方法
1.2.1 石斛总DNA的提取石斛总DNA采用郑云柯等[15]的改良CTAB法提取，具体如下：取0.1g嫩叶放入液氮中研磨粉碎并干燥至略发白色；将粉碎的样品粉末放入2mL的离心管
中，立即添加预热的CTAB缓冲液750µL，16µL的25mg/mL R Nase A，65℃水浴50min，期间轻微颠倒混匀离心管4～6次；取出离心管放至冷却后加入等体积氯仿-异戊醇（24∶1）混合液，轻微颠倒混匀，并静放3min分层；将混合物于12000r/min，4℃中离心12min；取上清液加800µL无水乙醇（预冷）轻微充分颠倒混匀，直到有大量白色絮状物析出，放入–20℃冰箱中保存20min；將离心管于12000r/min，4℃中离心5min，倒出液体后，加入75%乙醇（预冷）清洗2次（12000r/min，4℃中离心3min），室温晾干；加入100µL已灭菌的ddH2O溶解，将含有DNA的离心管放入–20℃冰箱中保存备用。

1.2.2 SRAP-PCR反应体系PCR反应体系采用前期研究结果[16]：Mg2+2.5 mmol/L，dNTPs 0.25mmol/L，Taq DNA聚合酶1.25 U，引物0.4µmol/L，模板DNA30ng，10×PCR buffer
2.5µL，其余的用灭菌的ddH2O补齐，形成共25µL的扩增体系。

PCR反应程序：94℃预变性5min，94℃变性1 min，36℃复性1 min，72℃延伸1 min，5次循环，94℃变性1 min，根据不同引物的不同退火温度复性1 min，72℃延伸1 min，30次循环，最终72℃延伸7 min，保存于4℃恒温中。

SRAP引物序列见表2。

1.3数据处理
依据常青等[17]的数据分析方法对电泳图谱进行人工读带，同一位点有条带出现的赋值为“1”，无条带出现的赋值为“0”，将数据输入Excel表格中制成0-1二元矩阵。

使用NTSYS Version 2.1软件，结合POPGENE Version 1.32软件计算遗传距离与遗传相似性系数，运用非加权组平均法（UPGMA）进行聚类分析，建立聚类图。

Keywords：Dendrobium; SRAP markers; genetic diversity; DNA fingerprint
DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2022.10.008
石斛属（Dendrobium）为兰科（Orchidaceae）植物最大的属之一，约含1000个种，其中我国分布有74个种，2个变种[1]。

虽然我国石斛属资源在世界上的占有率较低，但因其具有较高的观赏价值[2-3]和药用价值[4-5]，在资源开发与利用方面一直走在前沿。

石斛作为传统珍贵中药材，在我国已有2000多年的使用历史。

石斛是典型的多基源药材，《中国药典》中收载的石斛来源为兰科植物金钗石斛（Dendrobiumnobile）、霍山石斛（D.huoshanense）、鼓槌石斛（D. chrysotoxum）或流苏石斛（D. fimbriatum）的栽培种及其同属植物近似种和铁皮石斛（D. officinale）的茎[6]。

但由于资源缺乏，目前我国商品流通的药用石斛植物来源有近40种，因此石斛属植物种质混杂、真伪鉴定困难等问题亟待解决。

DNA分子标记技术具有操作简单、多态性和重复性好等优点，已被广泛应用于石斛亲缘关系鉴别、基因库构建、指纹图谱库等领域[7-10]。

崔学强等[11]采用iPBS分子标记技术分析并构建48份石斛兰种质资源DNA指纹图谱，且利用2对引物可单独进行鉴别。

宋爽等[12]利用ISSR和AFLP两种分子标记方法分析了石斛种质资源的遗传多样性，均能有效地将研究材料进行鉴别。

蔡莉等[13]对15份金钗石斛栽培种样品运用SRAP分子标记法检测其遗传多样性，认为SRAP分子标记法能有效地反映金钗石斛
栽培种的遗传多样性。

樊洪泓等[14]利用SRAP和RAPD两种分子标记技术对9份石斛种质进行遗传多样性研究，发现SRAP标记在石斛的遗传多样性与亲缘关系的研究中表现出了极大的优越性。

本研究以31种石斛属植物及金石斛为试验材料，应用SRAP-PCR分子标記技术对其开展遗传多样性分析并构建DNA指纹图谱，将为石斛的品种鉴定与分类提供理论和技术依据。

1.1 材料
供试的32种石斛样品采自福建省福安旺盛经济林研究所石斛种质资源圃（表1）。

每种石斛取样7～10株，每株3～5片嫩叶，混合后装入自封袋中，用变色硅胶（硅胶与叶片体积比例至少10∶1）迅速干燥放入冰盒中，将干燥的样品快速带回实验室，置于–80℃超低温冰箱中保存备用。

1.2 方法
1.2.1 石斛总DNA的提取石斛总DNA采用郑云柯等[15]的改良CTAB法提取，具体如下：取0.1g嫩叶放入液氮中研磨粉碎并干燥至略发白色；将粉碎的样品粉末放入2mL的离心管中，立即添加预热的CTAB缓冲液750µL，16µL的25mg/mL R Nase A，65℃水浴50min，期间轻微颠倒混匀离心管4～6次；取出离心管放至冷却后加入等体积氯仿-异戊醇（24∶1）混合液，轻微颠倒混匀，并静放3min分层；将混合物于12000r/min，4℃中离心12min；取上清液加800µL无水乙醇（预冷）轻微充分颠倒混匀，直到有大量白色絮状物析出，放入–20℃冰箱中保存20min；将离心管于12000r/min，4℃中离心5min，倒出液体后，加入75%乙醇（预冷）清洗2次（12000r/min，4℃中离心3min），室温晾干；加入100µL已灭菌的ddH2O溶解，将含有DNA的离心管放入–20℃冰箱中保存备用。

1.2.2 SRAP-PCR反应体系PCR反应体系采用前期研究结果[16]：Mg2+2.5 mmol/L，dNTPs 0.25mmol/L，Taq DNA聚合酶1.25 U，引物0.4µmol/L，模板DNA30ng，10×PCR buffer
2.5µL，其余的用灭菌的ddH2O补齐，形成共25µL的扩增体系。

PCR反应程序：94℃预变性5min，94℃变性1 min，36℃复性1 min，72℃延伸1 min，5次循环，94℃变性1 min，根据不同引物的不同退火温度复性1 min，72℃延伸1 min，30次循环，最终72℃延伸7 min，保存于4℃恒温中。

SRAP引物序列见表2。

1.3数据处理
依据常青等[17]的数据分析方法对电泳图谱进行人工读带，同一位点有条带出现的赋值为“1”，无条带出现的赋值为“0”，将数据输入Excel表格中制成0-1二元矩阵。

使用NTSYS Version 2.1软件，结合POPGENE Version 1.32软件计算遗传距离与遗传相似性系数，运用非加权组平均法（UPGMA）进行聚类分析，建立聚类图。

Keywords：Dendrobium; SRAP markers; genetic diversity; DNA fingerprint
DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2022.10.008
石斛属（Dendrobium）为兰科（Orchidaceae）植物最大的属之一，约含1000个种，其中我国分布有74个种，2个变种[1]。

虽然我国石斛属资源在世界上的占有率较低，但因其具有较高的观赏价值[2-3]和药用价值[4-5]，在资源开发与利用方面一直走在前沿。

石斛作为传统珍贵中药材，在我国已有2000多年的使用历史。

石斛是典型的多基源药材，《中国药典》中收载的石斛来源为兰科植物金钗石斛（Dendrobiumnobile）、霍山石斛（D.huoshanense）、鼓槌石斛（D. chrysotoxum）或流苏石斛（D. fimbriatum）的栽培种及其同属植物近似种和铁皮石斛（D. officinale）的茎[6]。

但由于资源缺乏，目前我国商品流通的药用石斛植物来源有近40种，因此石斛属植物种质混杂、真伪鉴定困难等问题亟待解决。

DNA分子标记技术具有操作简单、多态性和重复性好等优点，已被广泛应用于石斛亲缘关系鉴别、基因库构建、指纹图谱库等领域[7-10]。

崔学强等[11]采用iPBS分子标记技术分析并构建48份石斛兰种质资源DNA指纹图谱，且利用2对引物可单独进行鉴别。

宋爽等[12]利用ISSR和AFLP两种分子标记方法分析了石斛种質资源的遗传多样性，均能有效地将研究材料进行鉴别。

蔡莉等[13]对15份金钗石斛栽培种样品运用SRAP分子标记法检测其遗传多样性，认为SRAP分子标记法能有效地反映金钗石斛栽培种的遗传多样性。

樊洪泓等[14]利用SRAP和RAPD两种分子标记技术对9份石斛种质进行遗传多样性研究，发现SRAP标记在石斛的遗传多样性与亲缘关系的研究中表现出了极大的优越性。

本研究以31种石斛属植物及金石斛为试验材料，应用SRAP-PCR分子标记技术对其开展遗传多样性分析并构建DNA指纹图谱，将为石斛的品种鉴定与分类提供理论和技术依据。

1.1 材料
供试的32种石斛样品采自福建省福安旺盛经济林研究所石斛种质资源圃（表1）。

每种石斛取样7～10株，每株3～5片嫩叶，混合后装入自封袋中，用变色硅胶（硅胶与叶片体积比例至少10∶1）迅速干燥放入冰盒中，将干燥的样品快速带回实验室，置于–80℃超低温冰箱中保存备用。

1.2 方法
1.2.1 石斛总DNA的提取石斛总DNA采用郑云柯等[15]的改良CTAB法提取，具体如下：取0.1g嫩叶放入液氮中研磨粉碎并干燥至略发白色；将粉碎的样品粉末放入2mL的离心管中，立即添加预热的CTAB缓冲液750µL，16µL的25mg/mL R Nase A，65℃水浴50min，期间轻微颠倒混匀离心管4～6次；取出离心管放至冷却后加入等体积氯仿-异戊醇（24∶1）混合液，轻微颠倒混匀，并静放3min分层；将混合物于12000r/min，4℃中离心12min；取上清液加800µL无水乙醇（预冷）轻微充分颠倒混匀，直到有大量白色絮状物析出，放入–20℃冰箱中保存20min；将离心管于12000r/min，4℃中离心5min，倒出液体后，加入75%乙醇（预冷）清洗2次（12000r/min，4℃中离心3min），室温晾干；加入100µL已灭菌的ddH2O溶解，将含有DNA的离心管放入–20℃冰箱中保存备用。

1.2.2 SRAP-PCR反应体系PCR反应体系采用前期研究结果[16]：Mg2+2.5 mmol/L，dNTPs 0.25mmol/L，Taq DNA聚合酶1.25 U，引物0.4µmol/L，模板DNA30ng，10×PCR buffer
2.5µL，其余的用灭菌的ddH2O补齐，形成共25µL的扩增体系。

PCR反应程序：94℃预变性5min，94℃变性1 min，36℃复性1 min，72℃延伸1 min，5次循环，94℃变性1 min，根据不同引物的不同退火温度复性1 min，72℃延伸1 min，30次循环，最终72℃延伸7 min，保存于4℃恒温中。

SRAP引物序列见表2。

1.3数据处理
依据常青等[17]的数据分析方法对电泳图谱进行人工读带，同一位点有条带出现的赋值为“1”，无条带出现的赋值为“0”，将数据输入Excel表格中制成0-1二元矩阵。

使用NTSYS Version 2.1软件，结合POPGENE Version 1.32软件计算遗传距离与遗传相似性系数，运用非加权组平均法（UPGMA）进行聚类分析，建立聚类图。

Keywords：Dendrobium; SRAP markers; genetic diversity; DNA fingerprint
DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2022.10.008
石斛属（Dendrobium）为兰科（Orchidaceae）植物最大的属之一，约含1000个种，其中我国分布有74个种，2个变种[1]。

虽然我国石斛属资源在世界上的占有率较低，但因其具有较高的观赏价值[2-3]和药用价值[4-5]，在资源开发与利用方面一直走在前沿。

石斛作为传统珍贵中药材，在我国已有2000多年的使用历史。

石斛是典型的多基源药材，《中国药典》中收载的石斛来源为兰科植物金钗石斛（Dendrobiumnobile）、霍山石斛（D.huoshanense）、鼓槌石斛（D. chrysotoxum）或流苏石斛（D. fimbriatum）的栽培种及其同属植物近似种和铁皮石斛（D. officinale）的茎[6]。

但由于资源缺乏，目前我国商品流通的药用石斛植物来源有近40种，因此石斛属植物种质混杂、真伪鉴定困难等问题亟待解决。

DNA分子标记技术具有操作简单、多态性和重复性好等优点，已被广泛应用于石斛亲缘关系鉴别、基因库构建、指纹图谱库等领域[7-10]。

崔学强等[11]采用iPBS分子标记技术分析并构建48份石斛兰种质资源DNA指纹图谱，且利用2对引物可单独进行鉴别。

宋爽等[12]利用ISSR和AFLP两种分子标记方法分析了石斛种质资源的遗传多样性，均能有效地将研究材料进行鉴别。

蔡莉等[13]对15份金钗石斛栽培种样品运用SRAP分子标记法检测其遗传多样性，认为SRAP分子标记法能有效地反映金钗石斛栽培种的遗传多样性。

樊洪泓等[14]利用SRAP和RAPD两种分子标记技术对9份石斛种质进行遗传多样性研究，发现SRAP标记在石斛的遗传多样性与亲缘关系的研究中表现出了极大的优越性。

本研究以31种石斛属植物及金石斛为试验材料，应用SRAP-PCR分子标记技术对其开展遗传多样性分析并构建DNA指纹图谱，将为石斛的品种鉴定与分类提供理论和技术依据。

1.1 材料
供试的32种石斛样品采自福建省福安旺盛经济林研究所石斛种质资源圃（表1）。

每种石斛取样7～10株，每株3～5片嫩叶，混合后装入自封袋中，用变色硅胶（硅胶与叶片体积比例至少10∶1）迅速干燥放入冰盒中，将干燥的样品快速带回实验室，置于–80℃超低温冰箱中保存备用。

1.2 方法
1.2.1 石斛总DNA的提取石斛总DNA采用郑云柯等[15]的改良CTAB法提取，具体如下：取0.1g嫩叶放入液氮中研磨粉碎并干燥至略发白色；将粉碎的样品粉末放入2mL的离心管中，立即添加预热的CTAB缓冲液750µL，16µL的25mg/mL R Nase A，65℃水浴50min，期间轻微颠倒混匀离心管4～6次；取出离心管放至冷却后加入等体积氯仿-异戊醇（24∶1）混合液，轻微颠倒混匀，并静放3min分层；将混合物于12000r/min，4℃中离心12min；取上清液加800µL无水乙醇（预冷）轻微充分颠倒混匀，直到有大量白色絮状物析出，放入–20℃冰箱中保存20min；将离心管于12000r/min，4℃中离心5min，倒出液体后，加入75%乙醇（预冷）清洗2次（12000r/min，4℃中离心3min），室温晾干；加入100µL已滅菌的ddH2O溶解，将含有DNA的离心管放入–20℃冰箱中保存备用。

1.2.2 SRAP-PCR反应体系PCR反应体系采用前期研究结果[16]：Mg2+2.5 mmol/L，dNTPs 0.25mmol/L，Taq DNA聚合酶1.25 U，引物0.4µmol/L，模板DNA30ng，10×PCR buffer
2.5µL，其余的用灭菌的ddH2O补齐，形成共25µL的扩增体系。

PCR反应程序：94℃预变性5min，94℃变性1 min，36℃复性1 min，72℃延伸1 min，5次循环，94℃变性1 min，根据不同引物的不同退火温度复性1 min，72℃延伸1 min，30次循环，最终72℃延伸7 min，保存于4℃恒温中。

SRAP引物序列见表2。

1.3数据处理
依据常青等[17]的数据分析方法对电泳图谱进行人工读带，同一位点有条带出现的赋值为“1”，无条带出现的赋值为“0”，将数据输入Excel表格中制成0-1二元矩阵。

使用NTSYS Version 2.1软件，结合POPGENE Version 1.32软件计算遗传距离与遗传相似性系数，运用非加权组平均法（UPGMA）进行聚类分析，建立聚类图。

Keywords：Dendrobium; SRAP markers; genetic diversity; DNA fingerprint
DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2022.10.008
石斛属（Dendrobium）为兰科（Orchidaceae）植物最大的属之一，约含1000个种，其中我国分布有74个种，2个变种[1]。

虽然我国石斛属资源在世界上的占有率较低，但因其具有较高的观赏价值[2-3]和药用价值[4-5]，在资源开发与利用方面一直走在前沿。

石斛作为传统珍贵中药材，在我国已有2000多年的使用历史。

石斛是典型的多基源药材，《中国药典》中收载的
石斛来源为兰科植物金钗石斛（Dendrobiumnobile）、霍山石斛（D.huoshanense）、鼓槌石斛（D. chrysotoxum）或流苏石斛（D. fimbriatum）的栽培种及其同属植物近似种和铁皮石斛（D. officinale）的茎[6]。

但由于资源缺乏，目前我国商品流通的药用石斛植物来源有近40种，因此石斛属植物种质混杂、真伪鉴定困难等问题亟待解决。

DNA分子标记技术具有操作简单、多态性和重复性好等优点，已被广泛应用于石斛亲缘關系鉴别、基因库构建、指纹图谱库等领域[7-10]。

崔学强等[11]采用iPBS分子标记技术分析并构建48份石斛兰种质资源DNA指纹图谱，且利用2对引物可单独进行鉴别。

宋爽等[12]利用ISSR和AFLP两种分子标记方法分析了石斛种质资源的遗传多样性，均能有效地将研究材料进行鉴别。

蔡莉等[13]对15份金钗石斛栽培种样品运用SRAP分子标记法检测其遗传多样性，认为SRAP分子标记法能有效地反映金钗石斛栽培种的遗传多样性。

樊洪泓等[14]利用SRAP和RAPD两种分子标记技术对9份石斛种质进行遗传多样性研究，发现SRAP标记在石斛的遗传多样性与亲缘关系的研究中表现出了极大的优越性。

本研究以31种石斛属植物及金石斛为试验材料，应用SRAP-PCR分子标记技术对其开展遗传多样性分析并构建DNA指纹图谱，将为石斛的品种鉴定与分类提供理论和技术依据。

1.1 材料
供试的32种石斛样品采自福建省福安旺盛经济林研究所石斛种质资源圃（表1）。

每种石斛取样7～10株，每株3～5片嫩叶，混合后装入自封袋中，用变色硅胶（硅胶与叶片体积比例至少10∶1）迅速干燥放入冰盒中，将干燥的样品快速带回实验室，置于–80℃超低温冰箱中保存备用。

1.2 方法
1.2.1 石斛总DNA的提取石斛总DNA采用郑云柯等[15]的改良CTAB法提取，具体如下：取0.1g嫩叶放入液氮中研磨粉碎并干燥至略发白色；将粉碎的样品粉末放入2mL的离心管中，立即添加预热的CTAB缓冲液750µL，16µL的25mg/mL R Nase A，65℃水浴50min，期间轻微颠倒混匀离心管4～6次；取出离心管放至冷却后加入等体积氯仿-异戊醇（24∶1）混合液，轻微颠倒混匀，并静放3min分层；将混合物于12000r/min，4℃中离心12min；取上清液加800µL无水乙醇（预冷）轻微充分颠倒混匀，直到有大量白色絮状物析出，放入–20℃冰箱中保存20min；将离心管于12000r/min，4℃中离心5min，倒出液体后，加入75%乙醇（预冷）清洗2次（12000r/min，4℃中离心3min），室温晾干；加入100µL已灭菌的ddH2O溶解，将含有DNA的离心管放入–20℃冰箱中保存备用。

1.2.2 SRAP-PCR反应体系PCR反应体系采用前期研究结果[16]：Mg2+2.5 mmol/L，dNTPs 0.25mmol/L，Taq DNA聚合酶1.25 U，引物0.4µmol/L，模板DNA30ng，10×PCR buffer
2.5µL，其余的用灭菌的ddH2O补齐，形成共25µL的扩增体系。

PCR反应程序：94℃预变性5min，94℃变性1 min，36℃复性1 min，72℃延伸1 min，5次循环，94℃变性1 min，根据不同引物的不同退火温度复性1 min，72℃延伸1 min，30次循环，最终72℃延伸7 min，保存于4℃恒温中。

SRAP引物序列见表2。

1.3数据处理
依据常青等[17]的数据分析方法对电泳图谱进行人工读带，同一位点有条带出现的赋值为“1”，无条带出现的赋值为“0”，将数据输入Excel表格中制成0-1二元矩阵。

使用NTSYS Version 2.1软件，结合POPGENE Version 1.32软件计算遗传距离与遗传相似性系数，运用非加权组平均法（UPGMA）进行聚类分析，建立聚类图。

Keywords：Dendrobium; SRAP markers; genetic diversity; DNA fingerprint
DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2022.10.008
石斛属（Dendrobium）为兰科（Orchidaceae）植物最大的属之一，约含1000个种，其中我国分布有74个种，2个变种[1]。

虽然我国石斛属资源在世界上的占有率较低，但因其具有较高的观赏价值[2-3]和药用价值[4-5]，在资源开发与利用方面一直走在前沿。

石斛作为传统珍贵中药材，在我国已有2000多年的使用历史。

石斛是典型的多基源药材，《中国药典》中收载的石斛来源为兰科植物金钗石斛（Dendrobiumnobile）、霍山石斛（D.huoshanense）、鼓槌石斛（D. chrysotoxum）或流苏石斛（D. fimbriatum）的栽培种及其同属植物近似种和铁皮石斛（D. officinale）的茎[6]。

但由于资源缺乏，目前我国商品流通的药用石斛植物来源有近40种，因此石斛属植物种质混杂、真伪鉴定困难等问题亟待解决。

DNA分子标记技术具有操作简单、多态性和重复性好等优点，已被广泛应用于石斛亲缘关系鉴别、基因库构建、指纹图谱库等领域[7-10]。

崔学强等[11]采用iPBS分子标记技术分析并构建48份石斛兰种质资源DNA指纹图谱，且利用2对引物可单独进行鉴别。

宋爽等[12]利用ISSR和AFLP两种分子标记方法分析了石斛种质资源的遗传多样性，均能有效地将研究材料进行鉴别。

蔡莉等[13]对15份金钗石斛栽培种样品运用SRAP分子标记法检测其遗传多样性，认为SRAP分子标记法能有效地反映金钗石斛栽培种的遗传多样性。

樊洪泓等[14]利用SRAP和RAPD两种分子标记技术对9份石斛种质进行遗传多样性研究，发现SRAP标记在石斛的遗传多样性与亲缘关系的研究中表现出了极大的优越性。

本研究以31种石斛属植物及金石斛为试验材料，应用SRAP-PCR分子标记技术对其开展遗传多样性分析并构建DNA指纹图谱，将为石斛的品种鉴定与分类提供理论和技术依据。

1.1 材料
供试的32种石斛样品采自福建省福安旺盛经济林研究所石斛种质资源圃（表1）。

每种石斛取样7～10株，每株3～5片嫩叶，混合后装入自封袋中，用变色硅胶（硅胶与叶片体积比例至少10∶1）迅速干燥放入冰盒中，将干燥的样品快速带回实验室，置于–80℃超低温冰箱中保存备用。

1.2 方法。