植物DNA的提取与测定

植物DNA的提取与测定
一、目的
随着基因工程等分子生物学技术的迅速发展及广泛应用，人们经常需要提取高分子量的植物DNA，用于构建基因文库、基因组southern 分析、酶切及克隆等，这是研究基因结构和功能的重要步骤。

本实验目的是学习从植物材料中提取和测定DNA 的原理并掌握CTAB 提取DNA 的方法，进一步了解DNA 的性质。

二、原理
细胞中的DNA 绝大多数以DNA-蛋白复合物（DNP）的形式存在于细胞核内。

提取DNA 时，一般先破碎细胞释放出DNP，再用含少量异戊醇的氯仿除去蛋白质，最后用乙醇把DNA 从抽提液中沉淀出来。

DNP与核糖核蛋白（RNP）在不同浓度的电解质溶液中溶解度差别很大，利用这一特性可将二者分离。

以NaCl 溶液为例：RNP在0.14mol/L NaCl中溶解度很大，而DNP 在其中的溶解度仅为纯水中的1％。

当NaCl 浓度逐渐增大时，RNP的溶解度变化不大，而DNP 的溶解则随之不断增加。

当NaCl 浓度大于1mol/L 时，DNP的溶解度最大，为纯水中溶解度的2 倍，因此通常可用1.4mol/L NaCl 提取DNA。

为了得到纯的DNA 制品，可用适量的RNase 处理提取液，以降解DNA 中搀杂的RNA。

关于植物总DNA 的提取主要有两种方法：
1．CTAB 法：
CTAB（十六烷基三甲基溴化铵，hexadecyltrimethylammonium bromide, 简称CTAB）：
是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜，它能与核酸形成复合物，在高盐溶液中（0.7mol/LNaCl）是可溶的，当降低溶液盐的浓度到一定程度（0.3 mol/L NaCl）时从溶液中沉淀，通过离心就可将CTAB 与核酸的复合物同蛋白、多糖类物质分开，然后将CTAB 与核酸的复合物沉淀溶解于高盐溶液中，再加入乙醇使核酸沉淀，CTAB 能溶解于乙醇中。

2．SDS 法：
利用高浓度的阴离子去垢剂SDS（十二烷基磺酸钠，Sodium dodecyl sulfate, 简称SDS）使DNA 与蛋白质分离，在高温（55～65℃）条件下裂解细胞，使染色体离析，蛋白变性，释放出核酸，然后采用提高盐浓度及降低温度的方法使蛋白质及多糖杂质沉淀，离心后除去沉淀，上清液中的DNA用酚/氯仿抽提，反复抽提后用乙醇沉淀水相中的DNA。

一般生物体的基因组DNA 为107~109bp，在基因克隆工作中，通常要求制备的大分子DNA 的分子量为克隆片段长度的4 倍以上，否则会由于制备过程中随机断裂的末端多为平末端，导致酶切后有效末端太少，可用于克隆的比例太低，严重影响克隆工作。

因此有效制备大分子DNA 的方法必须考虑两个原则：（1）尽量去除蛋白质、RNA、次生代谢物质（如多酚、类黄酮等）、多糖等杂质，并防止和抑制内源DNase 对DNA 的降解。

（2）尽量减少对溶液中DNA 的机械剪切破坏。

几乎所有的DNase 都需要Mg2+或Mn2+为辅因子，故实现（1）尽量去除蛋白质的要求，需加入一定浓度的螯合剂，如EDTA、柠檬酸，而且整个提取过程应在较低温度下进行（一般利用液氮或冰浴）。

为实现（2）需要在DNA 处于溶解状态时，尽量减弱溶液的涡旋，而且动作要轻柔，在进行DNA 溶液转移时用大口（或剪口）吸管。

提取的DNA 是否为纯净、双链、高分子的化合物，一般要通过紫外吸收、化学测定、“熔点”（melting temperature, Tm）测定、电镜观察及电泳分离等方法鉴定。

本实验采用CTAB 法提取DNA 并通过紫外吸收法鉴定。

三、实验材料、主要仪器和试剂
1．实验材料
新鲜菠菜幼嫩组织、花椰菜花冠或小麦黄化苗等
2．主要仪器
（1）高速冷冻离心机
（2）751 型分光光度计
（3）恒温水浴
（3）液氮或冰浴设备
（4）磨口锥形瓶
（5）核酸电泳设备
3．试剂（CTAB 法）
（1）CTAB 提取缓冲液：100 mmol/L Tris-HCl （pH8.0），20 mmol/L EDTA-Na2，1.4mol/LNaCl（如表1），2% CTAB，使用前加入0.1%（V/V）的β-巯基乙醇。

表1 CTAB提取缓冲液配制
用HCl 调pH 值。

（2）TE 缓冲液：10mmol/L Tris-HCl, 1mM EDTA（pH8.0）。

（3）DNase-free RNase A: 溶解RNase A 于TE 缓冲液中，浓度为10mg/mL，煮沸10～30min, 除去DNase 活性，－20℃贮存（DNase 为DNA 酶，Rnase 为RNA 酶）。

（4）氯仿-异戊醇混合液（24:1，V/V）：240mL 氯仿（A.R.）加10mL 异戊醇（A.R.）混匀。

（5）3mol/L 乙酸钠（NaAc，pH6.8）：称取NaAc·3H2O 81.62g，用蒸馏水溶解，配制成200mL，用HAc 调pH 至6.5。

（6）95％乙醇
TE 缓冲液，Tris-HCl（pH8.0）液，NaAc 溶液均需要高压灭菌。

四、操作步骤
1．称取2～5g 新鲜菠菜幼嫩组织或小麦黄花苗等植物材料，用自来水、蒸馏水先后冲洗叶面，用滤纸吸干水分备用。

叶片称重后剪成1cm 长，置研钵中，经液氮冷冻后研磨成粉末。

待液氮蒸发完后，加入15mL 预热（60～65℃）的CTAB 提取缓冲液，转入一磨口锥形瓶中，置于65℃水浴保温，0.5~1h，不时地轻轻摇动混匀。

2．加等体积的氯仿/异戊醇(24:1)，盖上瓶塞，温和摇动，使成乳状液。

3．将锥形瓶中的液体倒入离心管中，在室温下4 000r/min 离心5min，静置，离心管中出现 3 层，小心地吸取含有核酸的上层清液于量筒中，弃去中间层的细胞碎片和变性蛋白以及下层的氯仿。

4．根据需要，上清液可用氯仿/异戊醇反复提取多次。

5．收集上层清液，并将其倒入小烧杯。

沿烧杯壁慢慢加入1～2 倍体积预冷的95％乙醇，边加边用细玻棒沿同一方向搅动，可看到纤维状的沉淀（主要为DNA）
迅速缠绕在玻棒上。

小心取下这些纤维状沉淀，加1～2 mL 70%乙醇冲洗沉淀，轻摇几分钟，除去乙醇，即为DNA 粗制品。

6．上述DNA 粗制品含有一定量的RNA 和其它杂质。

若要制取较纯的DNA，可将粗制品溶于TE 缓冲液中，加入10mg/mL 的RNase 溶液，使其终浓度达50μg/mL，混合物于37℃水浴中保温30min 除去RNA。

重复步骤2～5 的操作，可制得较纯的DNA 制品。

7．将DNA 制品溶于250μL 的TE 缓冲液中，完全溶解DNA 样品。

8．加入1/10 倍体积的3mol/L NaAc（pH6.8）和2 倍体积的95％乙醇，沉淀DNA，重复步骤5。

最后，将DNA 溶于250μL 的TE 缓冲液中。

9．在751 型分光光度计上测定该溶液在260nm 紫外光波长下的光密度值。

代入下式计算DNA 的含量。

四、结果计算
式中OD260nm 为260nm 处的光密度；L 为比色杯光径（cm）；0.020 为1μg/mL DNA 钠盐的光密度。

DNA 的紫外吸收高峰为260nm，吸收低峰为230nm，而蛋白质的紫外吸收高峰为280nm。

上述DNA 溶液适当稀释后，在751 分光光度计上测定其OD260nm、OD230nm 和OD280nm。

如OD260nm/ OD230nm≥2OD260nm/ OD280nm≥1.8，表示RNA 已经除净，蛋白含量不超过0.3％。

五、附注
如果植物样品不经液氮处理，提取液中的CTAB 浓度需要提高到4%（W/V）。

在许多情况下，使用0.1%（V/V）巯基乙醇，并不能完全抑制叶片中的氧化作用，但是，这种氧化作用不会影响限制性内切酶的活性。

如果使用的巯基乙醇浓度高于0.1%（V/V），则会大大降低DNA 的得率。

六、思考题
1．制备的DNA 在什么溶液中较稳定?
2．为了保证植物DNA 的完整性，在吸取样品、抽提过程中应注意什么？
参考答案
1．制备的DNA 在：（1）含有螯和剂如EDTA 中较稳定，因为EDTA 能螯和Mg2+或Mn2+离子，抑制DNase；（2）在pH5～9 之间较稳定，否则过酸过碱会破坏DNA 的结构；
（3）有一定离子强度（强度越高, DNA 越稳定）的溶液中较稳定。

（TE 满足以上要求, 但如需对所得DNA 进行酶切, EDTA 浓度不可过高, 一般用0.1×TE 或0.2×TE）。

2．为了保证植物DNA 的完整性：（1）整个提取过程应在较低温度下进行（一般利用液氮或冰浴）；这样可防止和抑制内源DNase 对DNA 的降解；（2）当DNA 处于溶解状态时，要尽量减弱溶液的涡旋，动作要轻柔；在进行DNA 溶液转移时用大口（或剪口）吸管，尽量减少对溶液中DNA 的机械剪切破坏。

5、关于坚持的名言，你既然期望辉煌伟大的一生，那么就应该从今天起，以毫不动摇的决心和坚定不移的信念，凭自己的智慧和毅力，去创造你和人类的快乐。

——佚名
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