骨质疏松症mirna和基因差异表达分析及mirna-mrna调控网络的构建

论㊀
㊀著
(基础研究)
骨质疏松症ｍｉＲＮＡ和基因差异表达分析及ｍｉＲＮＡ￣ｍＲＮＡ调控网络的构建
汪悦东ꎬ万㊀雷ꎬ张志海ꎬ黄宏兴ꎬ朱根福
㊀㊀[摘要]㊀目的㊀ｍｉＲＮＡ在骨质疏松症的发生发展过程中发挥重要作用ꎮ文中旨在筛选与骨质疏松症密切相关的ｍｉＲ￣
ＮＡ和基因ꎬ完成骨质疏松症ｍｉＲＮＡ￣ｍＲＮＡ调控网络的构建ꎮ㊀方法㊀通过ＧＥＯ数据库查找骨质疏松症的基因芯片表达谱ꎬ采用ＧＥＯ２Ｒ进行分析并筛选差异表达基因(ＤＥＧｓ)和差异表达ｍｉＲＮＡꎬ采用火山图对差异基因和ｍｉＲＮＡ进行展示ꎬ然后通过Ｄａｖｉｄ在线数据库完成ＧＯ和ＫＥＧＧ通路分析ꎬＳｔｒｉｎｇ在线数据库用于完成ＰＰＩ蛋白网络分析ꎮ采用ＴａｒｇｅｔＳｃａｎ㊁ｍｉＲＴａｒＢａｓｅ
和ｍｉＲＤＢ预测靶基因ꎬ最后通过Ｃｙｔｏｓｃａｐｅ软件进行ＰＰＩ和ｍｉＲＮＡ￣ｍＲＮＡ调控网络可视化ꎮ㊀结果㊀通过筛选得到１５个差异ｍｉＲＮＡ和１７４个差异表达基因ꎮ通过ＧＯ和ＫＥＧＧ通路分析得到２５条ＧＯ功能注释ꎬ生物过程包括对药物的反应㊁血管生成㊁离子迁移㊁ＧＴＰａｓｅ介导的信号转导的调控㊁适应性免疫反应等ꎬＫＥＧＧ富集分析得到ＮＦ￣κＢ信号通路㊁ＨＩＦ￣１信号通路和谷胱甘肽代谢ꎮ通过ｃｙｔｏｈｕｂｂａ插件得到１０个ｈｕｂ基因ꎬ分别为:ＣＤＨ２㊁ＰＯＬＲ２Ａ㊁ＫＬＦ４㊁ＣＣＮＤ１㊁ＳＯＸ４㊁ＮＣＢＰ２㊁ＶＥＧＦＡ㊁ＰＫＬＲ㊁ＥＰ３００㊁ＨＮＲＮＰＬꎮ７个ｍｉＲＮＡ(２个上调的ｍｉＲＮＡꎬ５个下调ｍｉＲＮＡ)分别为:ｈｓａ￣ｍｉＲ￣１８ｂ￣５ｐꎬｈｓａ￣ｍｉＲ￣１９４￣５ｐ上调ꎬｈｓａ￣ｍｉＲ￣４７６８￣３ｐꎬｈｓａ￣ｍｉＲ￣４２６９ꎬｈｓａ￣ｍｉＲ￣４７１７￣３ｐꎬｈｓａ￣ｍｉＲ￣６２９￣３ｐꎬｈｓａ￣ｍｉＲ￣４７９３￣３ｐ下调ꎮ对７个ｍｉＲＮＡ进行预测得到３０６５个靶基因ꎬ然后与１７４个ＤＥＧｓ交集得到４４个交集基因ꎬ最后成功构建ｍｉＲＮＡ￣ｍＲＮＡ网络调控图ꎮｈｓａ￣ｍｉＲ￣４２６９和ｈｓａ￣ｍｉＲ￣１９４￣５ｐ与其调控的靶基因表达呈现正相关关系比较多ꎮ㊀结论㊀ｍｉＲ￣１９４￣５ｐ在骨质疏松症中显著上调ꎬ可能通过调控其靶基因ＣＤＨ２在骨质疏松症中发挥重要作用ꎬ为骨质疏松症的诊断和治疗提供了候选靶点ꎮ㊀㊀[关键词]㊀骨质疏松症ꎻｍｉＲＮＡꎻ调控网络ꎻＧＥＯ数据库㊀㊀[中图分类号]㊀Ｒ６８㊀㊀㊀[文献标志码]㊀Ａ㊀㊀㊀[文章编号]㊀１００８￣８１９９(２０２０)０３￣０２５８￣０６
㊀㊀[ＤＯＩ]㊀１０.１６５７１/ｊ.ｃｎｋｉ.１００８￣８１９９.２０２０.０３.００８
基金项目:广东省中医药局科研项目(２０１９３００８)ꎻ广州市
海珠区科技计划项目(海科工商信计２０１８￣９４㊁
２０１８￣９６)
作者单位:５１０４０５广州ꎬ广州中医药大学第三临床医学院
[汪悦东(医学硕士研究生)]ꎻ５１００００广州ꎬ广州中医药大学第三附属医院骨科(万㊀雷㊁张志海㊁黄宏兴㊁朱根福)
通信作者:张志海ꎬＥ－ｍａｉｌ:１３７２５２９５７９３＠１３９.ｃｏｍ
ＤｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎａｎａｌｙｓｉｓａｎｄｒｅｇｕｌａｔｏｒｙｎｅｔｗｏｒｋｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎｏｆｍｉＲＮＡａｎｄｇｅｎｅｓｉｎｏｓｔｅｏｐｏｒｏｓｉｓ
ＷＡＮＧＹｕｅ￣ｄｏｎｇ１ꎬＷＡＮＬｅｉ２ꎬＺＨＡＮＧＺｈｉ￣ｈａｉ２ꎬＨＵＡＮＧＨｏｎｇ￣ｘｉｎｇ２ꎬＺＨＵＧｅｎ￣ｆｕ２(１.ＴｈｅＴｈｉｒｄＣｌｉｎｉｃａｌＭｅｄｉｃａｌＣｏｌｌｅｇｅｏｆＧｕａｎｇｚｈｏｕＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＣｈｉｎｅｓｅＭｅｄｉｃｉｎｅꎬＧｕａｎｇｚｈｏｕ５１０４０５ꎬＧｕａｎｇ￣
ｄｏｎｇꎬＣｈｉｎａꎻ２.ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＯｒｔｈｏｐｅｄｉｃｓꎬＴｈｅＴｈｉｒｄＡｆｆｉｌｉａｔｅｄＨｏｓｐｉｔａｌｏｆＧｕａｎｇｚｈｏｕＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＣｈｉｎｅｓｅＭｅｄｉｃｉｎｅꎬ
Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ５１００００ꎬＧｕａｎｇｄｏｎｇꎬＣｈｉｎａ)
㊀㊀[Ａｂｓｔｒａｃｔ]㊀Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ㊀ＭｉｃｒｏＲＮＡｓ(ｍｉＲＮＡ)ｐｌａｙａｎｉｍｐｏｒｔａｎｔｒｏｌｅｉｎｔｈｅｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｎｄｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎｏｆｏｓｔｅｏｐｏｒｏｓｉｓ.Ｔｈｉｓ
ｓｔｕｄｙａｉｍｓｔｏｓｃｒｅｅｎｆｏｒｍｉＲＮＡｓａｎｄｇｅｎｅｓｃｌｏｓｅｌｙｒｅｌａｔｅｄｔｏｏｓｔｅｏｐｏｒｏｓｉｓꎬａｎｄｔｏｃｏｍｐｌｅｔｅｔｈｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎｏｆａｍｉＲＮＡ￣ｍＲＮＡｒｅｇｕｌａ￣ｔｏｒｙｎｅｔｗｏｒｋｏｆｏｓｔｅｏｐｏｒｏｓｉｓ.㊀Ｍｅｔｈｏｄｓ㊀ＴｈｅｇｅｎｅｃｈｉｐｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｐｒｏｆｉｌｅｏｆｏｓｔｅｏｐｏｒｏｓｉｓｗａｓｏｂｔａｉｎｅｄｔｈｒｏｕｇｈｔｈｅＧＥＯｄａｔａｂａｓｅꎬａｎｄ
ｔｈｅｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙｅｘｐｒｅｓｓｅｄｇｅｎｅｓ(ＤＥＧｓ)ａｎｄｍｉＲＮＡｓｗｅｒｅａｎａｌｙｚｅｄａｎｄｓｃｒｅｅｎｅｄｖｉａＧＥＯ２Ｒ.Ｗｅｕｓｅｄｖｏｌｃａｎｉｃｍａｐｓｔｏｄｉｓｐｌａｙｄｉｆ￣
ｆｅｒｅｎｔｉａｌｇｅｎｅｓａｎｄｍｉＲＮＡｓꎬａｎｄｃｏｍｐｌｅｔｅｄｔｈｅＧＯａｎｄＫＥＧＧｐａｔｈｗａｙａｎａｌｙｓｉｓｔｈｒｏｕｇｈｔｈｅＤａｖｉｄｏｎｌｉｎｅｄａｔａｂａｓｅ.ＴｈｅＳｔｒｉｎｇｏｎｌｉｎｅｄａｔａｂａｓｅｉｓｕｓｅｄｔｏｃｏｍｐｌｅｔｅＰＰＩｐｒｏｔｅｉｎｎｅｔｗｏｒｋａｎａｌｙｓｉｓ.ＴｈｅＴａｒ￣
ｇｅｔＳｃａｎꎬｍｉＲＴａｒＢａｓｅａｎｄｍｉＲＤＢｗｅｒｅｕｓｅｄｔｏｐｒｅｄｉｃｔｔｈｅｔａｒｇｅｔｅｄｇｅｎｅｓ.ＦｉｎａｌｌｙꎬｔｈｅＰＰＩａｎｄｍｉＲＮＡ￣ｍＲＮＡｒｅｇｕｌａｔｏｒｙｎｅｔｗｏｒｋｓｗｅｒｅｖｉｓｕａｌｉｚｅｄｂｙＣｙｔｏｓｃａｐｅｓｏｆｔｗａｒｅ.㊀Ｒｅｓｕｌｔｓ㊀Ｗｅｏｂｔａｉｎｅｄ１５ｄｉｆｆｅｒ￣ｅｎｔｉａｌｍｉＲＮＡｓａｎｄ１７４ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙｅｘｐｒｅｓｓｅｄｇｅｎｅｓｔｈｒｏｕｇｈｓｃｒｅｅｎ￣ｉｎｇ.ＴｈｅＧＯｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔａｎａｌｙｓｉｓｍａｉｎｌｙｆｏｃｕｓｅｄｏｎｄｒｕｇｒｅｓｐｏｎｓｅꎬ
ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓꎬｉｏｎｔｒａｎｓｐｏｒｔꎬｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｏｆｓｍａｌｌＧＴＰａｓｅｍｅｄｉａｔｅｄｓｉｇ￣
ｎａｌｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎꎬａｄａｐｔｉｖｅｉｍｍｕｎｅｒｅｓｐｏｎｓｅꎬｅｔｃ.ＮＦ￣κＢｓｉｇｎａｌｉｎｇｐａｔｈｗａｙａｎｄＨＩＦ￣１ｓｉｇｎａｌｗｅｒｅｏｂｔａｉｎｅｄｔｈｒｏｕｇｈＫＥＧＧｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔａｎａｌｙｓｉｓ.Ｗｅｏｂｔａｉｎｅｄ１０ｈｕｂｇｅｎｅｓｔｈｒｏｕｇｈｔｈｅｃｙｔｏｈｕｂｂａｐｌｕｇ￣ｉｎ.Ｗｅａｌｓｏｏｂｔａｉｎｅｄ３０６５ｔａｒｇｅｔｅｄｇｅｎｅｓｂｙｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇｏｆｓｅｖｅｎｍｉＲ￣ＮＡｓꎬａｎｄｔｈｅｎｉｎｔｅｒｓｅｃｔｅｄｔｈｅｍｗｉｔｈ１７４ＤＥＧｓｔｏｏｂｔａｉｎ４４ｉｎｔｅｒｓｅｃｔｉｏｎｇｅｎｅｓ.ＦｉｎａｌｌｙꎬｗｅｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄａｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｍａｐｏｆｍｉＲＮＡ￣ｍＲＮＡｎｅｔｗｏｒｋ.ＴｈｅｍｉＲ￣１９４￣５ｐｉｓｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｕｐ￣ｒｅｇｕｌａｔｅｄｉｎｏｓｔｅｏｐｏｒｏｓｉｓ.㊀Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ㊀ＴｈｅｍｉＲ￣１９４￣５ｐｍｉｇｈｔｐｌａｙａｎｉｍｐｏｒｔａｎｔｒｏｌｅｉｎｏｓｔｅｏｐｏｒｏｓｉｓｂｙｒｅｇｕｌａｔｉｎｇｉｔｓｔａｒｇｅｔｇｅｎｅＣＤＨ２ꎬｗｈｉｃｈｐｒｏｖｉｄｅｓｃａｎｄｉｄａｔｅｔａｒｇｅｔｓｆｏｒｔｈｅｄｉａｇｎｏｓｉｓａｎｄｔｒｅａｔｍｅｎｔｏｆｏｓ￣ｔｅｏｐｏｒｏｓｉｓ.
㊀㊀[Ｋｅｙｗｏｒｄｓ]㊀ｏｓｔｅｏｐｏｒｏｓｉｓꎻｍｉＲＮＡꎻｒｅｇｕｌａｔｏｒｙｎｅｔｗｏｒｋꎻＧＥＯｄａｔａｂａｓｅ
０㊀引㊀㊀言
㊀㊀骨质疏松症是一种以骨量低和骨组织微结构破坏为特征的全身性代谢性的骨骼疾病ꎬ其容易导致骨脆性增加和骨折易感性[１－２]ꎮ随着国内人口老龄化的增加ꎬ骨折是医疗保健成本和社会负担的主要原因[３]ꎮ自２０００年以来ꎬｍｉｃｒｏＲＮＡｓ(ｍｉＲＮＡｓ)被认为是人类基因表达中一类独特的生物调节因子ꎬ对ｍｉＲＮＡｓ的研究也不断深入[４]ꎮＭｉＲＮＡｓ是一类比较短的非编码ＲＮＡ分子ꎬ调控转录后基因的表达ꎮＭｉＲＮＡｓ是由Ｄｒｏｓｈａ酶通过初级ｍｉＲＮＡ(ｐｒｉｍａ￣ｒｙｍｉＲＮＡｓꎬｐｒｉ￣ｍｉＲＮＡ)加工形成前体ｍｉＲＮＡ(ｐｒｅ￣ｍｉＲＮＡ)ꎬ再通过Ｄｉｃｅｒ酶进一步加工生成成熟的ｍｉＲＮＡ[５]ꎮ对ｍｉＲＮＡ的研究主要集中在组织水平ꎬ并发现与疾病有关ꎬ如癌症㊁心血管疾病㊁阿尔茨海默病等ꎬ但是迄今为止尚未充分了解ｍｉＲＮＡ在骨质疏松症和肌肉减少症中的作用ꎮ
㊀㊀生物信息学分析和基因芯片分析技术已被广泛应用于筛查遗传基因组㊁转录组水平的改变[６－７]ꎬ这有利于确定差异表达基因及其功能ꎮ本研究旨在筛选与骨质疏松症密切相关的ｍｉＲＮＡ和基因ꎬ完成骨质疏松症ｍｉＲＮＡ￣ｍＲＮＡ调控网络的构建ꎮ
１㊀材料与方法
１.１㊀基因芯片信息㊀从ＮＣＢＩ￣ＧＥＯ数据库中获得骨质疏松症和非骨质疏松症中的基因芯片表达谱ꎬ包括ＧＳＥ６４４３３和ＧＳＥ５６１１６ꎬ其中ＧＳＥ６４４３３包含２３例绝经后骨量减少女性和２５例绝经后骨质疏松症女性全血中的ｍｉＲＮＡ表达数据ꎮＧＳＥ５６１１６包含１０例绝经后骨质疏松症患者ꎬ３例健康绝经后妇女外周血的ｍＲＮＡ表达数据ꎮ
１.２㊀ＤＥＧｓ和差异ｍｉＲＮＡ的数据处理㊀骨质疏松症样本和正常样本之间的差异表达基因通过ＧＥＯ２Ｒ在线工具确定ꎮ其中差异表达ｍｉＲＮＡ的筛选条件为｜ｌｏｇＦＣ｜>１并调整Ｐ<０.０５ꎬ差异表达基因的筛选条件为｜ｌｏｇＦＣ｜>１并调整Ｐ<０.０１ꎮ
１.３㊀ＧＯ和ＫＥＧＧ分析㊀使用ＤＡＶＩＤ６.８(ｈｔ￣ｔｐ://ｄａｖｉｄ.ｎｃｉｆｃｒｆ.ｇｏｖ)在线数据库进行生物学分析差异表达基因的功能[８]ꎮＰ<０.０５为差异有统计学意义ꎮ
１.４㊀ＰＰＩ网络和ｃｙｔｏｈｕｂｂａ分析㊀ＰＰＩ网络信息通过在线工具ＳＴＲＩＮＧ(检索相互作用基因的检索工具)进行分析ꎬ筛选条件ｍｅｄｉｕｍｃｏｎｆｉｄｅｎｃｅ>０.４ꎬ然后应用Ｃｙｔｏｓｃａｐｅｖ３.７.０软件构建差异表达基因的ＰＰＩ网络[９]ꎮ使用ｃｙｔｏｈｕｂｂａ插件进行计算ꎬ最终通过ＭＣＣ算法筛选出ｔｏｐ１０的基因[１０]ꎮ
１.５㊀ｍｉＲＮＡ靶基因预测㊀借助ＴａｒｇｅｔＳｃａｎ㊁ｍｉＲ￣ＴａｒＢａｓｅ和ｍｉＲＤＢ平台预测ｍｉＲＮＡ靶基因ꎬ采取任意２个数据库交集的结果作为该ｍｉＲＮＡ的靶基因[１１－１３]ꎮ
１.６㊀ｍｉＲＮＡ￣ｍＲＮＡ调控网络构建㊀借助ｃｙｔｏ￣ｓｃａｐｅ软件构建ｍｉＲＮＡ￣ｍＲＮＡ调控网络图ꎬｍｉＲＮＡ和ｍＲＮＡ作为节点ꎬｍｉＲＮＡ和ｍＲＮＡ的相互关系为连线ꎬ正方形代表ｍｉＲＮＡꎬ椭圆形代表ｍｉＲＮＡꎬ红色代表差异表达上调ꎬ蓝色代表差异表达下调ꎮ
２㊀结㊀㊀果
２.１㊀骨质疏松症中差异表达基因和ｍｉＲＮＡ的鉴定通过筛选得到１５个差异ｍｉＲＮＡꎬ其中上调的差异ｍｉＲＮＡ有８个ꎬ下调的差异ｍｉＲＮＡ有７个ꎮ总共得到１７４个差异基因ꎬ其中上调的差异表达基因有１２８个ꎬ下调的差异表达基因有４６个ꎮ见图１ꎮ２.２㊀骨质疏松症差异表达基因ＧＯ和ＫＥＧＧ通路分析㊀通过ＧＯ和ＫＥＧＧ通路分析得到２５条ＧＯ功能注释ꎬ生物过程包括对药物的反应㊁血管生成㊁经典Ｗｎｔ信号通路㊁离子转运㊁小ＧＴＰ酶介导的信号转导的调节㊁适应性免疫应答㊁泌乳㊁肽基酪氨酸磷酸化的正调节㊁解剖结构形态发生㊁细胞迁移的负调节㊁单一生物细胞￣细胞黏附㊁神经上皮细胞分化㊁血管形态发生㊁受体内化的正调节㊁阳性趋化㊁Ｗｎｔ信号通路的正调节㊁细胞氨基酸代谢过程和胚胎后相机型眼发育ꎮ细胞成分包括细胞骨架㊁突触㊁Ｔ细胞受体复合物和免疫突触ꎮ分子功能包括蛋白质同二聚化活性㊁ＧＴＰ酶激活剂活性和化学引诱活性ꎮ３条ＫＥＧＧＰＡＴＨＷＡＹ包括ＮＦ￣κＢ信号通路㊁ＨＩＦ￣１信号通路和谷胱甘肽代谢ꎮ见表１ꎮ
ａｂ
㊀㊀㊀ａ:差异ｍｉＲＮＡ火山图ꎻｂ:差异基因火山图
图１㊀骨质疏松症中的差异ｍｉＲＮＡ及基因火山图
Ｆｉｇｕｒｅ１㊀ＶｏｌｃａｎｏｍａｐｏｆｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｍｉＲＮＡｓｏｒｇｅｎｅｓ
表１㊀骨质疏松症差异表达基因的ＧＯ和ＫＥＧＧ富集分析
Ｔａｂｌｅ１㊀ＧＯａｎｄＫＥＧＧｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔａｎａｌｙｓｉｓｏｆＤＥＧｓ
项目名称基因数差异倍数Ｐ值ＧＯ富集分析
㊀ＧＯ:００４２４９３对药物的反应７２.８４３０.０３６㊀ＧＯ:０００１５２５血管生成６３.３２２０.０３４㊀ＧＯ:００６００７０经典的Ｗｎｔ信号通路５７.４３８０.００４㊀ＧＯ:０００６８１１离子迁移５４.８６１０.０１９㊀ＧＯ:００５１０５６ＧＴＰａｓｅ介导的信号转导的调控５４.６０７０.０２３㊀ＧＯ:０００２２５０适应性免疫反应５４.１７１０.０３２㊀ＧＯ:０００７５９５哺乳期４１１.７５９０.００５㊀ＧＯ:００５０７３１肽基酪氨酸磷酸化的正调控４６.０２３０.０２８㊀ＧＯ:０００９６５３解剖结构形态发生４５.３６８０.０３８㊀ＧＯ:００３０３３６细胞迁移的负调控４５.１９９０.０４１㊀ＧＯ:００１６３３７单个生物细胞间粘附４４.８９００.０４８㊀ＧＯ:００６０５６３神经上皮细胞分化３５２.９１６０.００１㊀ＧＯ:００４８５１４血管形态发生３２１.７８９０.００８㊀ＧＯ:０００２０９２受体内在化的正调控３１５.４３４０.０１６㊀ＧＯ:００５０９１８趋化性３１０.５８３０.０３２㊀ＧＯ:００３０１７７Ｗｎｔ信号通路的正调控３１０.２８９０.０３４㊀ＧＯ:０００６５２０细胞氨基酸代谢过程３９.２６００.０４１㊀ＧＯ:００３１０７７胚胎后相机型眼睛发育２６１.７３５０.０３２㊀ＧＯ:０００５８５６细胞骨架８２.６５５０.０３１㊀ＧＯ:００４５２０２突触６４.０８２０.０１６㊀ＧＯ:００４２１０１Ｔ细胞受体复合物３２０.５２３０.００９㊀ＧＯ:０００１７７２免疫突触３１０.８６５０.０３１㊀ＧＯ:００４２８０３蛋白质均二聚活性１２２.０７１０.０２９㊀ＧＯ:０００５０９６ＧＴＰ酶激活剂活性８３.６１２０.００７㊀ＧＯ:００４２０５６化学吸引活性３１３.９９８０.０１９ＫＥＧＧ富集分析
㊀ｈｓａ０４０６４ＮＦ－κＢ信号通路４４.４５５０.０５８㊀ｈｓａ０４０６６ＨＩＦ－１信号通路４４.０３７０.０７４
㊀ｈｓａ００４８０谷胱甘肽代谢３５.６９９０.０９５
２.３㊀蛋白质￣蛋白质相互作用网络(ＰＰＩ)和ｈｕｂ基因分析㊀蛋白质￣蛋白质相互作用网络得到８８个节点㊁１００条边ꎬ通过ｃｙｔｏｈｕｂｂａ插件得到１０个ｈｕｂ基因ꎬ分别为:ＣＤＨ２㊁ＰＯＬＲ２Ａ㊁ＫＬＦ４㊁ＣＣＮＤ１㊁ＳＯＸ４㊁ＮＣＢＰ２㊁ＶＥＧＦＡ㊁ＰＫＬＲ㊁ＥＰ３００㊁ＨＮＲＮＰＬꎮｈｕｂ基因网络得到１０个节点㊁２２条边ꎮ见图
３ꎮ
㊀㊀㊀
ａ:ＤＥＧｓＰＰＩ网络构建ꎻｂ:前１０的ｈｕｂ基因
㊀㊀㊀图示红色ｃｙｔｏｈｕｂｂａ插件得分最高ꎬ黄色次之ꎬ蓝色最低
图２㊀骨质疏松症靶基因的ＰＰＩ网络
Ｆｉｇｕｒｅ２㊀ＰＰＩｎｅｔｗｏｒｋｏｆｔｈｅｔａｒｇｅｔｇｅｎｅｓ２.４㊀ｍｉＲＮＡ靶基因和交集基因㊀对ｌｏｇＦＣ值比较大的７个ｍｉＲＮＡ进行构建ｍｉＲＮＡ￣ｍＲＮＡ网络调控图ꎬ７个ｍｉＲＮＡ(２个上调的ｍｉＲＮＡꎬ５个下调ｍｉＲ￣ＮＡ)分别为:ｈｓａ￣ｍｉＲ￣１８ｂ￣５ｐꎬｈｓａ￣ｍｉＲ￣１９４￣５ｐꎬｈｓａ￣ｍｉＲ￣４７６８￣３ｐꎬｈｓａ￣ｍｉＲ￣４２６９ꎬｈｓａ￣ｍｉＲ￣４７１７￣３ｐꎬｈｓａ￣ｍｉＲ￣６２９￣３ｐꎬｈｓａ￣ｍｉＲ￣４７９３￣３ｐꎮ通过预测到３０６５个靶基因ꎬ然后与１７４个ＤＥＧｓ交集得到４４个交集基因ꎬ见图４ꎬ分别为:ＡＴＸＮ７ꎬＥＰ３００ꎬＮＦＩＣꎬＤＩＳＣ１ꎬＣＣＤＣ８８ＡꎬＳＬＣ４０Ａ１ꎬＱＤＰＲꎬＶＥＧＦＡꎬＣＰＭꎬＭＰＺＬ２ꎬＫＩＦ２６ＢꎬＩＴＰＲＩＰＬ２ꎬＡＶＬ９ꎬＺＮＦ４４５ꎬＲＡＳＳＦ４ꎬＥＲＣ１ꎬＡＰＯＬ４ꎬＡＬＣＡＭꎬＧＩＮＳ４ꎬＰＲＫＤ３ꎬＵＭＰＳꎬＧＳＴＭ１ꎬＣＵＥＤＣ１ꎬＣＳＮＫ２Ａ１ꎬＫＩＡＡ１４５６ꎬＳＬＣ３１Ａ１ꎬＳＨＩＳＡ９ꎬＳＲＧＡＰ１ꎬＣ１ｏｒｆ１１５ꎬＰＰＡＲＧＣ１ＢꎬＲＲＥＢ１ꎬＲＡＬＧＡ￣ＰＡ２ꎬＰＴＰＲＥꎬＲＡＳＡＬ２ꎬＧＳＧ１ＬꎬＢＴＮ３Ａ１ꎬＰＡＲＤ３ＢꎬＲＢＰＪＬꎬＭＩＳＰꎬＣＰＮＥ６ꎬＫＣＮＨ１ꎬＲＮＦ１２５ꎬＣＤＨ２ꎬＭＡＰ９ꎮ
２.５㊀ｍｉＲＮＡ￣ｍＲＮＡ调控网络㊀通过ｃｙｔｏｓｃａｐｅ软件对ｍｉＲＮＡ￣ｍＲＮＡ调控网络进行构建ꎬ可以发现ｈｓａ￣ｍｉＲ￣４７６８￣３ｐ关联的靶基因最多ꎬｈｓａ￣ｍｉＲ￣１８ｂ￣５ｐ关联的靶基因最少ꎮｈｓａ￣ｍｉＲ￣１９４￣５ｐ的靶基因多为表达上调ꎬｈｓａ￣ｍｉＲ￣４２６９靶基因多为表达下调ꎮ见图
５ꎮ
图４㊀骨质疏松症差异表达基因和预测的靶基因交集结果Ｆｉｇｕｒｅ４㊀ＩｎｔｅｒｓｅｃｔｉｏｎｒｅｓｕｌｔｏｆＤＥＧｓａｎｄｐｒｅｄｉｃｔｅｄｔａｒｇｅｔ
ｇｅｎｅｓ
㊀㊀㊀
红色㊁蓝色:分别为上调㊁下调
图５㊀骨质疏松症ｍｉＲＮＡ￣ｍＲＮＡ调控网络Ｆｉｇｕｒｅ５㊀ｍｉＲＮＡ￣ｍＲＮＡｒｅｇｕｌａｔｏｒｙｎｅｔｗｏｒｋ
３㊀讨㊀㊀论
㊀㊀本研究选取了人血液ｍｉＲＮＡ和基因芯片ꎬ其中ＧＳＥ６４４３３包括２３例绝经后骨量减少女性和２５例绝经后骨质疏松症女性全血中的ｍｉＲＮＡ表达数据ꎬ
ＧＳＥ５６１１６包括１０例绝经后骨质疏松症患者和３例健康绝经后妇女外周血的ｍＲＮＡ表达数据ꎬ通过比较共找出１５个差异ｍｉＲＮＡ和１７４个差异表达基因ꎮ据报道ꎬｈｓａ￣ｍｉＲ￣１９４￣５ｐ在骨质疏松症妇女中表达增强[１４]ꎮ本研究发现的差异ｍｉＲＮＡ中ꎬｈｓａ￣ｍｉＲ￣１９４表达同样是上调的ꎬ因此ꎬｍｉＲ￣１９４￣５ｐ很可能是骨质疏松症的可行生物标记物ꎮ
㊀㊀研究表明ｍｉＲＮＡ与疾病的关系对骨质疏松症疾病的诊断及治疗具有比较重要的意义[１５－１６]ꎮＭｉ￣ｃｒｏＲＮＡ(ｍｉＲＮＡ)已显示出增强或抑制骨组织中不同细胞类型的细胞增殖㊁分化和活性ꎮｍｉＲＮＡ行为及其靶点的发现有助于将它们识别为骨骼中的最新
调控者ꎮ研究表明ꎬｍｉＲＮＡ失调介导骨相关病变的进展ꎬ例如椎间盘退变和骨质疏松症[１７－１８]ꎮ相关研究表明ｍｉＲ￣１９４￣５ｐ可以作为骨质疏松症的生物标志物[１４－１９]ꎬ而对于骨质疏松症与ｍｉＲ￣１８ｂ￣５ｐ的相关研究比较少ꎬ对于骨质疏松症与ｍｉＲ￣４７６８￣３ｐ㊁ｍｉＲ￣４２６９㊁ｍｉＲ￣４７１７￣３ｐ㊁ｍｉＲ￣６２９￣３ｐ㊁ｍｉＲ￣４７９３￣３ｐ的相关研究几乎没有ꎬ这为我们提供新的研究方向ꎮ本研究进一步把１０个ｈｕｂ基因与４４个交集基因匹配后发现３个重叠基因ꎬ分别是ＣＤＨ２㊁ＶＥＧＦＡ㊁ＥＰ３００ꎮ目前研究表明血管内皮因子加速骨形成及重建过程ꎬ直接促进ＢＭＳＣｓ及增加成骨细胞的成骨活性ꎬ降低破骨细胞溶骨活性来促进骨形成及增加骨密度[２０]ꎮ根据ｍｉＲＮＡ与ｍＲＮＡ的竞争关系进行筛选ꎬ本研究得到与ｍｉＲ￣１９４￣５ｐ存在负相关关系的基因是ＣＤＨ２㊁ＲＮＦ１２５ꎬ正相关关系的是ＤＩＳＣ１㊁ＥＰ３００㊁ＭＰＺＬ２㊁ＳＬＣ４０Ａ１ꎬ与ＶＥＧＦＡ存在负相关关系的ｍｉＲＮＡ是ｍｉＲ￣４７９３￣３ｐꎮ所以ｍｉＲ￣１９４￣５ｐ￣ＣＤＨ２㊁ｍｉＲ￣１９４￣５ｐ￣ＲＮＦ１２５和ｍｉＲ￣４７９３￣３ｐ￣ＶＥＧＦＡ这３条ｍｉＲＮＡ￣ｍＲＮＡ调控网络值得我们后续的验证并深入探讨其与骨质疏松症的关系ꎮ同理ꎬ对于筛选到的其它ｍｉＲＮＡ及其对应的基因所构成的ｍｉＲＮＡ￣ｍＲＮＡ调控网络我们也可以进一步验证ꎮ㊀㊀ＧＯ与ＫＥＧＧ分析有助于更深入地认识并筛选出ＤＥＧｓ的功能和作用ꎮＧＯ富集分析主要药物的反应㊁血管生成㊁经典Ｗｎｔ信号通路等ꎮ相关研究证明了血管生成在骨骼发育和修复中起着关键作用[２１]ꎮＷｎｔ信号通路是涉及各种生物过程的多方面作用的主要信号传导途径ꎬ骨骼是能够重塑和维持组织稳态的动态组织ꎬＷｎｔ信号级联导致促进骨形成和抑制骨吸收ꎬ导致骨重建的平衡ꎮＷｎｔ信号通路是骨质疏松症发生发展的重要途径[２２]ꎮＫＥＧＧ富集分析发现ＮＦ￣κＢ信号通路㊁ＨＩＦ￣１信号通路和谷胱甘肽代谢这３条信号通路ꎮ参与ＮＦ￣κＢ信号通路的差异基因包括ＢＣＬ１０ꎬＣＳＮＫ２Ａ１ꎬＥＲＣ１ꎬＳＹＫꎮ参与ＨＩＦ￣１信号通路的差异基因包括ＥＰ３００ꎬＶＥＧＦＡꎬＨＫ２ꎬＩＬ６Ｒꎮ转录因子ＮＦ￣κＢ是参与正常细胞功能和发育所必需的信号传导途径的蛋白质家族ꎮ删除该途径的各种组分导致骨骼发育异常ꎮ既往研究已经确定ＮＦ￣κＢ信号传导介导ＲＡＮＫ配体诱导的破骨细胞生成ꎬ抑制ＮＦ￣κＢ是抑制破骨细胞形成和骨再吸收活性的有效方法[２３－２４]ꎮ越来越多的证据表明ＨＩＦ￣１α促进破骨细胞形成㊁增强破骨活性的重要作用[２５]ꎬＨＩＦ￣１α是细胞对缺氧的适应性反应的关键介质ꎬ缺氧/ＨＩＦ￣１α抑制成骨细胞增殖ꎬ并且ＨＩＦ￣１α与Ｏｓｘ在抑制Ｗｎｔ途径方面具有协同作用ꎬＨＩＦ￣１α通过激活成骨细胞中的Ｓｏｓｔ表达来抑制Ｗｎｔ信号通路[２６－２８]ꎮ
㊀㊀应用人类基因表达芯片探索基因表达谱的差异ꎬ本研究中ꎬ预测了７个具有显着差异表达的ｍｉＲＮＡ和核心基因ꎬ为骨质疏松症的研究提供了新的视角ꎮ但是ꎬ研究结果所得到的ｍｉＲＮＡ￣ｍＲＮＡ调控网络与骨质疏松症的关系需要更多的研究证据验证ꎬ随着未来对骨质疏松症的核心基因和ｍｉＲＮＡ的不断深入研究ꎬ本研究筛选的差异基因和ｍｉＲＮＡ有可能成为骨质疏松症的潜在生物标志物和关键靶点ꎬ这些有助于骨质疏松症的治疗药物开发和研究ꎬ并对骨质疏松症的诊断和治疗提供新的诊断靶点和治疗方向ꎮ另外ꎬ可以基于上述核心基因和ｍｉＲＮＡ来开发遗传致病因子的筛选点和相应的分子靶向药物ꎬ最终应用于骨质疏松症患者个体化治疗ꎮ
ʌ参考文献ɔ
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(收稿日期:２０１９￣０９￣１２ꎻ㊀修回日期:２０１９￣１１￣１７)
(责任编辑:杨建鑫ꎻ㊀英文编辑:彭世富)。