第20章重组DNA技术

dNTP nppi
OH 5′ 3′
用途：
Co2+ dNTP nppi 5′
(A/G/C/T)n 3′
（1）主要作用是在载体或目的基因 3’末端加上 同源多聚尾巴，形成人工黏性末端，便于DNA重组。
（2）DNA 3’末端的同位素标记。
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（二）碱性磷酸酶 （alkaline phosphatase） 能特异地切除DNA、RNA和dNTP上5’-磷酸基团。
——基因工程的手术刀---- “切”
是一类能识别双链DNA中的某些特定核苷酸序 列，并由此切割DNA双链的核酸内切酶，又称为限 制酶（restriction enzyme）。主要是从原核生物 中分离纯化而来。
与甲基化酶共同构成细菌的限制修饰系统，限 制外源DNA，保护自身DNA。
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载体应具备的基本条件：
① 含有复制起始点，具有自主复制的能力；
② 具有多个单一酶切位点，称为多克隆位点；
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
③ 具有一个以上的选择性遗传标记，便于重组体 的筛选和鉴定；
④ 分子质量相对较小，以容纳较大的外源DNA；
⑤ 拷贝数较多，易于与受体细胞的染色体DNA分开；
⑥ 具有较高的遗传稳定性。
Bam HⅠ
GGATCC CCTAGG
Bg lⅡ
AGATCT TCTAGA
G CCTAG
+
GATCC G
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A TCTAG
+
GATCT A
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4.可变酶
识别DNA序列中的一个或几个碱基是可变的，并且 识别序列往往超过6个核苷酸。为Ⅱ型限制酶的特例。
如： BstpⅠ GGTNACC CCANTGG
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（二）限制酶的分类：
Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ型（基因工程技术中常用Ⅱ型）。
Ⅰ和Ⅲ型限制酶通常是相对分子量较大的多亚 基蛋白质复合物，同时具有内切酶和甲基化酶活性， 反应过程中需有Mg2+和ATP参与。
Ⅱ型限制酶通常以同源二聚体形式存在，只具 有核酸内切酶活性而无甲基化酶活性，反应过程中 只需有Mg2+参与而不需有ATP参与。
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一、 限制性核酸内切酶
（一）限制酶的命名：
Hind Ⅲ
Haemophilus influenzae d株 流感嗜血杆菌 d株的第三种酶
属种株序
第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写斜体； 第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写斜体； 第四个字母代表株； 用罗马数字表示发现的先后次序。
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克隆(clone)：
指从同一始祖经无性繁殖传代而来的一群遗传 上同一的DNA分子、细胞或个体；
克隆化(cloning)：
获取这类同一的DNA分子群体、细胞群体或个体 群体的过程，即无性繁殖。
重组DNA(recombinant DNA,)：
又称嵌合DNA（chimera DNA），采用克隆技术把 来自不同生物的外源 DNA插入载体分子所形成的杂合 DNA分子。
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二、DNA重组技术基本程序
思考题 1
分－－ 分离目的基因并进行必要的改造 切－－ 限制酶切目的基因与载体 接－－ 拼接目的基因与载体成重组载体 转－－ 将重组载体转导入受体细胞 筛－－ 筛选出含重组DNA的细胞等
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重组DNA技术的基本过程（1）
苷酸转移到单链或双链DNA分子的3′-OH末端上。
(1) 底物是单链DNA或有3′突出末端的双链 DNA。
5′
OH
Co2+
3′ dNTP
nppi 5′
3′(A/G/C/T)n
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(2) 底物是3’平端或3’凹端的双链DNA。
5′
3′
OH
Co2+
5′
3′
(A/G/C/T)n
是在体外将不同来源的特异基因或 DNA片段插 入载体分子，构建成重组 DNA分子；并将它导入到 合适的受体细胞，使其在细胞中扩增和繁殖，筛选 出含有目的基因的转化子细胞；再进行扩增、获取 大量同一DNA分子。
亦称DNA克隆(DNA cloning)，或基因克隆(gene cloning)。
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具有53聚合酶， 35核酸外切酶活性。
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（三）Taq DNA聚合酶
是第一个被发现的、耐热的、依赖DNA的DNA聚 合酶， 最佳反应温度为70~75℃。
具有53聚合酶，53 核酸外切酶活性， 对Mg2+浓度非常敏感。
（四）反转录酶：依赖RNA的DNA聚合酶。
+ OH— GA*************
3′
5′
Alu I
T4 DNA 连接酶
5′
3′
*************AGCT**************
*************TCGA**************
3′
5′
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（二）DNA连接酶的应用及影响因素： 1. DNA连接酶应用
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三、DNA聚合酶
能够催化以DNA或RNA为模板合成DNA的反应， 把脱氧核糖核苷酸连续地添加到双链DNA分子或引 物链的3´-OH末端，催化核苷酸的聚合作用。
（一）大肠埃希菌DNA聚合酶Ⅰ
具有53聚合酶， 53 及35核酸外切 酶活性。
（二）Klenow片段
底物。需要NAD+作为辅助因子。
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连接黏性末端作用模式图：
5′
3′
5′
3′
*********G —OH
P — A A T T C*********
+ *********C T T A A — P
OH— G*********
3′
5′
3′
5′
DNA EcoR I 连接酶
5′
3′
*******GAATTC**********
*******CTTAAG**********
3′
5′
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连接平末端作用模式图：
5′
3′
************TC —OH
************AG — P
3′
5′
5′
3′
P — CT*************
多聚核苷酸激酶 催化多聚核苷酸5´羟基末端磷酸化，或标记探针
末端转移酶
在3´羟基末端进行同质多聚物加尾
碱性磷酸酶
切除末端磷酸基
第三节
重组DNA技术中常用载体
Common Vectors in Recombinant DNA Technology
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载体（vector）的概念
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重组DNA技术中常用载体：
一、质粒载体：最常用的目的基因克隆载体
二anger双脱氧DNA测序(自 习粘) 粒载体：用于克隆大片段DNA(自习)
普遍使用的是来源于AMV(鸟类成髓细胞白血 病病毒)及M-MLV(莫洛尼鼠白血病病毒)的反转录 酶，具有53聚合酶。
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四、其它修饰酶
（一）末端脱氧核苷酸转移酶
（terminal deoxynucleotidyl transferase） 是一种无需模板的DNA聚合酶，催化脱氧核糖核
第二十章
重组DNA技术
recombinant DNA technique
第一节
重组DNA技术的基本过程 Basic Process of Recombinant DNA Technology
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一、重组DNA技术相关概念
重组DNA技术（Recombinant DNA Technology）：
时间及缓冲液体系等。
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二、DNA连接酶 (DNA ligase)
——基因工程的缝纫针 ----“接” 是一种能够催化在两条DNA链之间形成磷酸二酯 键的酶。
需要在一条DNA链的3末端具有游离的羟基、另 一条DNA链的5末端有磷酸基团，而且反应过程需要 由ATP提供能量。
如： Bbl Ⅰ CGGN(N)4CCG; GCC(N)4NGGC
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（四）限制酶的应用及影响因素
1.限制酶的应用 重组DNA技术、基因组DNA物理图谱绘制、基因组
DNA同源性研究、切割基因组DNA纯度、结构及甲基度程度；酶切反应的温度、
（三）多核苷酸激酶 （polynuleotide kinase）
又称T4多核苷酸激酶，能催化ATP的γ -磷酸基 团转移到DNA或RNA片段的5’-OH末端。
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重组DNA技术中常用的工具酶
工具酶
功
能
限制性核酸内切酶 识别特异序列，切割DNA
DNA连接酶
催化DNA中相邻5´磷酸和3´羟基间形成磷酸二酯键， 使DNA切口封合或使两个DNA分子或片段连接
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2.同裂酶
来源不同但能识别相同序列，切割 DNA后产生 相同的黏性末端的限制酶，又称同功异源酶。
Bam HⅠ
GGATCC CCTAGG
BstⅠ
GGATCC CCTAGG
+ G
GATCC
CCTAG
G
G
+ GATCC
CCTAG
G
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3.同尾酶
识别序列不完全相同，但切割 DNA后，产生相同的黏 性末端的限制酶称为同尾酶。这两个相同的黏性末端称为 配伍未端(compatible end)。
DNA聚合酶Ⅰ
①缺口合成；②双链cDNA分子或片段连接；③平移 制作高比活探针；④DNA序列分析；⑤填补3´末端
Klenow片段 反转录酶
DNA聚合酶I大片段，具有DNA聚合酶I的53聚合、 35外切活性，而无53外切活性。 常用于cDNA第二链合成，双链DNA 3末端标记
①合成cDNA；②替代DNA聚合酶I进行填补，标记或 DNA序列分析
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（三）Ⅱ型限制酶的作用特点： 思考题 2 1.基本特性：
大部分Ⅱ型限制酶都能识别由4~8个核苷酸组 成的特定序列。
Ⅱ类酶识别序具有回文结构(palindrome)特点， 即具有双重旋转对称结构的DNA反向重复双链序列。
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图20-3 限制酶EcoRⅠ对双链DNA分子的切割作用
只能封闭DNA链上的缺口（nick）,而不能封闭 裂口（gap）。
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（一）DNA连接酶的类型：
1.T4 DNA连接酶
连接的底物可以是两个双链DNA分子的互补黏性 末端或平末端。最早是从T4噬菌体感染的大肠埃希 菌分离，易制备，应用广。
2.大肠埃希菌DNA连接酶 只能连接具有互补黏性末端的两个双链DNA分子
① 催化两个具有黏性末端或平末端的DNA片段形成 磷酸二酯键，形成新的重组DNA分子；
② 接合由复制叉上不连续复制链上产生的缺口； ③ 缝合DNA损伤修复、遗传重组及DNA链剪接中缺口。
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2. 影响DNA连接酶作用的因素
① 对黏性末端的连接效率远高于对平末端的连接； ② 连接黏性末端的温度一般在4~15℃； ③ 连接酶的用量，平末端连接用量高； ④ ATP浓度一般为0.01~1 mmol/L; ⑤ 载体分子与插入片段的摩尔数比为1:10~1:3。
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切口 ：平端切口、粘端切口
HindⅡ
GTCGAC CAGCTG
Bam HⅠ
GGATCC CCTAGG
GTC CAG
+
GAC CTG
平端切口 平或钝末端（blunt end)
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G CCTAG
+
GATCC G
粘端切口
粘性末端（sticky end)
指能携带外源DNA分子进入受体细胞进行扩增和 表达的运载工具。应具备的基本条件：
克隆载体 (cloning vector)
含有复制起始点oriC，可使插入的外源DNA序列 被扩增或保存的载体。
表达载体 (expression vector)
可使插入的外源DNA片段被转录、翻译成多肽链 的载体。
是在克隆载体的基础上，增添了与宿主细胞相适 应的强启动子，以及有利于表达产物分泌、分离或纯 化的元件。
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重组DNA技术的基本过程（2）思考题 1
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第二节
重组DNA技术中常用工具酶
Common Enzymes Used in Recombinant DNA Technology
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一、 限制性核酸内切酶 （restricton Endonuclease）