阿司匹林对MCF7细胞uPA表达的影响

阿司匹林对MCF7细胞uPA表达的影响

作者：陈绍水宁方玲赵磊纪春祥

【摘要】目的观察阿司匹林对乳腺癌细胞MCF7增殖的影响，探讨阿司匹林新的抗肿瘤作用机制。方法 MTT法检测不同浓度的阿司匹林(2.5、5.0和10.0 mmol/L)作用于人乳腺癌细胞株MCF7不同时间(24、48和72 h)的细胞增殖抑制率；应用Western blot检测阿司匹林对MCF7乳腺癌细胞尿激酶型纤维蛋白溶酶原激活剂(urokinase type plasminogen activator, uPA)表达。结果阿司匹林各剂量组细胞增殖抑制率随药物浓度的增加、作用时间的延长而提高(P＜0.01)；MCF7细胞uPA的蛋白表达量随药物浓度的增加、作用时间的延长而降低。结论阿司匹林有抑制人乳腺癌细胞MCF7增殖的作用, 并且呈时间依赖性和剂量依赖性；阿司匹林可以抑制MCF7细胞的uPA表达，这可能是阿司匹林抗乳腺癌的分子机制之一。

【关键词】阿司匹林；尿激酶型纤维蛋白溶酶原激活剂；乳腺癌细胞MCF7

【Abstract】 Objective To explore the molecular mechanism of anti tumor effects of aspirin on breast cancer cell MCF

7.Methods The human breast cancer cell MCF7 was treated with 2.5, 5.0, and 10.0 mmol ·L-1 aspirin for 24, 48, and 72 h respectively, the inhibitory effect was detected by MTT assay.

Western blot was used to observe the expression of uPA in MCF

7 cells treated by aspirin.Results The inhibitory rate of the MCF

7 cell line treated with aspirin was reduced compared with controls, which was in time and dose dependent manner (P＜0.01). The expression of uPA decreased after treated with aspirin, which also had a time and dose dependence. Conclusion Aspirin has inhibitory effects on the growth of human breast cancer cell MCF7 in a dose and time dependent manner, and inhibits the expression of uPA in breast cancer cells, which is possible one of the molecular mechanisms of aspirin in breast cancer.

【Key words】aspirin,urokinase type plasminogen activator,human breast cancer cell MCF7

非甾体类消炎药(Non steroid anti inflammatory drugs，NSAIDs)在肿瘤防治中的作用越来越受到重视。在对结肠癌、胃癌、食管癌、胰腺癌、肺癌、乳腺癌等多种恶性肿瘤的基础和临床研究中发现，NSAIDs对上述肿瘤均有明显的抑制作用［１，２］。然而，以往的研究方向主要集中在NSAIDs通过对环氧化酶2(cyclooxygenase 2，COX2)的抑制，进而达到对恶性肿瘤的控制［3,4］。尿激酶型纤溶酶原激活物(urokinase type plasminogen activator，uPA)在肿瘤血管生成过程中发挥着重要的作用，在乳腺癌中有较高的表达。本研究通过观察阿司匹林作用于MCF7细胞后uPA表达的变化，进一步探讨阿司匹林对人乳腺癌细胞的生物学效应和可能的作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料①主要试剂: 阿司匹林购于阿斯利康制药有限公司；阿霉素购于浙江海正药业；鼠抗人单克隆uPA抗体(Data Sheet公司)。

②细胞株：MCF7细胞株(中科院上海细胞所)。常规培养于含有10 %小牛血清、100 u青霉素，100 u链霉素的L DMEM培养液中，37℃、5%CO2 培养箱中贴壁培养，当细胞生长至80 %融合时，0.25 %胰蛋白酶消化传代。

1.2 MTT法检测阿司匹林对乳腺癌细胞增殖的抑制率取对数生长期的MCF7细胞，按传代方法制成单细胞悬液，计数，接种于96孔培养板，每孔加细胞悬液100 μl (相当于1×104个细胞)，取不含细胞的培养液作为空白调零。将培养板置于37℃、5%CO2培养箱中贴壁培养24 h后，各孔分别加入含终浓度为

2.5、5.0和10 mmol/L 阿司匹林及含终浓度为0.5、1.0和2.0 μmol/L阿霉素（阳性对照组）的培养液，以不含药物的培养液作为阴性对照组，每组设3个复孔。分别培养24、48和72 h后每孔加0.5% MTT 20 μl，继续培养4 h 后，小心吸除孔内液体，每孔加二甲基亚砜100 μl，震荡10 min后，用酶标仪在490 nm波长处测定各孔的吸光度值(A值)。按下式计算细胞增殖的抑制率: 抑制率(%) = (1－实验组平均A值/对照组平均A 值) ×100 %。

1.3 Western blot分析检测uPA的蛋白表达提取实验各组细胞总蛋白，用Brodford法测定含量后取40 μg总蛋白进行十二烷基磺酸钠

聚丙烯酰胺凝胶电泳并电转移至硝酸纤维素膜(NC)上，将含1%牛血清白蛋白(BSA)和5% tween20的磷酸盐缓冲液(PBST)封闭1 h，应用uPA单抗，生物素化二抗及辣根过氧化物酶(HRP)标记的链酶卵白素三抗孵育后3，3′二氨基联苯胺(DAB)显色。

2 结果

2.1 阿司匹林和阿霉素对乳腺癌细胞增殖的影响阿司匹林和阿霉素各剂量组的抑制率随药物浓度的增加、作用时间的延长而提高，见表1。表１阿司匹林和阿霉素对人乳腺癌细胞MCF7的抑制注：阿司匹林组：F= 7.380，P＜0.01;阿霉素组:F= 11.943，P＜0.01

2.2 阿司匹林对MCF7细胞uPA蛋白表达的影响免疫印迹分析检测蛋白表达结果以NC膜上棕染条带的深浅来判断，条带显色越深，提示该种蛋白表达量较高。Western blot结果显示，MCF7细胞分别经2.5、5.0和10 mmol/L阿司匹林作用24、48、72 h后，uPA 抗体染色条带随药物浓度的增加逐渐变浅；在同一浓度中随着处理时间的延长，染色条带逐渐变浅。表明MCF7细胞uPA表达量与阿司匹林浓度和作用时间相关，阿司匹林能降低MCF7细胞uPA的表达。

3 讨论

近年来，在NSAIDs临床应用与研究的同时，人们发现其有防治肿瘤的作用。1982年Doubilet首次报道了长期服用阿司匹林的人群较普通人群结直肠癌的发病率明显降低，此后数项大样本流行病学研究都得出了类似的结论。据美国俄亥俄州大学的科研人员通过对两千余名妇女的多年观察，其中每周至少服3次阿司匹林达5年的妇女，