六种常用渔药对虹鳟受精卵孵化中水霉菌作用效果的比较

六种常用渔药对虹鳟受精卵孵化中水霉菌作用效果的比较王太;张艳萍;娄忠玉
【摘要】采用试管二倍稀释法测定了6种常用渔药对在实验室分离鉴定的一种水霉菌的最小抑菌浓度(MIC),比较了这6种抗菌渔药对水霉菌的抗菌效果.结果显示,6种渔药对水霉菌的MIC分别为:检科一号39 mg·L-1,复合季胺盐156.2 mg·L-1,孔雀石绿2 500 mg·L-1,聚维酮碘5 000 mg·L-1,甲醛10 000 mg·L-1,而氯化钠在10 000 mg·L-1时仍然有水霉菌生长.6种渔药在10 MIC下,抑菌圈的直径分别为:检科一号1.58 cm,复合季胺盐1.46 cm,孔雀石绿1.48 cm,聚维酮碘1.32 cm,甲醛1.23 cm.由此可以得出,检科一号是一种可以暂替孔雀石绿的对水霉菌有较好抗菌效果的渔药.
【期刊名称】《甘肃农业大学学报》
【年(卷),期】2010(045)004
【总页数】4页(P38-41)
【关键词】渔药;水霉菌;最小抑菌浓度;孔雀石绿
【作者】王太;张艳萍;娄忠玉
【作者单位】甘肃农业大学动物科学技术学院,甘肃,兰州,730070;甘肃农业大学动物科学技术学院,甘肃,兰州,730070;甘肃省水产科学研究所,甘肃,兰州,730000;甘肃省水产科学研究所,甘肃,兰州,730000
【正文语种】中文
【中图分类】S943
由于虹鳟受精卵含有大量的糖蛋白［1］，是水霉菌极易孳生的场所，所以在人工孵化过程中，水霉菌通过吸附、粘结和繁殖，最终在卵表面形成稳定的菌落，然后感染相邻受精卵.一旦受精卵感染水霉菌［2］，不仅会造成孵化率降低，更严重的会造成整批受精卵死亡，给生产厂家造成巨大损失，因此，预防水霉菌是整个孵化生产中重要的环节［3］.以往对受精卵的消毒药物主要采用孔雀石绿，但是自2002年，孔雀石绿被列为水产禁用药物后，长期以来一直未能找到一种能够替代孔雀石绿的消毒渔药［4］.为此，本文对目前市场上常用的6种抗菌渔药对水霉菌的抑制作用效果进行了比较，旨在筛选一种可以替代孔雀石绿的抗水霉菌的渔药.
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌种供试菌为水霉菌科绵霉属菌株［5］，由甘肃省水产科学研究所提供. 1.1.2 仪器设备超净工作台（上海精密仪器仪表有限公司）、恒温培养箱（北京科伟永鑫实验仪器设备厂）、电子天平（上海海康电子仪器厂）、高压灭菌锅（致微仪器有限公司）、移液枪（大龙医疗设备有限公司）等.
1.1.3 察氏培养基硝酸钠3g、磷酸氢二钾1g、硫酸镁0.5g、氯化钾0.5g、硫酸
亚铁0.01g、蔗糖30g、琼脂20g，溶解后定容至1 000mL.
1.1.4 抗菌渔药甲醛（AR）、氯化钠（AR）、聚维酮碘（有效碘1%）、检科一
号（北京陆桥商检新技术公司生产）、复合季胺盐（CP）、孔雀石绿（CP）
1.2 方法
1.2.1 水霉菌悬液的制备［6］用0.01mol·L－1的PBS缓冲液在长有水霉菌的培
养皿中反复冲洗菌苔，经纱布过滤，加入液体培养基，分别将菌量确定为1×106、1×109个·mL－1.
1.2.2 抗菌渔药原液的配制分别称量6种抗菌渔药配制成40mg·mL－1的原液.
1.2.3 最小抑菌浓度的测定采用试管二倍稀释法进行［7］.取无菌试管13支，每
支加入液体培养基1mL，在第1支中加入配好的抗菌渔药原液1mL混合均匀，用移液器吸取1mL至第2支中混匀，照此依次2倍稀释至第11支，并从第11支
中吸取1 mL弃去.然后向1至12号试管中加入水霉菌悬液1mL，向第13支中加入液体培养基1mL.如此第12支为阳性对照，第13支为阴性对照.每一实验做3
次重复，将试管放入26℃恒温培养箱中培养，24h后取出肉眼观察，试管中无水
霉菌生长者为最低抑菌浓度（MIC）.
1.2.4 抑菌圈的测定将抗菌渔药分别配制4个浓度即：MIC、5倍 MIC、10倍MIC、20倍 MIC，将直径为1.0cm的滤纸片分别放入各浓度抗菌渔药中浸泡
10min，用镊子取出，无液体滴下时，粘贴到相应平板上［8］，每种浓度做5个重复.放入26℃恒温培养箱中培养，24h后取出测定结果.
1.2.5 生产检测取7组刚受精的虹鳟鱼卵，分别采用以上所测相应渔药的MIC进
行消毒，每隔3d消毒1次，设对照组不进行消毒，最后统计发眼率.
2 结果与分析
2.1 6种抗菌渔药对水霉菌的最低抑菌浓度的测定
表1可以看出，检科一号的MIC为39 mg·L－1，复合季胺盐的 MIC为
156.2mg·L－1，孔雀石绿的MIC为2500mg·L－1，聚维酮碘的MIC为5
000mg·L－1，甲醛的 MIC为10 000 mg·L－1，而氯化钠在10 000mg·L－1时
仍然有水霉菌生长.第12支阳性对照试管内混浊，第13支阴性对照试管内澄清.
表1 6种抗菌渔药对水霉菌的最低抑菌浓度Tab.1 Minimal inhibitory concentrations（MIC）of 6fish drugs注：“－”表示澄清；“±”表示半混浊；“＋”表示混浊.?
2.2 6种抗菌渔药浓度与抑菌圈直径的关系
由图1可以看出，随着渔药浓度的增大，抑菌效果逐渐明显，在MIC浓度时，6
种抗菌渔药的抑菌圈均为1cm，在5倍MIC下，孔雀石绿和复合季胺盐的抑菌效果最为明显，多数抗菌渔药在10倍MIC时抑菌圈直径开始出现差异，且随着浓度的增加抑菌圈直径明显增加.而氯化钠在20倍MIC时仍无抑菌效果.一般组织中的药物浓度比血药浓度低，血药浓度要比MIC高出10倍才能产生有效的治疗效果［9］，选用在10倍MIC浓度下的抑菌圈直径为参数，得出6种药物的抑菌效果为：检科一号＞孔雀石绿＞复合季胺盐＞聚维酮碘＞甲醛＞氯化钠.由此在理论上可以认为检科一号对水霉菌有很好的杀菌效果，是替代孔雀石绿的首选药物.
图1 6种抗菌渔药浓度与抑菌圈直径之间的关系Fig.1 The relation between the concentrations of 6 fish drugs and inhibition zone
2.3 不同菌量对抗菌渔药MIC的影响
在实验过程中，采用了2种不同浓度的水霉菌原液（1×106、1×109个·mL－1）来进行，结果显示，2种菌量测得的MIC具有一致性，并未因为水霉菌浓度的不同而不同.说明，在一定浓度内，水霉菌量不直接影响抗菌渔药MIC的准确测定.
2.4 6种抗菌渔药在生产中的作用效果比较
在虹鳟受精卵孵化过程中，每3d消毒处理1次，每次处理10min，在发眼期测其结果如表2.通过表2可知，孔雀石绿的作用效果最好，其发眼率为81.5%；检科一号次之为73.5%.其余渔药作用效果依次为复合季胺盐（68.5%）＞聚维酮碘（45.7%）＞甲醛（43%）＞氯化钠（38.5%）＞对照（34%）.但是这与10倍MIC下测定的结果（检科一号＞孔雀石绿＞复合季胺盐＞聚维酮碘＞甲醛＞氯化钠）稍有不同，孔雀石绿的实际防治效果优于检科一号，这可能与其杀菌机理不同有关，检科一号为氧化还原电位消毒剂，其主要成分为食用酸与无机氯盐，终产物为水和盐能够随着流水流出孵化槽；孔雀石绿能够使细胞内的氨基酸无法转化为蛋白肽［10］，细胞分裂受到抑制，产生杀菌效果，但是其在生物体内的主要代谢产物为无色孔雀石绿，具有更高的残留性，能够持续杀菌.由于MIC的测定是在试
管中进行的，所以检科一号在实验室中的效果要好于实际生产中.
表2 6种抗菌渔药对虹鳟受精卵发眼率的影响Tab.2 The effect of 6fish drugs on rainbow trout fertilized eggs?
通过使用不同渔药来改变孵化用水中细菌的种群组成［11］，增加水环境中益生菌的种群数量，可以收到抑制水霉菌的过度繁殖效果.有研究表明对虾受精卵细菌的数量和卵的发育呈正相关［12－13］，在黄颡鱼卵孵化中通过投放益生菌及重氢硫酸盐能够有效地延长抑制水霉菌的发生时间［14］.
3 讨论与结论
1）在人工孵化过程中，绝大多数的死卵极易着生水霉菌，正常健康鱼卵则不易受到感染，有时虽可看到孢子的萌发，并悬浮在卵的间质中生长和分出侧枝的情况，但是若胚胎正常发育，则悬浮的内菌丝会停止发育，这可能与活细胞能分泌一种抗菌物质有关［15］.当胚胎死亡时，则内菌丝迅速繁殖，并长出外菌丝，当繁殖到一定程度，周围正常鱼卵也因菌丝覆盖窒息而死.因此采用科学的营养配方，培育出体质健壮的亲鱼，来提高虹鳟卵的自身抗菌能力至关重要.
2）在水霉菌高发阶段及时合理的用药也是必须的.本文测定了6种渔药的MIC，认为其MIC不随菌物浓度的变化而变化，这与高鹏，杨先乐等测定的结果一致［16］.在MIC下，6种抗菌渔药的抑菌圈均为1cm（滤片直径＝1cm），无法比较，但是随着渔药浓度的增加抑菌圈直径明显上升.在10倍MIC下，5种渔药的抑菌圈出现明显差异，检科一号的抑菌圈明显大于孔雀石绿的抑菌圈.虽然在实际生产检测中，检科一号的使用效果略次于孔雀石绿，但是检科一号具有高效的灭菌能力和对受精卵药物残留低的特点，可以替代孔雀石绿成为一种对水霉菌有效的消毒药物.
3）现在整个水产养殖业中，存在着严重的乱用渔药现象，其中一个重要的原因就是药敏检测过程中参数的选择不科学，造成用药量有误，从而使病菌耐药性提高产
生了耐药株.因此正确测定抗菌渔药的MIC对水产养殖中正确使用渔药有一定的指导作用.
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