仪器分析分子发光分析法

VR S2
IC VR
S1
VR：振动驰豫 IC：内部转换 ISC：系间窜跃
ISC VR T1
S0
S0
吸光 吸光 荧光
磷光
图5-1 分子荧光、磷光光谱产生过程示意图
二、荧光、磷光与分子结构的关系
（一）荧光效率
• 荧光强度常用荧光量子效率φf 来描述
荧光量子效率
发荧光的分子数
f = 激发态分子总数
f 是一个物质荧光特性的重要参数， 反映了荧光物质发射荧光的能力， f 越大，荧光越强，在0~1之间。
ISC T1
S0
S0
吸光 吸光
3.辐射去激—荧光和磷光产生
• S1或T1 发光 S0 这种过程叫辐射去激
(1) 荧光：
从S1的最低振动能级回到S0各振动能级所产 生的光辐射叫荧光
特点： • 产生速度快，10-9~10-6s； • 依赖于外部光源 • 荧>激
VR S2
IC VR
S1
VR：振动驰豫 IC：内部转换 ISC：系间窜跃
浓度
C1
荧光强度 If1
C2 C3 If2 If3
C4 C5 Cx If If4 If5 Ifx Ifx
Cx
C
2. 荧光猝灭法
• 把荧光猝灭用在定量分析上，具有较高的灵 敏度和选择性
• 荧光物质 M 与猝灭剂 Q 生成不发荧光的基 态配合物MQ
M + Q = MQ（非荧光物质）
Kf
C(MQ) C(M )C(Q)
• -OH、-OR、-NH2、-NHR、-NR2等给电子 基团
• 由于基团的 n 电子（孤对电子）的电子云 与苯环上的 轨道平行，共享了共轭 电 子，扩大了共轭体系，使荧光波长长移，荧 光强度增强
（2）减弱荧光的取代基
-COOH 、 -NO2 、-COOR 、-NO、-SH 吸电子 基团, 使荧光波长短移，荧光强度减弱 • 芳环上被F、Cl、Br、I 取代后，使系间窜跃加强， 磷光增强，荧光减弱。磷光相应增强，这种效应 为重原子效应。
（3）影响不明显的取代基
-NH3+、-R、- SO3H等
三、环境对荧光、磷光的影响
1. 溶剂的影响
不同的溶剂中可能表现出不同的荧光性质 溶剂的极性增强，荧光波长红移，强度增大
2. 温度的影响——低温下测定，提高灵敏度
因为辐射跃迁的速率基本不随温度变; 非辐射跃 迁随温度升高显著增大。
荧光效率会随溶液温度升高下降，强度减弱。
是微量或痕量组分，灵敏度高
• 浓度高时， If与C不呈线形关系， • 有时C增大， If反而降低。因为公式[ ]
中后面影响；有时发生荧光猝灭效应
• 荧光猝灭
——荧光物质与溶剂或其它物质之 间发生化学反应，或发生碰撞后使荧 光强度下降(荧光效率f 下降)称为荧光 猝灭。
• 使荧光强度降低的物质称为荧光猝灭 剂
• 氧分子及产生重原子效应的溴化物、 碘化物等都是常见的荧光猝灭剂
• 碰撞猝灭—— M +激 → M* M* + Q → M + Q +热
• 自熄灭——荧光物质发射的荧光被荧 光物质的基态分子所吸收，即自吸收 现象
五、荧光和磷光分析仪器
（一）荧光分析仪器 ——主要由光源、单色器、样品
池、检测器和显示器组成。
• 第一单色器作用：分离出所需要的激发光， 选择最佳激发波长 ex
• 第二单色器作用：滤掉一些杂散光和杂质 所发射的干扰光，用来选择测定用的荧光 波长 em。
3、样品池
• 盛放测定溶液，通常是石英材料的方形池，四面 都透光，只能用手拿棱或最上边
4、检测器
• 把光信号转化成电信号, 放大, 直接转成荧光强度
未知液 标准液
If x = KCx
If
s
=
比较
KCs
I fx Cx I fs Cs
Cx Cs I fx 若有试剂空白，测得的荧光强度减去空白后 I fs
Cs I fx I f 0 I fs I f 0
（二）荧光分析法的应用
• 荧光分析法具有灵敏度高、取样量少等优点 1. 无机化合物的分析 • 与有机化合物生成发荧光的有机配合物后，
经推导得出：
猝灭剂加入前 的荧光强度
I前 I后
1
K f C(Q)
猝灭剂加入后试 液的荧光强度
常数 猝灭剂浓度
I前/I后与C(Q) 有线性关系，可求猝灭剂含量
• 标准曲线法
I前/I后 I前/I后x
CQx
CQ
3. 比较法——比较简单
• 如果试样数量不多，可用比较法进行测量
• 配一标准溶液浓度为Cs， Cs与未知液浓度Cx相 近，并在相同条件下测定它们的荧光强度
• If = 2.3 f I0A
=2.3 f I0bc
当A﹤0.05时， If与 f 、I0、 和c 有关。
对一给定物质，当激发光波长和强度一
定时， f 、I0、 和b为常数，合并为K
If = KC Ip = KC
定量分析依据
• 荧光强度与物质浓度呈线形关系，
If=KC • 只有在浓度低时使用，荧光物质测定的
• 荧光的强度一般较弱，要求检测器有较高的灵敏 度，荧光光度计采用光电倍增管
• 荧光分析比吸收光度法具有高得多的灵敏度，是 因为荧光强度与激发光强度成正比，提高激发光 强度可 大大提高荧光强度
5、读出装置
• 扫描激发光谱和发射光谱记录, 结果打印输出
（二）激发光谱和荧光、磷光光谱
• 激发光谱：荧光和磷光均为光致发光，合适 的激发光波长需根据激发光谱确定
§ 5- 1 分子发光分析法及其分类
• 分子发光分析法
较高激发态
吸收能量 受激
退激 光辐射
基态
分子在退激过程中以光辐射形式释放能量
• 根据分子受激时所吸收能源及辐射光的机理 不同分为以下几类： 光致发光：以光能来激发而发光
荧光—荧光分析法
磷光—磷光分析法
化学发光：以化学反应能激发而发光—化学发
光分析法
热致发光 、生物发光、电致发光
荧 光
激发光谱和荧光光谱
强
度
I
λex,max
λfl,max
300
400
500
硫酸奎宁的两个光谱
λ 波长（nm)
硒 油类 石油烃
荧光分光光度法 GB17378.5-1998(13.1) 沉积物 荧光分光光度法 GB17378.5-1998(14.1)
荧光分光光度法 GB17378.6-1998(14.1)
em /nm
苯
0.11
205
278
萘
0.29
286
310
蒽
0.46
365
400
线状环结构比非线状
菲
结构的荧光波长长
350
• 多环芳烃是重要的环境污染物，可 用荧光法测定 • 3,4 - 苯并芘是强致癌物
ex = 386 nm em = 430 nm
2. 刚性平面结构—较稳定的平面结构
• 具有强荧光的分子多数有刚性平面结构
-o
o
o
-o
o
coo -
荧光素：氧桥把两 个环固定在一个平 面上，具有平面结 构，强荧光物质
coo -
酚酞：无氧桥把两 个环固定，不能很 好的共平面，为非 荧光物质
例 1，2 - 二苯乙烯
H
H
C=C
H C=C H
顺式：非平面构型 非荧光体
反式：平面构型 强荧光体
（三）取代基的类型
• （1）增强荧光的取代基
I
固定em 荧光波长
获得方法：固定em不 变，改变ex，测定它
的荧光强度，以I 为纵
坐标， ex为横坐标得 左图，即荧光物质的
激发光谱，确定最大
ex
ex
发射光谱：荧光、磷光光谱
I
固定 ex 激发光波长
获得方法：固定ex不变， 改变em，以I 为纵坐标，
em为横坐标得左图，即
荧光物质的发射光谱
光源；常用其发射365 nm、 405 nm、 436 nm 三条谱线
以365 nm 的谱线最强
应用最广泛的一种光 源，可发射250~800nm
很强的连续光源
2、单色器
• 荧光计用滤光片作单色器，荧光计只能用 于定量分析，不能获得光谱
• 大多数荧光光度计一般采用两个光栅单色 器，有较高的分辨率，能扫描图谱，既可 获得激发光谱，又可获得荧光光谱
• 固体表面室温磷光分析需特制试样室
2. 磷光镜
• 有些物质既可产生荧光，又能产生磷光。用机械 切光装置——磷光镜区别荧光和磷光。利用荧光 寿命短，磷光寿命长消除荧光干扰。
六、 荧光、磷光分析及应用
（一）定量分析方法
定量分析依据 If = KC
Ip = KC
1. 标准曲线法——最常用的定量分析方法
•分析上有应用价值的荧光化合物的荧光 效率大于0.1。
（二）荧光磷光与有机化合物结构的 关系
• 至今对激发态分子的性质了解不深，无法定 量地描述荧光与分子结构之间的关系
• 物质只有吸收了紫外可见光，产生 *、 n *跃迁，产生荧光
• *与n *跃迁相比，摩尔吸收系数 大102~103，寿命短
_
OH
O
例：—苯酚
无荧光
有荧光
另外，表面活性剂也会影响荧光强度和特性
四、荧光强度与荧光物质浓度的关系
强度为I0的入射光，照射到浓度很稀的荧光
物质时,产生荧光，荧光强度If 与入射光强度有
下面的关系：
I0 荧光池 I
•If = f Ia= f （I0 - I ）
If荧光
A lg I0 I
I = I010-A
第一激发三重态 T1 基态单重态 S0
自旋平行
T1、T2、T3分别表示第一、二、三激发三重态
由基态单重态→激发三重态，净自旋 0。这 种跃迁为禁阻跃迁
三重态分子具有顺磁性，激发态的平均寿命 约为10-4 ~ 1S
2. 无辐射去激
外部转移—激发态分子与溶剂分子或溶质分子的 相互作用产生能量转移，荧光或磷光减弱或消失Βιβλιοθήκη § 5- 2 荧光和磷光光谱法
一、荧光和磷光光谱的产生
• 基态分子光照后，价电子跃迁产生荧光和磷光
基态分子 光照激发
价电子跃迁到激发态
去激发光 * * n
基态
1. 电子自旋状态的多重性
• 分子中的电子数及自旋方向
第一激发单重态 S1
基态单重态 S0 S0, S1, S2, S3分别代表基态、第一、 二、 三激发单重态 单重态分子具有抗磁性，激发态的平均寿命约为10-8
ISC T1
S0
S0
吸光 吸光 荧光
图5-1 分子荧光光谱产生过程示意图
（2）磷光
• S1 体系间窜跃(isc) T1 发光
S0 磷光
• 特点：
• 发光速度慢，约为 10-4 ~ 10s，
• 光照停止后，磷光仍可持续一段时间
磷光的波长更长 磷 > 荧> 激 * 易产生荧光 n * 易产生磷光
强度 检测器
If = f （I0- I010-A ） = f I0 （1-10-A ）
Ia为吸收的辐射强度 I0为入射光强度 I 为透射光
将上式展开
If


f
I
0[2.3
A

(2.3A)2 2!
(2.3A)3
3!
]
• 当A﹤0.05时，方括号中其它各项与第一项相比 可忽略不计，上式简化
• 振动驰豫(VR)—同一电子能级中，从较高振动能 级到较低振动能级的过程
• 内部转换(IC)—相同的多重态之间的转换 S-S • 系间窜跃(ISC)—不同的多重态之间的转换S-T
发生系间窜跃电子需转向，S1—T1间进行，比内 部转换困难
VR S2
IC VR
S1
VR：振动驰豫 IC：内部转换 ISC：系间窜跃
• *跃迁常产生较强的荧光， n *跃 迁产生的荧光弱，但可产生系间窜跃，产 生更强的磷光
1. 共轭体系——有较强的荧光
• 具有共轭体系的芳环或杂环化合物, 电子共轭程度越大，越易产生荧光; 环 越多，共轭程度越大, 产生荧光波长越 长，发射的荧光强度越强
f
ex /nm
温度对磷光影响更大
3. pH的影响
• 大多数含有酸性或碱性基团的芳香族化合物 的荧光性质受溶液pH的影响很大
• 共轭酸碱对是具有不同荧光性质的两种型体， 具有各自的荧光效率和荧光波长
例： 苯酚
_
OH
O
_
OH
H+
离子化后， 荧光消失
pH≈1有 荧光
pH≈13 无荧光
• 但两个苯环相连的化合物，又表现出相反的性质， 分子形式无荧光，离子化后显荧光
从曲线上找出最大的 em
em
• 磷＞ 荧＞ 激
吸收峰 荧光峰
磷光峰
图
荧 光
激发光谱和荧光光谱
强
度
I
λex,max
λfl,max
300
400
500
硫酸奎宁的两个光谱
λ 波长（nm)
（三）磷光分析仪器
• 与荧光分析仪器相似，主要差异如下：
1. 试样室
• 试样需在液氮温度（77K，-196℃）下测定低温 磷光（将液池放在盛放液氮的杜瓦瓶内）
光源
I0
I
第一单色器
液池
检测器
ex
第二单色器
与分光光度计有两点不同
em
①两个单色器
检测器
②检测器与激发光互成直角
放大器及记录器
1、光源
• 激发光源一般要求比吸收测量中的光源有更大的 发射强度；适用波长范围宽
• 荧光计中，常使用卤钨灯作光源 • 荧光光度计中常用高压汞灯和氙弧灯
利用汞蒸气放电发光的