人的外周血淋巴细胞培养及染色体制片方法、染色体组型分析
人体外周血淋巴细胞染色体制备与观察实验方案
人体外周血淋巴细胞染色体制备与观察实验方案清晨的阳光透过实验室的窗户，洒在桌子上，我拿起笔，准备写下这个实验方案。
人体外周血淋巴细胞染色体制备与观察，这是一个既熟悉又充满挑战的课题。
就让我以意识流的方式，带你走进这个神秘的实验世界。
一、实验目的1.了解人体外周血淋巴细胞染色体的基本结构。
2.学习并掌握染色体制备与观察的方法。
3.分析染色体形态，探讨其在遗传研究中的应用。
二、实验原理1.人体外周血淋巴细胞具有分裂能力，可进行有丝分裂。
2.通过特定染色方法，使染色体着色，便于观察。
3.利用显微镜技术，观察染色体形态和结构。
三、实验材料1.人体外周血：新鲜、无污染。
2.染色剂：吉姆萨染液、醋酸洋红染液。
3.试剂：肝素钠、氯化钠、磷酸缓冲液。
4.实验器材：显微镜、载玻片、盖玻片、离心机、移液器、吸管、计时器等。
四、实验步骤1.采集外周血：抽取2ml静脉血，加入含有肝素钠的抗凝管中，轻轻摇匀。
2.制备淋巴细胞悬液：将抗凝血置于离心管中，加入适量氯化钠溶液，1500r/min离心10分钟，弃上清，重复洗涤2次。
加入适量磷酸缓冲液，重悬细胞。
3.染色：取适量淋巴细胞悬液，滴加吉姆萨染液或醋酸洋红染液，染色5-10分钟。
4.制片：将染色后的细胞悬液滴在载玻片上，用盖玻片覆盖，轻轻压实。
5.观察染色体：将制片置于显微镜下，调节光线和倍数，观察染色体形态和结构。
6.记录结果：记录观察到的染色体形态、数量、排列等信息。
五、实验结果分析1.染色体形态：观察到的染色体呈棒状或X形，颜色鲜艳。
2.染色体数量：正常人体外周血淋巴细胞染色体数为46条。
3.染色体排列：有规律地排列成2个染色体组。
4.遗传研究应用：通过染色体分析，可研究遗传病、肿瘤等疾病的发生机制。
六、实验注意事项1.采集外周血时，要确保无污染。
2.制备淋巴细胞悬液时，要充分洗涤，去除红细胞和血浆。
3.染色过程中，要控制好染色时间，避免过染或欠染。
4.观察染色体时，要调节好显微镜光线和倍数，确保清晰。
人外周血淋巴细胞培养及染色体观察
37 ℃低渗处理20min后，发到同学手中
低速离心机使用图解
离心机顶盖
转速旋钮 电源指示灯 电源开关
转速显示
时间旋钮
对称放置离心管后方可启动离心机！！！
离心后倒去上清
7、固定：固定液成分为甲醇:冰醋酸=3:1 。每只离心管中，加入固定液2ml（2只 离心管共需4ml），立即用滴管轻轻冲打 成细胞悬液，在室温中固定15min后，准备：在接种罩内，用移液器将培养液分装入 10ml培养瓶中，每瓶量为： – 1640培养液4ml – 小牛血清1ml – PHA 0.2ml – 肝素 0.05ml – 双抗(青霉素和链霉素)：终浓度为100U/ml – pH：7.2‾7.4用3.5%碳酸氢钠调节
实验用药品
细菌过滤器
光源亮度调节手轮
实验全程录像
染色体G带核型图
染色体核型图
优秀实验报告展示一
优秀实验报告展示二
Motic B1 目镜 瞳距调节拉板 物镜转换器 物镜 载物台 聚光镜 焦距粗\微调螺旋 集光镜 视度调节圈
Motic B1 目镜 瞳距调节拉板 物镜转换器 物镜 载物台 聚光镜 载物台左右推进螺旋 集光镜 焦距粗\微调螺旋 视度调节圈
10倍镜下镜检
玻片夹
使用油镜前，在玻片上滴加香柏油
油镜使用结束，用擦镜纸蘸洗镜液
擦洗油镜头
10倍镜下观察到的染色体分裂相
40倍镜下观察到的染色体分裂相
数码显微镜100X染色体观察一
数码显微镜100X染色体观察二
数码显微镜100X染色体观察三
五、实验结果
1．核型分析：绘制自己观察到的染色体 图谱，并注明分组编号（A,B和G组） 注明材料编号，并确定男女。 2，完成实验报告，当场打分。
人的外周血淋巴细胞培养
人的外周血淋巴细胞培养摘要：正常情况下哺乳动物的外周血中没有分裂相，这是由于外周血中的小淋巴细胞大多处于G0期。
但在一定条件下，外周血中的小淋巴细胞受刺激转化成淋巴母细胞，随后进入有丝分裂。
本实验介绍人外周血淋巴细胞的培养方法，染色体标本的制备和正常人染色体的组型分析。
[1]关键词：外周血淋巴细胞低渗处理空气干燥法染色体组型分析前言：人体外周血细胞培养是制备染色体标本的常用方法。
此方法取材方便，用血量少，操作简便。
1960年Nowell和Morhead验证，使红细胞凝集从而能分离出白细胞的植物凝集素（phytohaemagglutinin，PHA）是人和其他动物淋巴细胞的有丝分裂的刺激剂。
在PHA的作用下，原来处于G0期的淋巴细胞转换为淋巴母细胞，进而进行有丝分裂。
这样经过短期培养，以秋水仙素或其衍生物秋水仙胺进行处理，经过低渗和固定，就可获得大量的处于有丝分裂时期的细胞[2]，因为秋水仙素(或秋水酰胺)可通过干扰微管组装而抑制纺锤丝形成，使细胞分裂顺利进入后期而停滞于中期，从而可在短期积累大量最适于进行染色体分中期分裂相。
此外，秋水仙素还能使染色单体缩短、分开，使染色体呈现明显形而利于辨认。
淋巴细胞经过培养以后，形成了体外活跃生长的细胞群体，经过空气干燥法制片。
所谓空气干燥法，实际上是将细胞经过秋水仙素—低渗处理—充分的固定—滴片等步骤之后再载玻片上得到染色体制片的技术。
有时，有人把滴片的步骤叫做染色体分散，也有人把这一步和随后的干燥称为空气干燥法。
“空气干燥”就是滴片后，不加热或任何处理，使载玻片在室温中自然干燥的方法。
[3]淋巴细胞的培养已成为制备染色体的最主要的方法。
因为该法材料便宜易得，对同一个体可进行连续观察，并可得到优良的染色体制片。
各种因素的作用效应（如病毒、电离辐射、化学试剂等）可在淋巴细胞的培养条件下进行观察，从而可进行多种在体无法进行的研究。
本方法已在临床医学、病毒学、药理学、遗传毒理学等方面广泛应用。
人体外周血淋巴细胞培养及染色体制片实验原理
实验原理人体的1ml 外周血中一般含有约1-3×106个小淋巴细胞，通常它们都处于间期的GO和G1期。
在培养条件下给予药物刺激时，经过53-72小时可在培养物中获得大量的有丝分裂细胞，供染色体标本制备和分析之用。
这种外周血培养方法是在1960年由Moorhead等所建立的。
人体外周血的形成包括红细胞、白细胞、血小板，其中红细胞和血小板不能离体培养。
血细胞中的小淋巴细胞处于间期的GO和G1期。
在培养时给予药物刺激，可转变为淋巴细胞，随后进行有丝分裂。
这样经过66-72小时短期培养、秋水仙素处理，低渗和固定，就可获得大量有丝分裂的细胞。
这种微量全血培养技术已得到了广泛的应用。
1912年，Warfter 最先研究人类染色体。
1923年，报道人类染色体的二倍体为48条。
细胞遗传学、组织培养技术为人类染色体的研究提供了条件。
技术突破主要在于：（1）人体外周血淋巴细胞培养和PHA的应用：PHA 是从菜豆种子中提取出来的，大量的PHA具有凝血作用。
如果适合，可刺激细胞转为母细胞，从而进行有丝分裂。
（2）秋水仙素的应用：秋水仙素可阻断纺缍体截止于中期，使染色体个体大，结构清晰，缩短适度，细胞质粘度降低。
（3）低渗处理（水或0.075mlKcl）使红细胞胀破，白细胞胀大，染色体空间变大，易伸展，便于观察。
1956年，J.H.Tjio A.Levan 培养人胚胎组织细胞，计数人体细胞染色体数为46条。
1960年，Moorhead建立人体外周血培养技术，使染色体的研究跃进一步。
1968年，T.U. Casperssan 提出染色体显带技术。
实验试剂RPMI1640培养基，植物血凝素（PHA），小牛血清，肝素，双抗，秋水仙素，低渗液：0.075Mol/L Kcl，卡诺氏固定液，Giemsa染色液，0.1Mol/L 磷酸缓冲液(pH7.4-7.6)等。
磷酸缓冲液的配制0.1Mol/L 磷酸缓冲液(pH7.4-7.6):A:Na2HPO4•12H2O 28.8克B:Na2HPO4•7H2O 2.164克KH2PO4 2.67克NaH2PO4•2H2O 0.3克溶解于1000 ml双蒸水中溶解于1000 ml双蒸水中实验设备2ml灭菌注射器，离心机，电子天平，恒温培养箱，除菌滤器，显微镜，酒精灯，载玻片等。
外周血淋巴细胞培养与染色体制备
01
提交方式
根据实验室或研究机构的要求， 选择合适的提交方式，如纸质版 或电子版。
提交时间
02
03
交流与讨论
按照规定的时间节点提交实验报 告，确保数据的及时性和有效性。
与其他研究者或导师进行交流与 讨论，对实验结果进行深入探讨 和改进。
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感谢您的观看
04 外周血淋巴细胞培养注意 事项
细胞培养环境控制
温度
CO2浓度
维持恒定的温度是细胞生长的必要条 件，通常在37°C左右。
维持5%的CO2浓度，以维持培养基的 酸碱平衡。
湿度
保持培养箱内湿度在95%左右，以防 止细胞干燥。
细胞培养基质选择
01
选择适合淋巴细胞生长的培养基 ，如RPMI-1640或DMEM培养基 。
收获细胞
当细胞达到一定数量或生长状 态良好时，可以收获用于后续 实验或应用。
02 染色体制备
染色体分散
染色体分散是染色体制备的重要步骤，通过使用低渗溶液或机械力等方法使细胞膜 通透性增加，染色体从细胞中释放出来。
染色体分散的关键在于保持细胞的完整性和染色体的天然状态，以避免染色体畸变 或丢失。
常用的染色体分散方法包括低渗法、酶解法、机械法等，选择合适的方法取决于实 验目的和细胞类型。
02
根据需要添加适量的生长因子、 抗生素等添加剂，以促进细胞生 长和防止污染。
细胞培养过程监控
定期观察细胞生长情 况，记录细胞密度、 形态等指标。
定期进行微生物检测， 确保无污染发生。
定期检测培养基的 pH值和渗透压，确 保培养基的适宜条件。
05 染色体制备注意事项
染色体制备试剂选择
人体外周血淋巴细胞染色体制备与观察实验方案 (1)
人体外周血淋巴细胞培养及染色体组型分析实验方案2012级师范2班第3组组员：吴婵胡颖月央珍杨基伟杨青松宋海燕田金梅（组长）一、实验目的掌握人体外周血淋巴细胞培养与染色体组型分析的方法。
二、实验原理人的1ml外周血约含有1×10*6~3×10*6个小淋巴细胞，它们几乎都处于G0或G1期，一般情况下不分裂，但但采用人工离体培养的方法，经PHA（植物血球凝集素）刺激后，能转变成可分裂的淋巴母细胞进行有丝分裂。
所谓外周血培养即是将外周血接种在适当的培养物中加入适量的秋水仙素，使纺锤体微管解聚，这样细胞停留在中期，可以获得大量的分裂细胞。
用低渗盐溶液（一般是0.075mol/L的KCl）处理，使其中的红细胞及分裂相细胞膜和一部分细胞质除去然后用Carnoy固定液固定，最后以气干法制片，可获得较好的染色体标本。
核型（karyotype）指一个细胞中的整套染色体，按其大小、形态特征顺序排列所构成的图像。
通常是将显微摄影得到的染色体照片剪贴而成。
在完全正常的情况下，一个体细胞的核型一般可代表该个体的核型。
组型（idiogram)是以模式图的方式表示，它是通过许多细胞染色体的测量取其平均值绘制成的，是理想的，模式化的染色体组成，代表一物种染色体组型的特征。
将待测细胞的核型进行染色体数目、形态特性的分析，确定其是否与正常核型完全一致，称为核型分析（karyotype analysis）。
这对于探索人类遗传病的发病机理，探讨动物和植物的起源，以及物种间的亲缘关系等都具有重要意义。
染色体的特征以有丝分裂中期最为显著，所以一般都分析中期分裂相。
根据染色体着丝粒位置可将染色体分为中部着丝粒染色体（m）,亚中部着丝粒染色体（sm），亚端部着丝力粒染色体（st)，端部着丝力粒染色体（t）。
对于任何一个的基本形态特征来说，重要的参数有以下3个：（1）相对长度=单条染色体的长度/(单倍体常染色体+X或Y染色体)的总长度×100%（2）臂指数=长臂/短臂（反映着丝粒位置的指数）（3）着丝粒指数=短臂/整个染色体长度×100%（反映着丝粒位置的指数）人类体细胞的正常核型是含有23对染色体，共46条。
外周血淋巴细胞培养和染色体标本制备
乙液：一水磷酸二氢钠,1/15M溶液含9.2g/L 甲液：二水磷酸氢二钠,1/15M溶液含 11.864g/L 根据要求的PH值,取X毫升甲液与Y毫升乙液, 混合均匀即得.
实验步骤
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1培养液的分装:在无菌室或接种罩内,用移液管将培养液和其它各 试剂剂分装入玻瓶,每瓶量为 :
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完全培养基3ml
PHA 20ul
外周血淋巴细胞培养和染色体 标本制备,染色体组型分析
实验目的
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1、了解动物细胞培养的方法。掌握人体外周血淋巴细胞培养与 染色体标本制备。 2、熟悉人类染色体的镜下检查和核型分析方法。
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实验原理
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人体外周血的形成包括红细胞、白细胞、血小板，其中红细胞 和血小板不能离体培养。每1ml 外周血中一般含有约1～3×106 个小淋巴细胞， 几乎都处于G1期或G0期的非增殖状态 ，一般情 况下是不再分裂的。但当在培养液中加入植物凝血素（PHA）后， 淋巴细胞受刺激便转化为淋巴母细胞，重新进入增殖周期，进行 有丝分裂。经过66～72小时(三个周期)的短期培养，秋水仙素的 处理，低渗和固定，就可获得大量的有丝分裂相细胞，从而进行 染色体标本制备和核型分析。
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9制片:留固定液 0.5毫升, 用滴管小心冲打成悬液。 从冰箱的冰格中或冰水 中取 出载玻片,每片滴加悬液 1~3滴,吹散,在酒精灯火焰上过火。室温过夜。
11染色:用磷酸缓冲液（PH7.4）稀释后的姬姆萨染色液染色 20分钟,然后倒 去染液,用蒸馏水轻 轻冲洗 . 12镜检:待稍干后,在显微镜下观察,先用低倍镜寻找良好的分裂相,然后再用高 倍油 镜观察。
人染色体组型及其特征
实验材料
• •
1.1试验材料:人外周血淋巴细胞 1.2试验用具:离心管、吸管，量筒、 载玻片，常规清洗烘干，培 养瓶、、1ml/5ml移液枪,灭菌处理， 天平、离心机、恒温培养 箱、显微镜、普通冰箱，酒精灯。 1.3试剂药品 完全培养基 凝血素(PHA ) 5mg/ml
实验1人类外周血淋巴细胞培养及染色体标本制备
实验一人类外周血淋巴细胞培养及染色体标本制备【实验目的】(1)了解人类外周血淋巴细胞培养技术。
(2)初步掌握人类外周血淋巴细胞染色体标本的制备技术。
【实验原理】在健康成年人外周血淋巴细胞中，以小淋巴细胞为主。
在通常情况下，它们都处在间期的G1期或G0期，一般情况下不进行分裂。
但在体外适宜培养条件下，它们经有丝分裂原如植物血球凝集素（Phytohemagglutinin，简称PHA）的作用可发生转化而重新进行有丝分裂活动。
因此，当该类细胞在人体外经PHA 刺激短期培养后，经秋水仙素（colchicine）处理使正在分裂的细胞停止在中期，再经低渗和固定等处理，即可得到较多可供分析的中期染色体标本。
【材料】人外周血【器材与试剂】1、主要器材超净工作台，光学显微镜、恒温培养箱、水平式离心机、高压蒸汽消毒锅、水浴箱、冰箱、离心管、滴管、试管架、酒精灯、载玻片等。
2.主要试剂RPMI-1640培养基、小牛血清、PHA(浓度5mg/ml)、秋水仙素(浓度4ug/ ml), 肝素(配制浓度:0. 4%)、固定液(甲醇与冰醋酸按3: 1配制) 、低渗液(0.075 mol/L 氯化钾) Giemsa染液(浓度5%)。
【实验步骤】1.取材与细胞培养在无菌条件下抽取静脉血0.5 ml，立即接种于盛有5 ml RPMI-1640培养液的培养瓶中，加入5mg/ml PHA 20-40ul,轻轻将其摇匀后放在37℃恒温培养箱中。
2、培养至68 -70h。
然后加人秋水仙素0.05 ml，继续培养2-4h，即可获得细胞。
3.染色体标本制备(1)将培养物吸入离心管内，以1500-2 000 r/min离心5-10 min，用吸管小心吸弃上清液。
(2)将预温至37℃的低渗液7-8 ml加入离心管中，用吸管混匀后放人37℃水浴箱中低渗处理10-20 min 。
中途混匀一次。
(3)取出离心管，加入1 ml固定液，缓慢混匀，立即离心5-10 min（15 00-2 000 r/min）。
人类外周血淋巴细胞的培养及染色体标本制备
细胞与遗传学教研室
一、实验目的 1.掌握人类染色体标本的制作方法 2.了解人类染色体形态结构特征
24hrs 时加 入 BrdU
68 hrs 时加 入秋水仙素
人类外周血
植物血球凝集素 ( PHA） 肝素、培养基、小牛血清
体外培养
72 hrs 后 收集细胞
制作玻片标本
固定
预固定 紫外线照射
四、实验方法
1.外周血细胞培养
（1）采血：无菌，肝素抗凝。 用无菌注射器抽取肝素0.2ml,润湿针筒,推出多 余肝素.消毒后,抽取受试者静脉血2ml。） （2）接种培养：每培养瓶加入0.3～0.5ml（10滴）, 接种于装有5ml培养基的培养瓶中，摇匀， 37℃培 养箱中培养68小时。 （20滴） • • （3）秋水仙素处理：0.05～0.4μ g∕ml培养基，轻 摇混匀后，继续培养至72小时 。
人类外周血体外培养收集细胞制作玻片标本固定预固定低渗处理植物血球凝集素pha肝素培养基小牛血清72hrs68hrs入秋水仙素24hrs入brdu紫外线照射giesma染色处理荧光染料染色染色体带的制作方法giesma染色外周血外周血中的淋巴细胞几乎都是处在中的淋巴细胞几乎都是处在gg00期或gg11期期一般情况下是一般情况下是不分裂不分裂的
外周血淋巴细胞
PHA 37℃ 68h
G0期或G1期
秋水仙素 至72 h
三、实验用品
• 1.材料：人体外周血 • 2.器材：培养箱、培养瓶、离心机、刻度离心管、吸 管、恒温水浴锅等 • 3.试剂：培养基、秋水仙素（12.5μ g∕ml）、植物凝 集素（PHA）、肝素、0.075Mkcl低渗液、甲醇、冰乙 酸、PH6.8磷酸缓冲液、Giemsa原液。
人体外周血淋巴细胞染色体制备与观察实验方案复习过程
人体外周血淋巴细胞染色体制备与观察实验方案实验方案实验外周血淋巴细胞培养及染色体标本制备，染色体组型分析一、实验目的1、了解动物细胞培养的方法。
掌握人体外周血淋巴细胞培养与染色体标本制备。
2、初步掌握人类染色体G－带的显示方法及人类染色体G－带在染色体识别中的意义。
3、熟悉人类染色体的镜下检查和核型分析方法。
初步掌握人类染色体G带的特征及其识别。
二、实验原理所谓外周血培养即是将外周血接种在适当的培培养物中加入适量的秋水仙素，使纺锤体微管解聚，这样细胞停留在中期，可以获得大量的分裂细胞。
用低渗盐溶液（一般是0.075mol/L的KCl）处理，使其中的红细胞及分裂相细胞膜和一部分细胞质除去，最后以气干法制片，可获得较好的染色体养基中进行培养。
人类外周血细胞本来是终末分化细胞，一般没有分裂能力，但经PHA （植物血球凝集素）或ConA等药物刺激后，转变成可分裂的转化细胞。
染色体显带是将染色体标本经过一定程序处理，并用特定染料染色，使染色体沿其长轴显现明暗或深浅相间的横行带纹――染色体带，这种技术，称为染色体显带技术。
通过显带，人们可以准确地识别每一条染色体及染色体上的各个区段，并可发现染色体上较细微的结构变化。
在所有的显带技术中，G显带（G banding）是最常见的显带技术，它是将染色体标本用碱、胰蛋白酶或其它盐溶液处理后，再用Giemsa染液染色，在普通显微镜下，可见深浅相间的带纹，称G带（G band）。
G显带方法简便，带纹清晰，染色体标本可以长期保存，因此被广泛用于染色体病的诊断和研究。
正常人类染色体的数目为46条(23对)，1960年的Denver会议和1963年的London会议制定了统一的人类染色体命名体制：按照染色体的相对长度、臂比和着丝粒指数，将常染色体（22对）按大小用阿拉伯数字标记，顺次排列为1～22号，性染色体用X和Y标记；并按染色体大小和着丝粒位置，把人类染色体分为七个组，用大写字母A～G表示。
5blood实验5 人外周血淋巴细胞培养及染色体核型分析
实验5 人外周血淋巴细胞培养及染色体核型分析5.1 相关基础知识人外周血液中的小淋巴细胞，几乎都处在G1期（G0期），一般情况下是不再分裂的。
在培养液中加入植物凝血素（PAH）时，小淋巴细胞受刺激转化为淋巴母细胞，随后进入有丝分裂。
这样经过短期培养、秋水仙素的处理、低渗和固定，就可获得大量的有丝分裂细胞。
目前本方法已为临床医学、病毒学、药理学、遗传毒理学等领域广泛采用。
人类每个体细胞有46条染色体，22对常染色体和一对性染色体，男子是46，XY；女子是46，XX。
根据各组染色体的特征予以分组：A组：（N01～03）是最大的一组染色体，它们的着丝粒在中部或几乎在中部；B组（N04～05）为两对大的亚中着丝粒染色体，它们有显的长臂和短臂；C组（N06～12+X）为中等大小的亚中着丝粒染色体，它们大小相差不多，X染色体大小介于期间，一般难以区分；D组（N013～15）为中等大小的端着丝粒染色体，它们的一个重要形态特征是随体，随体是一对着色很深的小球，处于短臂的末断，随体与短臂之间的区域很少着色；E组（N016～18）包括一对中着丝粒染色体，亚中着丝粒染色体和一对近端着丝粒染色体；F组（N019～20）为两对小的中着丝粒；G组（N021～22+Y）为最小的一组端着丝粒染色体，在N021～22的短臂上可见随体，Y常呈现异固缩状态，着色更深，可以识别。
5.2 实验目的和要求(1)掌握人体微量血液体外培养技术和制备染色体标本的方法；(2)观察人类染色体的形态，并计数、配对、分类和绘图。
5.3 实验材料和仪器5.3.1 实验材料和试剂(1)人的外周血淋巴细胞；(2)Giemsa母液：量取33ml甘油，先在研钵内加入少量甘油与0.5g Giemsa粉混合，研磨至无颗粒为止，再将剩余甘油倒入，搅拌后于56o C水浴保温2小时，再加入33ml甲醇，搅拌均匀后储存于棕色瓶中；(3)Giemsa染色液：将Giemsa母液用0.1M pH7.4磷酸缓冲液稀释至10倍。
人的外周血淋巴细胞培养
人的外周血淋巴细胞培养摘要淋巴细胞是免疫系统中最重要的细胞，在免疫中起关键作用，维持内环境的稳定。
对人的外周血淋巴细胞进行染色体核型分析对人类遗传研究及临床应用有重大意义。
每一物种都有一定数目及一定形态结构的染色体，可在显微镜下观察到。
本次实验的目的就是掌握人体微量血液体外培养制备染色体标本的方法并学习对人的外周血淋巴细胞进行核型分析。
每1ml 外周血中一般含有约1～3×106个小淋巴细胞，几乎都处于G1期或G0期的非增殖状态，一般情况下是不再分裂的。
但当在培养液中加入植物凝血素（PHA）后，淋巴细胞受刺激便转化为淋巴母细胞，重新进入增殖周期，进行有丝分裂。
经过66～72小时(三个周期)的短期培养，秋水仙素的处理，低渗和固定，就可获得大量的有丝分裂相细胞，从而进行染色体标本制备和核型分析。
这种微量全血培养技术已在临床医学、病毒学、药理学、遗传毒理学等方面得到了广泛应用。
本实验采取了人类的外周血进行实验，经各种技术处理后最后得到较为清晰的人体染色体照片。
通过实验发现：人类每个体细胞有46条染色体，22对常染色体和一对性染色体，男性是46，XY；女性是46，XX。
根据染色体的形态、大小、及着丝粒的位置，将人的外周淋巴细胞的46条染色体分为A、B、C、D、E、F、G7组共23种类型。
关键词人的外周血淋巴细胞染色体低渗溶液核型分析秋水仙素动物细胞体外培养Human Peripheral Blood Lymphocyte CultureAbstract: Lymphocytes are among the most important immune system cells in the immune plays a key role in together, in order to maintain a stable environment. To analyze chromosome of lymphocytes is very important. Various biological chromosome number and shape are constant,can be seen under a microscope. The purpose of this experiment is human body trace blood samples were cultured in vitro chromosome preparation methods and studying on the peripheral blood lymphocyte karyotype analysis on.In human body's 1ml circumference blood includes approximately 1~3×106 the small lymphocyte generally, usually they are between time G0 and the G1 time, generally is not divided. But when adding plant in medium coagulopathy (PHA), lymphocyte transformation and stimulated for lymphatic mother cell proliferation capacity, make its recovery, then entering mitosis. After 66~72 hours(three cycles) short-term training, autumn grain processing, daffodil, low permeability and fixed can be gained lots of mitotic cells, for makes the chromosome specimen preparation and analysis. This kind of micro wholeblood culture technique in aspects and so on clinical medicine, virology, Pharmacology, heredity toxicology obtained widespread application.The experimental taken to conduct experiments on human peripheral blood, the various technical ultimately be treated more clear picture of human chromosomes. Through the experiments have found that each human somatic chromosome, 22 to 46 euchromosome sex chromosomes, and a pair of 46 XY; male is, Women are 46, XX. This method has been clinical medicine and virology, pharmacology, genetic toxicology etc widely. According to the chromosomes of the shape, size, and the centromere position, the peripheral lymphocytes 46 chromosomes into A, B, C, D, E, F, the G7 group of 23 types.Key words: Human blood lymphocytes Chromosome Low permeability solutionKaryotype analysis Autumn daffodils element zooblast in vitro raise offcenter前言细胞培养技术是目前生命科学研究领域的一项常用而重要的技术，它涉及的技术有：无菌操作技术、细胞分离技术、细胞培养技术、显微摄影技术、图像分析技术等。
人体外周血淋巴细胞培养与染色体核型分析
西南大学《细胞生物学自主实验》课程论文论文题目：人体外周血淋巴细胞培养与染色体核型分析学院：生命科学学院专业：生物科学年级班级：2010级5班校区编码：北区姓名：陈建坤二零一二年十二月四日人体外周血淋巴细胞培养与染色体核型分析【摘要】：染色体是遗传物质的载体，它具有贮存和传递DNA、控制基因活动和调整基因重组的作用。
本文着重介绍通过对人体外周血淋巴细胞培养与染色体核型分析，初步了解到对人体外周血淋巴细胞培养方法与人类体细胞染色体核型分析的方法。
该实验采用人工离体培养的方法，采集人体外周血淋巴细胞，在加有植物血球凝集素（PHA，刺激小淋巴细胞转化为淋巴母细胞而进行有丝分裂）的培养基中培养。
经过（72±2）恒温培养，秋水仙素处理、低渗和固定，获得大量有丝分裂中期细胞。
最后经过空气干燥法制片，对人体外周血淋巴细胞进行染色体核型分析。
【关键字】：人体外周血淋巴细胞染色体核型人工离体培养一．引言:染色体是遗传物质的载体，它具有贮存和传递DNA、控制基因活动和调整基因重组的作用。
人类染色体核型分析是将人的一个体细胞有丝分裂中期的染色体，在技术的基础上，按照染色体的大小和形态特征（主要根据着丝点位置），对染色体进行分组、排队和配对。
这对于探索人类遗传病的发病机理，探讨动物和植物的起源，以及物种间的亲缘关系等都具有重要意义。
直到上世纪50年代，科学家对染色体本身的细致深入研究才成为可能。
染色体组型分析是细胞遗传学研究的基本方法，是研究物种演化、分类以及染色体结构、形态与功能之间，人类G显带核型图谱关系所不可缺少的重要手段。
1952年徐道觉用低渗法使细胞膨胀，使染色体充分分散开来。
1956年，Tjio等用秋水仙素使细胞分裂固定在分裂中期，增加了细胞分裂相。
之后，有科学家建立了人体外周血培养法，使得染色体取材变得更加容易，大大推动了人类对染色体的研究。
二．人体外周血淋巴细胞培养与染色体核型分析1.实验依据：.细胞培养是在体外模拟体内的生理环境，培养从机体中取出的细胞，并使之生存和生长的技术为细胞培养技术。
人类外周血培养及染色体核型分析
人类外周血培养及染色体核型分析一．实验目的1.学习外周血淋巴细胞悬浮培养的原理和方法；2.利用培养后进行分裂的细胞制备人类染色体标本；3.利用人类染色体核型分析软件进行核型分析。
二．实验原理1.外周血中的淋巴细胞几乎都是处在G0或G1期，一般情况下是不分裂的。
当在培养基中加入植物血凝素(PHA)时，这种小淋巴细胞受到刺激后转化为淋巴母细胞，进而开始进行有丝分裂。
2.秋水仙素(colchicine)可以抑制细胞纺锤体的形成，使处在分裂的细胞停留在中期。
因此利用秋水仙素处理可以获得许多同步的中期分裂细胞。
3.在固定细胞之前使用低渗液进行处理，可以使细胞的核膜吸水膨胀，滴片后细胞破裂，染色体分散开来，在显微镜下易于观察和统计，染色效果也明显提高。
三．实验用具及试剂1.实验仪器及用具：恒温培养箱、离心机、恒温水浴箱、冰箱、显微镜、显微数码摄像系统、染色体分析仪；培养瓶、注射器、微量移液器、枪头、吸管、离心管(10ml)、载玻片、烧杯、量筒。
2. 实验试剂：外周血淋巴细胞培养基2%碘酒75%酒精20µg/ml秋水仙素0.075 mol/L KCl溶液甲醇冰醋酸Giemsa原液1/15 mol/L磷酸缓冲液四．实验步骤1、采血：将皮肤常规消毒后静脉采血约0.5 ml。
2、种血及培养：将采到的血样立即接种到培养瓶内，每个培养瓶接25－28滴（约0.5ml），轻轻摇匀后将培养瓶放在37℃温箱中培养72小时。
培养过程中，每天应轻轻摇动两次培养瓶。
3、秋水仙素处理：在终止培养前4小时，向培养瓶中加20µg/ml的秋水仙素20µl，轻轻摇匀后继续培养到72小时。
4、制片：（1）离心：从温箱中取出培养瓶，用吸管将培养液转入10ml的刻度离心管内。
2000转/分，离心10分钟。
（2）低渗：弃去上清液。
加入37℃预热的0.075mol/L KCl低渗液6-8ml，用吸管轻轻吹打均匀，放在37℃恒温水浴中30分钟。
外周血淋巴细胞培养与染色体制备
离心管号
秋水仙素
ug/ml
1（和3对照） 2（和3对照） 3
0.5(1-3h) 1(6-8h) 1(6-8h)
4（书）
1(6-8h)
低渗液ml 预固定ml 固定ml
1+7(20min) 1+7(35min) 1+7(20min) 1+7(20min) 0.5（2min) 5(15min) 0.5(2min) 5(15min) 0.5(2min) 5(15min) 2-3滴(2min) 3(10min)
编号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 X Y
绝对长度/mm 相对长度 短臂/mm 长臂/mm 臂比 着丝粒指数 随体 24.0 0.0778 12.0 12.0 1.0000 0.5000 22.0 0.0713 6.0 16.0 2.6667 0.2727 20.0 0.0648 9.5 10.5 1.1053 0.4750 19.0 0.0616 7.0 12.0 1.7143 0.3684 16.5 0.0535 6.0 10.5 1.7500 0.3636 16.0 0.0519 4.5 11.5 2.5556 0.2813 16.0 0.0519 6.0 10.0 1.6667 0.3750 14.5 0.0470 4.5 10.0 2.2222 0.3103 13.5 0.0438 5.0 8.5 1.7000 0.3704 13.5 0.0438 4.0 9.5 2.3750 0.2963 12.5 0.0405 4.0 8.5 2.1250 0.3200 12.5 0.0405 5.0 7.5 1.5000 0.4000 10.0 0.0324 4.0 6.0 1.5000 0.4000 10.0 0.0324 5.0 5.0 1.0000 0.5000 9.0 0.0292 0.0 9.0 #DIV/0! 0.0000 9.0 0.0292 2.5 6.5 2.6000 0.2778 8.5 0.0276 3.5 5.0 1.4286 0.4118 8.0 0.0259 2.0 6.0 3.0000 0.2500 8.0 0.0259 3.5 4.5 1.2857 0.4375 7.0 0.0227 3.0 4.0 1.3333 0.4286 6.0 0.0194 2.0 4.0 2.0000 0.3333 6.0 0.0194 0.0 6.0 #DIV/0! 0.0000 27.0 0.0875 11.0 16.0 1.4545 0.4074 6.0 0.0194 2.0 4.0 2.0000 0.3333
细胞自主实验_人体外周血淋巴细胞培养与染色体组型76分析
人体外周血淋巴细胞培养与染色体组型分析一、实验背景：人类染色体组型分析是将人的一个体细胞有丝分裂中期的染色体，在技术的基础上，按照染色体的大小和形态特征（主要根据着丝点位置），对染色体进行分组、排队和配对。
这对于探索人类遗传病的发病机理，探讨动物和植物的起源，以及物种间的亲缘关系等都具有重要意义。
通过对人类染色体组型进行分析，可以初步学会对染色体进行分析的方法。
二、实验原理1、细胞培养是在体外模拟体内的生理环境，培养从机体中取出的细胞，并使之生存和生长的技术为细胞培养技术。
要使细胞能在体外长期生长，必须满足两个基本要求：一是供给细胞存活所必需的条件，如适量的水、无机盐、氨基酸、维生素、葡萄糖及其有关的生长因子、氧气、适宜的温度，注意外环境酸碱度和渗透压的调节。
二是严格控制无菌条件。
2、染色体是组成细胞核的基本物质, 是基因的载体。
人类细胞遗传学研究的主要对象是染色体。
本实验采用了微量全血培养技术，既方便又节省人力物力。
在正常情况下, 人外周血中是没有分裂相的, 只有在异常情况下才能发现。
植物血细胞凝集素(PHA) 是人类淋巴细胞有丝分裂的刺激剂,在 PHA 作用下, 原处于 G0期的淋巴细胞转化为淋巴母细胞, 进而进行有丝分裂。
利用 PHA 这一特性, 淋巴细胞经过含有 PHA 培养液培养, 在体外便可获得丰富的含有丝分裂的生长活跃的细胞群体, 终止分裂中期的淋巴细胞, 经过短期培养，秋水仙素的处理，低渗和固定，就可获得大量的中期有丝分裂细胞。
最后经空气干燥法制片，便可得到质量较好的染色体标本。
即可得到所需的人体染色体图形。
染色体组型，又称核型，是指将动物、植物、真菌等的某一个体或某一分类群（亚种、种、属等）的体细胞内的整套染色体，按它们相对恒定的特征排列起来的图像。
核型模式图，是指将一个染色体组的全部染色体逐个按其特征绘制下来，再按长短、形态等特征排列起来的图像。
染色体组型分析就是通过对染色体标本和其照片进行测量、对比分析、配对、分组、排列，对各染色体的形态进行分析。
人的外周血淋巴细胞培养及染色体制作技术
54生物学通报2011年第46卷第3期人体外周血淋巴细胞培养和染色体标本的制备是遗传学和细胞生物学实验教学中的重要实验项目。
染色体是遗传物质的载体，携带着丰富的遗传信息。
只有获得较好的染色体标本才能进行核型分析，进一步深入地研究染色体的形态、变异和畸变及其与表型或症状之间的关系。
人外周血液中的小淋巴细胞几乎都处在G0期或G1期，一般情况下是不分裂的。
在人工离体培养的条件下，在培养液中加入植物血细胞凝素（PHA），则能刺激小淋巴细胞转化为淋巴母细胞而进行有丝分裂。
这样经过短期培养，秋水仙素的处理，低渗和固定，就可获得大量的有丝分裂细胞，经空气干燥法制片，便可获得质量较好的染色体标本。
由于本实验操作过程较繁琐，且实验过程中许多步骤对于实验结果都非常重要，比如PHA效价、外周血接种量、培养温度及酸碱度、秋水仙素加入时间及浓度、低渗时间、固定次数及时间等，所以学生在实验过程中很难全面掌握每个环节，因此，对于学生实验来说实验的成功率也较低。
作者在本实验室现有的条件下，经过长期摸索，总结出了完整且成熟的人外周血淋巴细胞培养及染色体标本制备的实验方法，现将具体方法介绍如下：1材料和方法1.1材料RPMI1640培养基［1］人静脉血：由阜阳师范学院生命科学学院生物科学专业07级学生提供。
1.2方法1）采血。
用一次性2mL注射器抽取肝素稀释液0.2mL，湿润针管，然后将多余的肝素排除。
以75%酒精清洗并消毒供血者肘部皮肤，用橡皮管结扎静脉回流的上端，用注射器抽取静脉血0.5～2mL，然后转动针管，使血液和肝素混合。
2）接种和培养。
先用酒精消毒培养瓶的翻口瓶塞，然后插入针头，将抽得的抗凝血迅速接种到5mL含适量PHA（约0.2mL）及小牛血清的培养瓶中，每瓶接种全血0.4mL左右（6号针头15～20滴），接种过后再次用酒精消毒瓶塞，并在外面用Parafilm封口膜密封好，轻轻摇匀，置37℃培养箱中培养66～72h。
人体外周血淋巴细胞染色体制备与观察实验方案
实验方案实验外周血淋巴细胞培养及染色体标本制备，染色体组型分析一、实验目的1、了解动物细胞培养的方法。
掌握人体外周血淋巴细胞培养与染色体标本制备。
2、初步掌握人类染色体G－带的显示方法及人类染色体G－带在染色体识别中的意义。
3、熟悉人类染色体的镜下检查和核型分析方法。
初步掌握人类染色体G带的特征及其识别。
二、实验原理所谓外周血培养即是将外周血接种在适当的培培养物中加入适量的秋水仙素，使纺锤体微管解聚，这样细胞停留在中期，可以获得大量的分裂细胞。
用低渗盐溶液（一般是0.075mol/L的KCl）处理，使其中的红细胞及分裂相细胞膜和一部分细胞质除去，最后以气干法制片，可获得较好的染色体养基中进行培养。
人类外周血细胞本来是终末分化细胞，一般没有分裂能力，但经PHA（植物血球凝集素）或ConA等药物刺激后，转变成可分裂的转化细胞。
染色体显带是将染色体标本经过一定程序处理，并用特定染料染色，使染色体沿其长轴显现明暗或深浅相间的横行带纹――染色体带，这种技术，称为染色体显带技术。
通过显带，人们可以准确地识别每一条染色体及染色体上的各个区段，并可发现染色体上较细微的结构变化。
在所有的显带技术中，G显带（G banding）是最常见的显带技术，它是将染色体标本用碱、胰蛋白酶或其它盐溶液处理后，再用Giemsa染液染色，在普通显微镜下，可见深浅相间的带纹，称G带（G band）。
G显带方法简便，带纹清晰，染色体标本可以长期保存，因此被广泛用于染色体病的诊断和研究。
正常人类染色体的数目为46条(23对)，1960年的Denver会议和1963年的London会议制定了统一的人类染色体命名体制：按照染色体的相对长度、臂比和着丝粒指数，将常染色体（22对）按大小用阿拉伯数字标记，顺次排列为1～22号，性染色体用X和Y标记；并按染色体大小和着丝粒位置，把人类染色体分为七个组，用大写字母A～G表示。
染色体经显带处理后，每条染色体都显示出其特定的带纹特征（见下表）。
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人的外周血淋巴细胞培养及染色体制片方法、染色体组型分析一、实验背景1、Carnoy固定液：固定液的重要特性是能迅速穿透细胞，将其固定并维持染色体结构的完整性，还要能够增强染色体的嗜碱性，达到优良染色效果。
单纯的固定液一般难以达到这些要求，因此在实验中使用两种混合的固定液。
由于Carnoy首先使用的甲醇和冰乙酸混合液而称其为卡诺氏固定液。
Carnoy固定液（甲醇∶冰乙酸=3∶1）每次使用前需临时配制，长时间放置影响固定效果，固定时间15min至24h，冰箱、室温均可。
必要时可改变甲醇和冰乙酸的比例，冰乙酸比例增加，利于细胞膨胀、染色体铺展，但易导致细胞破裂、染色体散失。
2、低渗液（hypotonic solution）低渗液是指渗透压和离子强度均低于正常细胞生理条件的溶液，渗透压低于组织液，与外周血混在一起时，水分迅速进入细胞，使其膨胀，甚至破裂，获得分散良好的染色体分裂象。
常见的低渗液：水、低渗的柠檬酸钠或氯化钠、甘油磷酸钾（0.65mol/L）、氯化钾（0.075mol/L）等。
低渗效果取决于低渗液的化学组成、低渗的温度和处理时间。
低渗处理是凭借反渗透作用使细胞膨胀染色体铺展，同时可使黏附于染色体的核仁物质散开，以便能在一个平面上观察所有染色体形态。
实验室中一般选用0.075mol/L KCl为低渗液，其优点有：①染色体轮廓清楚，可染色性强，染色时间短。
②用于显带染色时能充分显示带型特点。
低渗处理为37℃，25～30min，以预实验条件为准。
2、肝素N-硫酸和艾杜糖醛酸含量较多的一种糖胺聚糖，由D-β-葡糖醛酸(或L-α-艾杜糖醛酸)和N-乙酰氨基葡糖形成重复二糖单位组成的多糖。
肝素是一种抗凝剂，是由二种多糖交替连接而成的多聚体，在体内外都有抗凝血作用。
2、PHA植物血凝素(Phytohaemagglutinin)是一种有丝分裂原，主要用于激活免疫细胞—淋巴细胞。
是一种干扰素诱导剂，不仅可以刺激机体产生白介素-2和干扰素；还可以刺激机体产生非特异性抗体。
由于其较难提纯，且成本极高，所以一直以来仅在实验室中作为刺激淋巴细胞增殖的试剂。
3、青霉素和链霉素青霉素：青霉素是抗菌素的一种，是指从青霉菌培养液中提制的分子中含有青霉烷、能破坏细菌的细胞壁并在细菌细胞的繁殖期起杀菌作用的一类抗生素，是第一种能够治疗人类疾病的抗生素。
链霉素对许多革兰阴性杆菌有抗菌作用。
链霉素对葡萄球菌属及其他革兰阳性球菌的作用差。
链霉素的作用在PH值为7.8时最强，PH值降至6或6以下时则大大减弱。
四环素作用机制为药物能特异性地与细菌核糖体30S亚基的A位置结合，抑制肽链的增长和影响细菌蛋白质的合成。
4、秋水仙素秋水仙能素破坏纺锤体,阻断细胞有丝分裂,使分裂的细胞全部阻止在中期。
实验中要严格控制培养物中秋水仙素的浓度,不仅保证有效的终止细胞第一次分裂,而且使秋水仙素的细胞毒性降到最低,并保持染色体的适宜长度,便于分析畸变。
秋水仙素浓度过高,处理时间长,不但产生细胞毒性作用,使分裂相减少,而且染色体过于缩短,难以进行分析,而秋水仙素有效浓度过低则不能有效阻断细胞分裂。
当然个体差异也会影响培养结果,其他重要因素如培养基种类和质量、PHA的效价会影响分裂相的多少,低渗,固定,制片等环节也会影响染色体标本制备的效果。
所以染色体培养和标本制备的每一步都应该小心谨慎,做到准确无误。
在实验中不断总结经验,提高染色体标本制备的效果。
由于秋水仙素的加入浓度较低,配制和加入的时候必须精确。
很可能因为一点点操作误差就会影响整个标本制备的效果,应引起注意。
二、目的要求：1、学习人体细胞离体培养的方法.2、掌握制作人染色体标本的方法.3、观察人类染色体的形态和染色体数目4、熟悉染色体组型分析.三、实验原理：人的外周血淋巴细胞培养方法是1960年由Moorhead 提出来的。
正常情况下，人外周血小淋巴细胞都处在G1期（或G0期），但在体外给予一定的条件，进行培养，经72 h 就可获得大量的有丝分裂细胞。
这种取材简易、用血量少的培养方法已被广泛采用。
在培养液中加入植物血凝素（PHA），淋巴细胞受到刺激可转化为淋巴母细胞，进入有丝分裂。
短期培养后，经秋水仙素处理，可抑制细胞分裂时纺锤丝的形成，使细胞分裂停止在中期，同时它可改变细胞质的黏度，引起染色体在细胞质中分散。
经低渗和固定，即可得到大量的、分散效果好的染色体分裂象。
人体的1ml外周血中一般含有约（1～3）×106个小淋巴细胞，足够染色体标本制备和分析之用。
本节介绍了外周血淋巴细胞的悬浮培养法，以及染色体标本的制备。
各种生物染色体的数目、形态和结构都是恒定的。
染色体组型，也称为核型，指一个个体或物种的特有的染色体构成，包括染色体数目以及每一条染色体所特有的形态特征（染色体的长度、着丝粒的位置、臂比值、随体的有无、次级缢痕的数目及位置、异染色质的分布等）。
核型是物种最稳定的性状和标志，通常在体细胞有丝分裂中期时进行核型的分析鉴定，也可利用减数分裂期的染色体进行分析鉴定。
染色体组型分析就是通过对染色体标本和其照片进行测量、对比分析、配对、分组、排列，对各染色体的形态进行分析。
在细胞遗传学、现代分类学、生物进化和遗传育种学等研究中，是重要的研究手段。
绝对长度（μm）=放大的染色体长度÷放大倍数染色体组总长度=该细胞单倍体全部染色体长度（包括性染色体）之和相对长度（%）=每个染色体长度÷染色体组总长度×100臂比=长臂长度÷短臂长度着丝粒指数=短臂÷该染色体长度×100三、试剂和器材：1、材料人的静脉外周血.2、试剂RPMI l640培养液,小牛血清,肝素,PHA（植物血球凝集素）,青霉素,链霉索,5%NaHCO3,碘酒,75%乙醇,秋水仙素,生理盐水,甲醇,冰醋酸,石碳酸品红,纯酒精，冰乙酸，Giemsa粉末KCl低渗液，双蒸水，NaCl ，PHA，肝素溶液，KCl，甘油，Na2HPO4 ，KH2PO4等3、器材恒温培养箱,电冰箱,高压灭菌锅,离心机,真空泵,分析天平,显微镜,超净工作台,注射器,离心管,培养瓶,试管架,量桶,烧杯,酒精灯,抽滤瓶,G6型号细菌过滤漏斗等。
.四、操作方法1、药品器皿的无菌处理(1) 实验用的所有器皿,器具都必须按规定洗净,高压灭菌处理备用.(2) 实验用全部药品都要经高压灭菌或过滤除菌处理.具有生物活性的药品要经G6型号细菌过滤漏斗抽滤除菌,其它药品可经过高压灭菌。
2、各种药品及培养基的配制(1) RPMI l640基础培养基的配制：称取RPMI l640 培养粉9.8g溶于1,000 mL双蒸水中,经G6型号细菌过滤漏斗抽滤后备用.使用前最好做热源培养以确保实验顺利进行.(2) 5% NaHCO3的配制：称取5g NaHCO3,溶于100mL蒸馏水中,高压灭菌备用.(3) 生理盐水的配制：称取0.85g NaCl 溶于l00mL蒸馏水中高压灭菌备用.(4) PHA(植物血球凝集素)的配制：称取PHA 50mg配制成浓度为lmg/mL (生理盐水配制)的溶液.由于PHA使用量较少,配制时使用注射器式无菌过滤器,以减少药品损失.(5) 肝素溶液的配制：用生理盐水按效价单位配成500单位/mL,高压灭菌后备用.(6) 双抗溶液的配制：将青,链霉素用生理盐水按效价单位配成l0万单位/mL,配制过程要求使用注射器式无菌过滤器.(7) 秋水仙素溶液的配制：用生理盐水配制成浓度为40（微克/mL）秋水仙素溶液,使用注射器式无菌过滤器进行除菌操作.(8) 低渗液溶液的配制：称取5.59g KCl溶于1,000mL双蒸馏水中,配制成溶液浓度为0.075 M 的低渗液溶液.(9) 细胞培养基的配制：在每个培养瓶中假如RPMI l640基础培养基4mL,小牛血清l mL,肝素3滴,PHA 0.3 mL, 加入双抗至最终浓度为100单位/mL,NaHCO3调pH至7. 2～7. 4. （10）固定液的配制：9ml纯酒精+3ml冰乙酸（11）Giemsa（吉姆斯）染液Giemsa原液配制：称Giemsa粉末0.5g，加几滴甘油研磨，再加入甘油（使加入的甘油总量为33ml）。
56℃中保温90～120min。
加入33ml甲醇，置棕色瓶中保存。
使用时按要求用PBS 稀释，一般稀释10倍。
注:PBS含0.05%吐温－20的pH7.4的磷酸盐缓冲液(简称为PBS－T)配制方法为：PBS缓冲液（pH7.2～7.4）：NaCl 137mmol/L，KCl 2.7mmol/L，Na2HPO4 4.3mmol/L，KH2PO4 1.4mmol/LPBS缓冲液一般作为溶剂，起溶解保护试剂的作用，具体试剂一般也有不同的比例配方，在针对性上就有了更好的效果。
3、实验步骤（1）接种全血在无菌条件下，用灭菌注射器吸取0.2%肝素液（生理盐水配制，灭菌）0.2ml，湿润针筒后，采静脉血1～2ml、转动注射器使血液与肝素充分混匀。
无菌条件下，将肝素化血液滴入至外周血培养基内，每5ml培养液内滴入血滴28～30滴（7号针头）轻轻混匀。
（2）血细胞培养将细胞培养瓶放在37℃±0.5的恒温培养箱中培养,每天至少摇动培养瓶一次,以保证培养液通气. 置37℃恒温箱内，静止培养68～72h。
注意第二天观察培养液有无凝血、溶血或长菌的现象，可每天将培养液摇一摇以便细胞得到充分培养。
(3)、秋水仙素处理终止培养前2～3h，加入浓度为20μg/ml的秋水仙素，每5ml培养基中用7号针头，加3～4滴使最终浓度为0.1μg/ml。
轻轻摇匀后，再放入恒温箱内，继续培养2～3h，以积累较多停止在中期的分裂象6、低渗处理细胞培养至72h后,小心地从培养箱中取出培养瓶,轻轻地打开瓶塞,切记不要震荡,避免沉淀的细胞悬浮起来,不利于实验操作.然后用吸管弃去上清液,再加入经37℃培养箱预温的低渗液5mL,盖上瓶塞,轻轻摇动让细胞悬浮起来与低渗液充分混匀.再放回37℃温箱中,保温低渗20min.7、收集细胞把低渗后的细胞悬液全部移入离心管中,以1,000转/分速度离心10min.8、固定离心后弃去上清液,轻轻敲打离心管底部以便让沉淀细胞松动开,再加入新配制的5mL固定液.加固定液时要有冲力,靠冲力把细胞冲散,以防细胞固定成团块.室温下固定15min以后,再离心.9、重复固定去掉清液后,再重复做8的过程.10、滴片弃掉上清液之后,根据离心管壁回留量与沉淀细胞量的多少,再加入少量(约0.2～0.3 mL)固定液制成细胞悬浮液.然后,将2-4滴细胞悬浮液均匀地滴在冰水预冷的载片上.为了便于细胞分散和破裂,滴片时应使滴管与载玻片之间保持一定距离,大约20-30 cm为宜.最后,空气干燥. 11、染色. 标本晾干后，即可用染液（Giemsa液原液1份，pH6.8的磷酸缓冲液9份）染色15min，自来水冲洗后（从背面冲洗）晾干。