酶工程笔记和期末重点

第五章生物药物的酶学分析法
酶学分析法原理：利用酶作为分析工具，测定样品中待测物质含量的方法称作酶法分析。

待测物质应是酶的底物，或者是酶的抑制剂、活化剂或酶的辅因子，否则不能采用酶法进行分析检查。

酶法分析可分为终点法和反应速度法。

（一）终点法，又称总变量法
基本原理：利用酶的生物催化反应，使待测物质发生转化，然后测定产物产量或底物残余量，通过定量分析，从而明确待测物质的含量。

可以是单酶反应，也可以是几种酶构成的偶联酶反应。

在生物药物分析中，终点法是最常用的酶法分析。

终点法的条件
必须有专一地作用该被测物质的酶，并能得到它的制品。

能够确定使这种酶反应接近进行完全的条件。

反应中底物的减少或产物的增加或辅酶物质的改变等可以借助某种简单的方法进行测定。

在能满足这些条件的情况下，最好是采用单一酶反应就能进行定量检测。

使用终点法应注意的问题
1．酶的底物专一性：
绝对专一性
相对专一性
立体异构专一性
对于酶法分析来说，最理想的酶是具有绝对专一性的酶。

若样品中存在除待测物质外其他可作为底物的物质时，可利用偶联酶的专一性进行区别定量分析。

2．反应的平衡
对于终点法来说，要求反应接近进行完全，故对不同的酶反应须采取不同的措施使反应进行到接近完全。

若酶反应平衡十分偏向进行方向，则可方便的用终点法进行检测，不需进行任何处理。

若反应的平衡并不十分偏向进行方向，或偏向逆方向，那么由于反应不能完全，因而也就不能正常定量。

为了解决这一问题，通常采取以下一些措施：
对于双底物反应尽可能提高第二底物的浓度
对氧化还原之类与H＋有关的反应要选择适当的pH
设法除去产物
用具有不同平衡常数的辅酶类似物代替原有的辅酶
和第二底物的再生系统偶联，则第一底物可能完全转化为反应产物
3．反应液中的酶量
对于一个具体的测定来说不同的酶反应有不同的Km值，通过米氏方程和均相溶液反应的动力学推算和分析，可以大致得到如下的结论：
对于单酶反应的酶法分析：所加入的酶量（u/ml）相当于Km（mmol）
对于偶联反应的酶法分析，所加入的酶量如下：
第一反应为酶量（u/ml）相当于Km1（mmol）
第二反应为酶量（u/ml）相当于（1～2）×Km2（mmol）
4.反应产物抑制
若产物对反应本身有抑制作用，则就会妨碍反应进行，在这种情况下可采取将该产物除去或者和再生系统偶联的办法解决。

如：激酶反应生成的ADP 往往能抑制该反应，但此时若和丙酮酸激酶（E.C.2.7.1.40）偶联，使ATP 再生。

S
丙酮
酸激酶
磷酸烯醇或丙酮酸
二、反应速度法
利用酶促反应进行定量分析时，多数使用终点法，只有在下列两种情况下才使用反应速度法。

1
． 很难得到专一地作用并定量转化被测物质的酶或偶联指示酶
时
2． 被测物及其微量时
以上两种情况下，不能用终点法进行测定只能使用速度法，使用速度法可对S 、抑制剂、激动剂、辅酶等定量。

酶循环放大分析法
酶循环放大的原理和步骤
酶循环（Enzyme cycling）,具有化学放大作用，理论上可无限放大其灵敏度。

酶循环放大分析法是利用酶循环所设计的一种超微分析法。

目前可准确定量10-15～10-18mol/L的生化物质。

本分析法结合三个步骤：转换反应、循环反应和指示反应。

第二步：循环反应
可作循环底物
第二步：循环反应
α-酮戊二酸Glu
甘油醛
n次循环
3-
第三步：指示反应：利用终点法测Glu（或3磷酸甘油酸）的量
如何测得循环数n？
用已知量的NADH已知作为NADH转在相同条件下进行循环反应和指示反应NADH已知=NADH指示/n
n=NADH指示/NADH已知
（即用已知量的NADH已知平行做循环反应，指示反应）
在这种方法中应注意的几个问题：
1.在进行循环反应之前，必须设法除去转换反应中剩余的辅酶，在上例中就是设法除去NAD+除去的方式：NAD和NADP的氧化型和还原型在不同的pH值下其稳定性不同，可通过调节pH来达到目的
第二步：循环反应
α-酮戊二酸
Glu脱氢酶
Glu
NAD+
甘油醛
甘油酸）
n次循环
3-P
NAD+ NADP+ (氧化型) NADH NADPH(还原型)
pH2 （25℃） 1h 稳定 5min99.9%被破坏 pH13（60 ℃） 10min99.9%被破坏 1001h 仍稳定 2.在循环反应中，底物（不是辅酶）需够量 辅酶，在上面的例子中就是设法除去NAD
除去的方式：NAD 和NADP 的氧化型和还原型在不同的
PH 值下其稳定性不同，可通过调节PH 来达到目的
NAD + NADP +（氧化型）NADH NADPH （还原型）
PH2（25摄氏度）PH13（60摄氏度）
1小时稳定5min99.9%被破坏10分钟99.9%被破坏100 1小时仍稳定2、在循环反应中，底物（不是辅酶）需够量
循环反应：Pb Sb
[Sa]>>K [Sb]>>K mEa mEb
3、要用已知量的循环底物（上例中NADH ）平行做循环反应和指示反应以求得循环数n
4．要用已知量的循环底物（上例中NADH ）平行做循环反应和指示反应以求得循环数n 酶循环放大法的特点和应用范围
（一） 特点
1、本方法灵敏度高，其灵敏度远远超过比色法、荧光法和放射性同位素法。

比色法 荧光法 放射法 酶循环放大法 检测限 10-6mol 10-10mol 10-12mol 10-15mol 试样量 一般需ug 级（100ug ） 〈ng 反应液体积 一般需ul 级（100ul ） 〈nl
2、本法的特异性较强，在分析生物样品时，不需分离纯化，可直接测定。

样品中如含吸光性或荧光性杂质一般不影响测定，因可充分稀释样品使干扰物的影响降为几乎0。

3、循环率极高 一般NAD 循环 2×104／小时 CoA 循环 3×104/小时
（二）应用范围
1.有循环底物参加的酶反应的底物或酶可测定NAD 、NADP 、CoA 等
2. 能与以上反应偶联的酶反应的底物或酶可测定。

二）应用范围
1、有循环底物参加的酶反应的底物或酶可测定
NAD 、NADP 、CoA 等2、能与以上反应偶联的酶反应的底物或酶可测定如：G-6-P+ADP
G 醛酸-6-P +H +
可测G 、可测ATP 、也可测HK
酶法分析的特征
酶法分析与酶活力测定的异同
相同点：二者均使用了酶促反应
不同点：测定的目的物不同，实验设计不同
酶活力测定中待测物为酶，因而酶必须是限速因素，而底物和辅酶等必须过量；
酶法分析中待测物不是酶，而是底物或辅酶或抑制剂或激动剂等等。

因而必须使待测物成为该反应的限速因素。

因此二者是不相酶法分析与酶活力测定的异同同的，不能混为一谈。

第六章抗生素药物的分析
一、抗生素药物
1、抗生素
抗生素是指在低微浓度下即可对某些生命活动有特异抑制作用的化学物质。

抗生素主要是细菌、放线菌和真菌等微生物的代谢产物，对各种病原微生物有强大的抑制或杀灭作用。

抗生素药物的检查项目包括：
①鉴别试验②异常毒性试验③无菌试验④热原试验⑤降压试验⑥酸碱度试验
⑦水分测定⑧溶液澄清度检查⑨效价测定⑩其他检测（抗生素组分、有关物质、比重度、熔点、晶型、溶媒残留量、重金属、溶出度等）。

抗生素效价单位
抗生素效价的标示量，原则上应按所含特定的抗菌活性部分的重量来计算。

在应用中，抗生素类药物有效成分的表示方法，是按照各种抗生素的特点及使用经验，采用符合客观实际的效价单位表示。

常用的抗生素效价单位有重量单位、类似重量单位、重量折算单位、特定单位。

（1）重量单位以抗生素中所含特定的抗菌活性部分（纯游离碱或游离酸）的重量1μg 作为1单位，即1mg=1000单位。

如链霉素、红霉素、卡那霉素、新霉素、庆大霉素、土霉素；氯霉素、新生霉素酸、利福霉素SV等均以重量单位表示。

用这种方法表示，对不同有机酸根的同一抗生素，只要单位一样或有效部分重量一样，则这一抗生素的各种盐类虽然称重不同，但实际有效含量是相同的。

（2）类似重量单位 以特定的纯抗生素制品盐的重量1μg 作为一个单位，即1mg ＝1000单位，其中包括了无抗菌活性的酸根在内。

如四环素盐酸盐（包括无生物活性的盐酸根在内）。

这种类似重量单位，虽然并不合理，但在国际上已经习惯沿用。

（3）重量折算单位 以特定的纯抗生素制品的某一重量为一个单位而加以折算。

如青霉素国际标准品（1952年）青霉素G 钠称重0.5998μg 为1单位，即1mg=1670单位，则80万单位的青霉素G 钠称重应为0.48g 。

（4）特定单位 以一特定量的抗生素标准品（或对照品）作为1单位。

如第一批杆菌肽国际标准品（1953年）杆菌肽A 为1mg=55单位。

制霉菌素（1963年）为1mg=3000单位等。

这类抗生素的效价单位的精确定义很难确定，折算效价也难以计算，只能以国际标准品的效价单位，作为比较的基准。

目前，抗生素的剂量原则上以纯品的重量表示，并加注单位。

如土霉素0.25g （250000单位）；但个别品种仍以习惯沿用，如青霉素仍用单位表示剂量。

第二节 β-内酰胺类抗生素的分析 一、结构及分类
6-APA ）；青霉素类；
-氨基头孢菌烷酸（7-ACA ）；头孢菌素类；
㈡ 理化性质
1、酸性与溶解性
2、旋光性
3、紫外吸收特性
4、不稳定性
一、结构特点与性质 （一）羧基 酸性
与碱金属(Na+、K+)成盐； 与有机碱(普鲁卡因)成盐； （二）手性碳 旋光性 青霉素类 C3 C5 C6 ； 头孢菌素类 C6 C7
（三）共轭体系：青霉素类母核无明显UV 多数有苯环取代基
头孢菌素类母核有共轭体系
（四）β–内酰胺环的不稳定性
青霉素的降解途径，与含水量和纯度密切相关
不稳定性因素1、四元环张力大2、酰胺键易水解
干燥纯净稳定
水溶液不稳定
青霉素类在某些氧化剂、酸、碱、青霉素酶（某些金属离子）（温度）降解失效。

青霉素的降解产物
青霉噻唑酸－青霉素酶
青霉酸－强酸性环境
青霉烯酸－弱酸性环境
青霉醛－强酸性-加热
青霉胺－强酸性-加热/青霉素酶-重金属
二、鉴别反应
（一）显色反应：1、异羟肟酸铁反应
2. 茚三酮反应
α-氨基茚三酮蓝紫色
加热
3、双缩脲反应
β-内酰胺类在碱性酒石酸铜作用下（开环分解）呈蓝紫色
4、与重氮苯磺酸反应头孢哌酮（酚羟基）
1.头孢他啶聚合物的测定分子排阻色谱法
固定相：葡聚糖凝胶G-10
流动相A：3.5%硫酸铵的0.01mol/L磷酸盐缓冲液
流动相B：0.01%十二烷基硫酸钠
对照品溶液：头孢他啶对照品100µg/ml
2.头孢呋辛酯中有关物质和异构体的检查
固定相：ODS
流动相：0.2mol/L磷酸二氢铵-甲醇（62:38）
1）头孢呋辛酯Δ2-异构体的制备：头孢呋辛酯对
照品+流动相头孢呋辛酯Δ2-异构体。

2）系统适用性试验：各异构体之间的R>1.5，以
头孢呋辛酯A异构体计算n>1500。

3、头孢氨苄中有关物质的检查-反相TLC法
固定相：活化后的硅胶G板置5%（V/V）正十四烷的正己烷溶液中，展至顶部，凉干
展开剂：0.1mol/L枸橼酸-0.2mol/L磷酸氢二钠-丙酮（120：80：3）
供试液：本品50mg/ml
对照液（1）：本品0.5 mg/ml
对照液（2）：α-苯甘氨酸0.5 mg/ml
对照液（3）：7-氨基去乙酰氧基头孢烷酸0.5 mg/ml
结果判断：供试液如显杂质斑点，与对照液（2）（3）位置相同上所的斑点比较，其颜色不得更深；如显其他杂质斑点，与对照液（1）所显的主斑点比较，其颜色不得更深。

四、含量测定-容量法和仪器分析法
（一）高效液相色谱法
原理：利用青霉素类抗生素在一定条件下在反相硅胶上的保留行为的不同而实现高效分离，并与标准品相对照，而对其进行定量的一种方法。

第三节氨基糖苷类抗生素
含量测定
HPLC法各国药典主要采用
抗生素类药物中高分子杂质的检查
外源性杂质：蛋白、多肽、多糖或抗生素与蛋白、多肽、多糖的结合物。

主要来自于发酵工艺，致敏，如青霉噻唑蛋白、青霉噻唑多肽。

内源性杂质：药物的自身聚合物，来自于生产、贮存过程。

可引发过敏。

特点：
（1）生产过程中的任何蛋白或碎片都可带入产品中，易与药物形成多肽类杂质
（2）形成的聚合物也可发生不同程度的降解
（3）异构体之间可以相互聚合－L-L、D-D、L-D
（4）高分子杂质与生产工艺密切相关
高分子杂质的控制方法
（1）高效液相色谱法
（2）凝胶色谱－自身对照外标法Sephadex G-10
（3）离子交换色谱
凝胶色谱法：利用凝胶的分子筛作用，让药物分子自由的进入到凝胶颗粒内部，而高分子杂质被排阻的原理进行的。

故此大分子则先流出色谱柱，小分子后出峰而得以分离。

高分子杂质的分析方法
分析方法
1、HPLC系统
2、简单测定系统
色谱适用性条件
（1）蓝色葡聚糖在高分子分离中的N＞2500/m，拖尾因子0.75～1.5
（2）峰面积的RSD＜5％
抗生素效价的微生物检定法
琼脂扩散法(diffuse method即管碟法)
管碟法是目前国际上测定抗生素效价的通用方法。

我国药典收载的微生物检定法也是管碟法。

此法灵敏度高，但操作较麻烦，影响试验结果的因素较多，需要从各个操作步骤严格控制试验条件，尽可能减小试验误差，才能使试验结果达到精密、准确。

二、管碟法测定效价
1、管碟法的原理
管碟法是利用抗生素在摊布特定试验菌的琼脂培养基内扩散，形成含一定浓度抗生素的球型区，抑制了试验菌的繁殖，通过透明琼脂培养基，可观察到透明的抑菌圈。

在一定的抗生素浓度范围内，对数浓度（剂量）与抑菌圈面积或直径成正比。

方法设计是在同样条件下将已知效价的标准品溶液与未知效价的供试品溶液的剂量反应（抑菌圈）进行比较；
当标准品和供试品是属于同一性质的抗生素时，标准品溶液和供试品溶液，对一定试验菌所得的剂量反应曲线，在一定剂量范围内应互相平行。

根据以上原理，可设计为一剂量法、二剂量法及三剂量法等，从而可以较为准确地测定供试品的效价。

第七章维生素及辅酶类药物的分析
如果人体缺少某种维生素，就会引起维生素缺乏症，而影响人体的正常生理机能。

VitA 缺乏—夜盲症VitB1缺乏—脚气病VitC 缺乏—坏血病VitD 缺乏—佝偻病
[ ]
结构特点：
（1）环己烯+ 共轭多烯侧链；5个双键
（2）存在多种立体异构体，具有UV吸收天然VitA 侧链为全反式；
（3）通常所说的维生素A是指维生素A1
（4）天然来源为鱼肝油，主要为醋酸酯和棕榈酸酯。

目前多为人工合成产物
维生素A
一、性质
不稳定性
共轭多烯侧链--性质不稳定; 临床用其醋酸酯或棕榈酸酯的油溶液
维生素A的氧化产物：无生物活性
紫外吸收特性
具有共轭多烯侧链—紫外吸收。

λmax = 325～328nm，
随VA存在状态以及所用的溶剂，最大吸收波长的位置有所不同
与SbCl3呈色—Carr-Price λmax = 620nm
鉴别
含量测定
二、鉴别试验
（一）三氯化锑反应Carr-Price
反应机理：VA与三氯化锑(SbCl3)中存在的SbCl5作用形成不稳定的蓝色正碳离子。

注意事项：反应需在无水、无醇条件下进行。

水可使SbCl3水解成SbOCl
乙醇可与正碳离子作用，使正电荷消失
溶剂：无水三氯化锑的无醇氯仿溶液
（二）紫外分光光度法UV
VitA：5个共轭双键，无水乙醇液λmax=326nm
VitA2、A3：6个共轭双键，红移
（三）薄层色谱法TLC
目的：鉴别醇或酯，是醋酸酯或其他酸酯
含量测定
（一）紫外-可见分光光度法Ch.P 2015
利用共轭多烯结构，在325～328nm处有选择性吸收峰
方法：三点校正法——三波长测定法
（1）原因
为了消除杂质（相关物质）吸收所引起的误差
相关物质—结构相似,维生素A最大吸收波长附近也有吸收，对测定有影响。

＊Morton和Stubbs等人在1946年提出了三点校正法。

（2）原理：假定、根据
a:杂质吸收在310nm～340nm范围近似呈一条直线
第八章核酸与核苷酸类药物的分析
一、鉴别
（一）化学鉴别
1、戊糖的鉴别
（1）地衣酚反应
（2）二苯胺反应
2、磷酸盐的鉴别
3、嘌呤碱的鉴别
（二）光谱鉴别
1、紫外吸收光谱
2、红外吸收光谱
三、含量测定。