细菌内毒素检查方法的研究

左卡尼汀注射液细菌内毒素检查方法的研究
概述：左卡尼汀，是一种广泛存在于机体组织内的氨基酸，其重要功能是促进其氧化分解，为细胞提供能量，促进脂类代谢。

临床上主要用于治疗冠心病、心绞痛、心律失常，亦可作为治疗血液透析患者的辅助药物。

目前《中国药典》2010年版并未收录该品种。

也尚无国家标准对其进行细菌内毒素检查。

因此，参照《中国药典》2010年版二部附录收载的细菌内毒素检查法，对本品进行了细菌内毒素检查的方法研究。

1．验证目的
1.1 考察鲎试剂的灵敏度是否准确；
1.2 考察检验人员的操作方法是否准确及试验条件是否符合规定；
1.3 检验在某一浓度下的供试品对于鲎试剂与内毒素有无干扰作用。

2．验证要求
为确保细菌内毒素检验结果的准确可靠，当建立产品的细菌内毒素检查时，需确定供试品在多大的稀释倍数或浓度下对内毒素和鲎试剂的反应不存在干扰作用，为能否使用细菌内毒素检查法提供依据。

并且验证当供试品的配方和工艺有变化，鲎试剂来源改变或供试品阳性时供试品是否存在干扰作用。

由于干扰试验检验的是在供试品存在的情况下内毒素与鲎试剂的反应是否正常，与所使用鲎试剂灵敏度无关，因此在干扰实验中原
则上可使用任一灵敏度的鲎试剂。

3．验证材料及设备
3.1 样品信息
3.1.1 样品名称:左卡尼汀注射液
3.1.2 批号：10100901、10101001、10101101
3.1.3 规格：5ml:1g
3.2 仪器与试药
3.2.1 仪器:ET-96内毒素凝胶法测定仪；ZH-2型自动漩涡混合器。

3.2.2 试药:细菌内毒素工作标准品(规格：每支10 EU，批号：1007010，湛江博康海洋生物有限公司)；细菌内毒素检查用水(BET 水，规格：每支5ml，批号：100507，湛江博康海洋生物有限公司)；鲎试剂A(TAL，规格：每支0.1ml，批号：1002031、1005100，灵敏度分别为:0.250、0.500 EU／ml，湛江博康海洋生物有限公司)；鲎试剂B(TAL，规格：每支0.1ml，批号:100802，灵敏度为:0.500EU ／ml，厦门市鲎试剂实验厂有限公司)；左卡尼汀注射液(规格：
5ml:1g，批号：10100901、10101001、10101101)。

4 方法与结果
4.1 细菌内毒素限值的确定
按《中国药典》2010年版二部中细菌内毒素检查法的规定，根据公式L=K／M，式中L为供试品的细菌内毒素限值，K为按规定的给药途径，人用每公斤体重每小时最大可接受的内毒素剂量，注射剂
K=5 EU／(kg·h)，M为人用每公斤体重每小时的最大供试品剂量，人均体重按60kg计算，注射时间若不足1 h，按1 h计算。

根据产品说明书，单次血透后最大剂量是10～20 mg／kg，2～3 min静脉推注1次，故左卡尼汀注射液的成人临床用量单次使用剂量按20mg计算，人均体重按60kg计算，推注时间按1 h计算，则M=20 mg／(kg·h)，L=K／M=5／20=0.25EU／mg。

故确定本品细菌内毒素限值为0.1EU／mg。

4.2 鲎试剂灵敏度复核试验
按照《中国药典》2010年版二部附录细菌内毒素检查法规定，进行鲎试剂的标示灵敏度(λ)复核。

结果见表1～表3。

表1 鲎试剂灵敏度复核试验(1002031批)
λc=lg-1( 4/X)
=lg-1［(lg0.125+lg0.125+lg0.25+lg0.25)/4]
=0.177(EU/ml)
λc在0.5λ～2λ范围内，符合规定。

故1002031批鲎试剂以标示灵敏度0.250 EU/ml为该批鲎试剂的灵敏度。

表2 鲎试剂灵敏度复核试验(1005100批)
λc=lg-1(∑4/X)
=lg-1［(lg0.250+lg0.500+lg1.000+lg0.500)/4]
=0.500(EU/ml)
λc在0.5λ～2λ范围内，符合规定。

故1005100批鲎试剂以标示灵敏度0.500 EU/ml为该批鲎试剂的灵敏度。

表3 鲎试剂灵敏度复核试验(100802批)
λc=lg-1(∑4/X)
=lg-1［(lg0.250+lg0.250+lg0.500+lg0.250)/4]
=0.297(EU/ml)
λc在0.5λ～2λ范围内，符合规定。

故1000802批鲎试剂以标示灵敏度0.500 EU/ml为该批鲎试剂的灵敏度。

4.3 干扰预试验
4.3.1 鲎试剂浓度目前用于药品检验的市售鲎试剂灵敏度(λ)一般在0.50～0.03 EU／ml范围内，最小有效稀释浓度c=λ／L，(L=0.1 EU／mg)，故左卡尼汀注射液进行细菌内毒素检测时，0.50～
0.03 EU/ml的鲎试剂相对应的最小有效稀释浓度为5.00、2.50、
1.25、0.60、0.30mg／ml。

4.3.2 预试验取3批左卡尼汀注射液，用BET水将样品稀释成20.000、10.000、
5.000、2.500、1.250、0.600mg／ml，共6个浓度梯度的溶液。

将此系列浓度溶液标记为供试品管(NPC系列)。

用上述稀释液作为溶剂，溶解并稀释细菌内毒素工作标准品，制得每个稀释度中细菌内毒素含量均为2λ(1.000 EU／ml和0.5000 EU／m1)的左卡尼汀注射液溶液，标记此系列溶液为供试品阳性对照管（PPC系列)。

取灵敏度为0.500 EU／ml和0.250 EU／ml的鲎试剂进行试验，每一稀释度做2管，同时另取2支加入细菌内毒素检查用水作为阴性对照(NC)，2支加入2λ浓度的内毒素标准溶液作为阳性对照(PC)，结果见表4。

表4 样品干扰预试验结果
由表4可知，所用的3批左卡尼汀注射液稀释到5 mg／ml或以下浓度溶液时，对两个厂家的鲎试剂与细菌内毒素反应无增强或抑制的干扰作用。

4.4 干扰试验
用两个厂家的鲎试剂(灵敏度：0.50 EU／m1)，按《中国药典》2010年版二部附录的细菌内毒素检查法进行试验，测定用BET水制成的内毒素标准溶液的反应终点浓度的几何平均值(Es)和用供试品稀释液制成的内毒素溶液的反应终点浓度的几何平均值(Et)。

取3批左卡尼汀注射液，分别加BET水稀释成5mg／ml(批号：10100901、10101001、10101101)，用BET水和供试品稀释液将细菌内毒素工作标准品稀释成2.00λ、1.00λ、0.50λ、0.25λ浓度的BET水系列细菌
内毒素溶液和供试品稀释液系列细菌内毒素溶液，每一稀释浓度重复4管，同时用上述供试品稀释液和BET水各做2管阴性对照管，按公式计算BET水和供试品稀释液反应终点浓度的几何平均值(Es和Et)，Es =lg-1 (ΣXs/4)，Et=lg-1 (ΣXt/4)，结果见表5～表10。

鲎试剂：1005100；产品批号10100901
E s=lg-1(∑4/X)
=lg-1［(lg0.250+lg0.500+lg0.500+lg0.250)/4]
=0.354(EU/ml)
E t=lg-1(∑4/X)
=lg-1［(lg0.500+lg0.500+lg0.500+lg0.250)/4]
=0.420(EU/ml)
鲎试剂：1005100；产品批号10101001
E s=lg-1(∑4/X)
=lg-1［(lg0.250+lg0.250+lg0.500+lg0.250)/4] =0.297(EU/ml)
E t=lg-1(∑4/X)
=lg-1［(lg0.250+lg0.500+lg0.500+lg0.250)/4] =0.354(EU/ml)
E s=lg-1(∑4/X)
=lg-1［(lg0.250+lg0.500+lg0.250+lg0.250)/4]
=0.297(EU/ml)
E t=lg-1(∑4/X)
=lg-1［(lg0.500+lg0.500+lg0.500+lg0.250)/4]
=0.420(EU/ml)
E s=lg-1(∑4/X)
=lg-1［(lg0.500+lg0.500+lg0.250+lg0.250)/4]
=0.354(EU/ml)
E t=lg-1(∑4/X)
=lg-1［(lg0.500+lg0.500+lg0.500+lg0.250)/4]
=0.420(EU/ml)
鲎试剂：100802；产品批号10101001
E s=lg-1(∑4/X)
=lg-1［(lg0.250+lg0.500+lg0.250+lg0.250)/4] =0.297(EU/ml)
E t=lg-1(∑4/X)
=lg-1［(lg0.500+lg0.250+lg0.500+lg0.500)/4] =0.420(EU/ml)
E s=lg-1(∑4/X)
=lg-1［(lg0.250+lg0.250+lg0.250+lg0.500)/4]
=0.297(EU/ml)
E t=lg-1( 4/X)
=lg-1［(lg0.500+lg0.250+lg0.500+lg0.250)/4]
=0.354(EU/ml)
由表5～表10可知,1.00λ管均为阳性,0.125λ管均为阴性,阴性对照管均为阴性，对于λ=0.50 EU／ml的2组鲎试剂的Es均在0.25
EU/ml～1.00 EU/ml范围内，3批左卡尼汀注射液测得的Et也均在0.25 EU/ml～1.00 EU/ml范围内，说明左卡尼汀注射液在5mg/ml 或以下浓度的溶液对两个不同厂家的鲎试剂与内毒素的反应无增强或抑制的干扰作用，符合《中国药典》2010年版二部对细菌内毒素检查有效性的规定，因此可以确定左卡尼汀注射液的最大干扰浓度为5mg/ml，可在该浓度下对供试品进行细菌内毒素检查。

4.5 样品细菌内毒素检查
取3批左卡尼汀注射液，分别根据“4.4”项下方法制成供试品稀释液，使用λ=0.50EU/ml的鲎试剂进行细菌内毒素检查，并用此稀释液将细菌内毒素工作标准品稀释为2λ的溶液，作为供试品的阳性对照，另外以细菌内毒素检查用水建立阳性和阴性对照。

按《中国药典》2010年版二部细菌内毒素检查法检查，结果见表11.
表11 样品细菌内毒素检查结果
由表11可知，阴性对照管（NC）均为阴性，供试品阳性对照管（PPC）和阳性对照管（PC）均为阳性，实验有效；供试品管（NPC）均为阴性，表明3批左卡尼汀注射液的细菌内毒素检查均符合规定。

5 结论
用两个厂家的鲎试剂与3批样品进行细菌内毒素检查，样品中细菌内毒素限量均在0.1EU/mg限值以下。

因此，左卡尼汀注射液采用限值0.1EU/mg进行细菌内毒素检查法是可行的。

注：参考资料
(1)《中国药典》2010年版二部国家药典委员会编化学工业出版社
(2)《中国药品检验标准操作规范》2010年版中国药品生物制品检定所中国医药科技出版社。