【2018-2019】生存率实验步骤-word范文 (14页)

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生存率实验步骤
篇一：实验报告
复方山莨菪碱注射液对严重烫伤大鼠死亡率的影响
摘要：复方山莨菪碱由新斯的明注射液和山莨菪碱注射液按照1：500比例组成。

用该比例在本单位以往的研究中，对失血性休克、过敏性休克、增加小鼠对致
死剂量内毒素的耐受性均有较好的作用。

该复方制剂的药理学基础是，新斯的
明为可逆性胆碱酯酶（AChE）抑制剂，暂时性抑制胆碱酯酶活性，增加体内胆
碱酯酶（ACh）的量来激动M受体和N受体；山莨菪碱大剂量既有改善微循环的作用，又有阻断M受体的作用，M受体的阻断使N受体更充分地被激动，在被
激动的N受体及其亚型中，α7被激动后可以减少炎症因子的释放。

我们认为，多数重大创伤引起的休克都与炎症因子的大量释放有关，减少炎症因子的释放
既能发挥一定的抗休克作用，也能延长休克引起的死亡时间，即有扩大“治疗
时间窗”的作用。

本实验选用SD大鼠，背部烫伤，程度为III度，面积为30%
进行实验。

1 实验目的：与单药比较，观察复方山莨菪碱腹腔注射是否能够减少大面积严
重烫伤大鼠死亡率的作用。

2 实验材料
2.1 受试药物
复方山莨菪碱注射液组成：盐酸消旋山莨菪碱注射液10mg，甲基硫酸新斯的明
注射液20ug（比例500：1）加注射用水1ml。

盐酸消旋山莨菪碱注射液：上海第一生化药业有限公司生产；国药准字
H31022093；生产批号：201X/03/20；规格：1ml：10mg。

甲基硫酸新斯的明注射液：上海信谊金朱药业有限公司生产；国药准字：
H31022770；生产批号：090103；生产日期：090111。

规格：2ml：1mg。

内毒
素（LPS）：美国SIGMA公司生产。

2.1.1 实验分组与剂量设置
实验分为6组：受试药物复方山莨菪碱注射液以其中山莨菪碱的含量计算分高剂量组(20mgl/kg )、中剂量组(10mg/kg)和低剂量组（5mg/kg）。

两个阳性对照组：盐酸消旋山莨菪碱注射液对照组，剂量为20mg/kg；甲基硫酸新斯的明注射液：剂量为40μg/kg。

注射容积为2.5ml/kg；阴性对照组静脉注射等容积的注射用水。

2.1.2 给药途径及给药次数
给药途径：腹腔注射，单次给药，给药时间在烫伤后6小时。

2.2 实验模具
烫伤模具，用木板自制。

大鼠按照平均体重230g计算，
求出体表面积，然后在木板
上开出占大鼠体表面积约30%
的椭圆形孔。

如图1
2.3 实验动物
品系： Sprague Dawley 大鼠
来源：第二军医大学实验动物中心。

级别：清洁级。

体重：20
0-220g
性别：雄性。

动物生产许可证号：SCXK（沪）201X-0016
实验动物质量合格证：201X001609077
动物购回后在本单位普通动物房分笼并适应性饲养7天，用普通标准大鼠饲料喂养，自由饮水，温度控制18-20℃，光线明暗12小时自动转换。

实验前一天禁食12小时，不禁水。

3. 实验方法
大鼠称重，编号，然后用
氯胺酮100mg/kg+地西泮
10mg/kg腹腔注射麻醉，
大鼠麻醉后背部向下
放入自制的模具中（图2）在
开水中烫10sec（图3）。

烫伤6小时后腹腔
图2 大鼠背部烫伤部位图1 自制烫伤模具
注射内毒素（LPS）2mg/kg造模，造模成功后分别给予生理盐水、复方山莨菪碱、山莨菪碱、新斯的明观察48小时存活率和存活时间。

图3 烫伤过程图4 烫伤后
4. 观察指标
2.4.1 48小时生存率。

2.4.2 生存时间。

2.5. 统计分析
_2.5.1 生存率实验结果以均数±标准差(x±s)表示，与生理盐水组进行组间二样
本X2检验，以P<0.05为具有统计学显著性差异标准。

2.5.2 生存时间用SPSS软件进行生存时间分析，采用K-M方法进行统计学处理，以P<0.05为具有统计学显著性差异标准。

6. 实验结果
生存率：生理盐水对照组烫伤29只，24小时后仅有1只存活,生存率仅有
3.33%；复方山莨菪碱注射液高剂量组存活7只，生存率为35%，经x2检验两组相差非常显著；复方中剂量、低剂量和阳性对照山莨菪碱组均存活4只，生存率为15%虽然存活率明显高于生理盐水组，但统计学处理未达到显著意义。

表1
生存时间：生理盐水组烫伤后平均生存时间为12.2小时，而复方山莨菪碱注射液低剂量组存活时间为13.9小时，中高剂量组均为16.3小时。

中高剂量组存活时间与生理盐水存活率比较相差显著（P<0.01-0.001）。

表2
表1 复方山莨菪碱注射液对严重烫伤存活率的影响
组别
生理盐水组
山莨菪碱组
新斯的明组 n 存活数（只）存活率（%） 29 1/29 20 4/20 20 3/20 3.33 20.0 15.0
15.0
15.0
35.0** 0.0543 0.136 0.0543 0.0543 0.00277 P值复方低剂量组 20 4/20 复方中剂量组 20 4/20 复方高剂量组 20 7/20
**P<0.01 与生理盐水组比较
复方山莨菪碱注射液对严重烫伤存活时间的影响
组别
生理盐水组
山莨菪碱组
新斯的明组 n 平均存活时间（h）29 12.2±3.08 20 14.7±5.71 20
12.6±5.28
复方低剂量组20 13.9±5.75
复方中剂量组20 16.3.±4.12***
复方高剂量组20 16.3±6.15**
**P<0.01，***P<0.001与生理盐水组比较
图5 严重烫伤各组24小时存活时间曲线
7. 实验结论：复方山莨菪碱注射液能显著降低严重烫伤的的死亡率，延长伤后生存时间。

篇二：实验方案
实验方案
[1]金沈锐,祝彼得,秦旭华,瞿燕.不同制备方法对西黄丸体外抑瘤作用影响的比较研究[J].时珍国医国药,201X,18（7）:1735-1737.
研究不同制备方法对西黄丸体外抑瘤作用的影响。

方法采用3种制备方法, 即西黄丸浸提液、煎液、含药血清, MTT法分别测定其对两种人恶性肿瘤细胞株(人原发性肝癌细胞株SMMC7721、人早幼粒细胞白血病细胞株H L-60)增殖的影响，发现不同的制备方法对西黄丸体外抑瘤作用有明显的影响, 西黄丸浸提液和煎液均具有明显的抑瘤作用, 且浸提液的抑瘤作用优于煎液, 古人将西黄丸定位于丸剂, 确有其合理性和科学性。

[2]戴一.西黄丸的药理作用及临床应用概况[J]. 药物评价研究,201X,35
（6）:473-476.
西黄丸原名犀黄丸，出自《外科证治全生集?卷四》，是清代名医王洪绪的祖传秘方。

犀黄丸由牛黄、麝香、乳香、没药4 味中药粉碎研配以水泛丸而成，清热解毒、和营消肿，用于痈疽疔毒、瘰疬、流注、癌肿等。

[3]金沈锐,秦旭华,肖桦,陈洁,秦健. 西黄丸对荷瘤小鼠生存质量的影响[J]. 中药药理与临床,201X,27（1）:7-8.
采用体内研究方法,考查其对荷瘤小鼠生存质量的影响, 包括观察荷瘤动物一般情况, 计算荷瘤小鼠生存率和生命延长率。

1.1试验药物??黄丸,九寨沟天然药物集团有限公司生产,批号: 080401,实验时用蒸馏水配制为混悬液予动物灌胃;注射用环磷酰胺( 0.2g /瓶), 山西普德药业有限公司,批号201X0807, 临用前用蒸馏水新鲜配制。

1.2动物昆明种小鼠, SPF级,体重18~ 22g小鼠,雌雄兼用,由成都中医药大学实验动物中心提供, 动物合格证号SCXK( 川201X-11)。

1. 3 细胞株小鼠肝癌细胞株H22、小鼠艾氏腹水瘤细胞株EAC,均由成都中医药大学病理教研室提供。

1.4 方法??液氮冻存小鼠肝癌H 22瘤株进行复苏, 经体外培养增殖, 生长稳定后以5×106 细胞量接种于昆明小鼠腹腔内, 待其长出癌性腹水后传代培养至3代, 取小鼠无血性的癌性腹水, 供接种使用。

实验时将第3代的肿瘤小鼠癌性腹水用无菌生理盐水调整细胞数至5×106, 接种于昆明种小鼠腹腔注射接种( 每只注射0.2m l)。

取体重为18~ 22g的小鼠(每次实验使用同一性别的小鼠), 常规消毒后每只小鼠腹腔注射H 22瘤液或EAC 荷瘤小鼠接种, 接种后次日, 将动物
称重并分层随机分为4组, 分别为模型对照组、西黄丸高、低剂量组及环磷酰胺组。

西黄丸各组给予西黄丸混悬液灌胃, 低剂量组给药剂量为1.08g
/kg(西黄丸每日人用量6g, 以50kg 为正常人体重计算, 给药量相当于人用量
9倍) , 高剂量组给药剂量为2.16g /kg (相当于人用量18倍), 环磷酰胺组予0. 02g /kg 环磷酰胺灌胃给药,模型对照组予等体积生理盐水灌胃。

每日灌胃
给药1次, 连续 10天后停药。

观察动物的一般情况, 包括毛色、活动度、进
食量、体重等, 并记录动物在接种肿瘤后的死亡时间。

以对照组20%动物存活
时间不得超过4周为依据, 故设第29天终止实验, 并计算小鼠生命延长率。

抑瘤作用是西黄丸的主要药理作用，实验显示1.08、2.16 g/kg 剂量下西黄丸
对H22荷瘤小鼠及EAC荷瘤小鼠的生存状态明显好于环磷酰胺组（0.02g/kg），同时，西黄丸在2.16 g/kg 剂量下，可明显延长荷瘤小鼠的生存时间，生命延
长率可达30%以上。

[4]徐浩,崔立然,刘吉成. 西黄丸对H_(22)荷瘤小鼠Bcl-2基因mRNA表达的影
响
[J]. 现代预防医学,201X,11:2120-2121.
本实验采用RT-PCR 法测定H22荷瘤小鼠瘤组织中bcl-2基因mRNA在给药前后
的表达差异，为传统中成药西黄丸临床上治疗肿瘤提供更科学的理论依据。

进一步研究发现西黄丸可下调H22 荷瘤小鼠瘤组织中凋亡相关基因bcl-2 基因mRNA 的表达。

1.2 动物
选用清洁级昆明种（KM）小鼠，体重（20 ± 2） g， 6～8周龄，雌雄各半，黑龙江中医药大学药物安全评价中心（GLP）提供合格证号： 01-10-2。

1.3 瘤株
H22瘤株由齐齐哈尔医学院药物研究所提供。

1.4 主要仪器及试剂
离心机（Microfuge 18 Centrifuge， BECKMAN COULTER，德国）；超净工作
台（苏州净化设备厂）；可见／紫外分光光度计（765PC 型上海光谱仪器有
限公司）；电泳凝胶图象分析系统（ Backman 公司）；梯度PCR 仪
（ EPPERFOR201X 型德国）； RT-PCR 试剂盒（美国Promega 公司）；PCR Marker 美国Promega 公司）；bcl-2、β-actin 的引物（英骏生物技术有限
公司合成）。

1.5 实验方法
1.5.1 分组及给药超级洁净工作台上无菌取接种于d 8 转移癌H22腹水（活细
胞计数大于95%），用0.9％氯化钠注射液稀释成2×106 ／ ml，取清洁级
KM 小鼠雌雄各半，共40 只，每只鼠右侧腋部皮下接种0.2 ml瘤细胞悬液。

于接种24 h 后随机分4 组，模型组（0.9%氯化钠注射液（LHN） ig 0.2 ml ／ 10 g ／d， ip LHN）； XHW 组（XHW ig 0.2 ml ／ 10 g ／ d， ip LHN）；CTX 组（LHN ig 0.2 ml ／ 10 g ／ d， ip CTX 30 mg ／ kg ／d）；联合用药组（XHW＋CTX 组）（XHW ig 0.2 ml ／ 10 g ／ d， ip CTX 30mg ／ kg ／ d），连续给药10 d，末次给药后禁食12 h，颈椎脱臼处死，以75%乙醇浸泡消毒后剥离瘤组织，置于液氮中保存备用。

1.5.2 RT-PCR 检测荷瘤小鼠bcl-2mRNA 的表达按总RNA提取试剂盒操作步骤，从100 mg 瘤组织中提取总RNA。

取1μl RNA 样品，加入DEPC 处理水稀释至50 μl，混匀后加入比色杯中。

在260 nm 和280 nm 分别3 次读取吸光度值，RNA 纯度以OD260 ／OD280的比值表示。

逆转录反应以总RNA 1 μg 为模板，
分别加入10 mmol ／ L dNTP 2.0 μl、5 mmol ／ L MgSO4 1.5μl、25
×buffer 4.0 μl、AMV （逆转录酶） 1 μl，加DEPCH2O至终体积为20
μl 并混匀。

优化后的逆转录条件为42℃ 1 h，合成第一条cDNA 链。

分别取
逆转录所得1、2、3、4 号cDNA模板各2.0 μl，与bcl-2 及β-actin 的上下游引物（表1）各0.5 μmol ／ L 配制成25 μl 的PCR 反应体系，加入到96 孔板中，1、2、3、4 四个样本各设置6 个复孔，加入循环参数为
94℃5 min，然后94℃ 30 s，58℃ 40 s，72℃ 50 s，共40 个循环，最后72℃延伸10 min。

PCR 产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳并与DNA 标准分子量比较
鉴定之后，在数字成像仪上照相、扫描分析。

[5]马杰,王一尧,杨伟,关硕,曾常茜,高文斌,梁文波. 西黄丸抗肿瘤作用及其免疫清除功能的实验研究[J]. 中国中药杂志,201X,39(8):163-165.
目的: 探讨西黄丸对荷瘤大鼠的抗肿瘤作用及其对荷瘤机体免疫清除功能的影响。

方法: 采用Walker256 建立大鼠荷瘤模型，随机分为空白对照组、模型对照组、香菇多糖组、西黄丸低、中、高剂量组，每组10 只。

造模后连续治疗给药14d。

腹主动脉取血，取瘤，计算抑瘤率; 采用流式细胞技术( FCM) 检测外周血中
CD3
+ ，CD4 + ，CD8 + T 细胞及黏附分子B7-1( CD80) 的含量; ELISA 测定外周
血IL-2， IFN-γ表达水平。

结果: 西黄丸高剂量组抑瘤率为33. 1%; 与对照组比较，模型组大鼠外周血中
IL-2， IFN-γ水平及CD3 + ，CD4 + ，B7-1 含量明显降低，差异有统计学
意义( P ＜ 0. 05) ; 与模型组比较，西黄丸高剂量组大鼠外周血中IL-2，
IFN-γ水平及CD3 + ，CD4 + ，B7-1 含量增高( P ＜ 0. 05) 。

结论: 西黄丸可通过提高外周血IL-2， IFN-γ水平及CD3 + ，CD4 + ，B7-1 含量，增强免疫清除功能，发挥其抗肿瘤作用。

[6]王志宏,王中霞,刘超,欧阳兵,李峰,王文苹,吴超,季旭明. 西黄丸滴丸抗肿
瘤作用及对免疫功能的影响[J]. 山东大学学报(医学版),201X,04:18-20. 摘要:
目的研究西黄丸滴丸抗肿瘤作用及对免疫功能的影响。

方法将H22荷瘤小鼠模
型分为模型组、西黄丸组、西黄丸滴丸不同剂量组，干预10 d 后，测定各组
小鼠的脾指数和胸腺指数，ELISA 法测定小鼠血清中TNF-α、IL-1、IL-6、
INF-γ含量。

结果西黄丸滴丸低、中、高剂量均对H22荷瘤小鼠具有明显的抑瘤作用，其抑瘤率分别为62．45%、70．61%、76．93%; 各剂量西黄丸滴丸均
能提高免疫器官的质量及血清中TNF-α、IL-1、IL-6、INF-γ含量。

结论西
黄丸滴丸具有明显的抑制肿瘤生长和增强机体免疫功能作用。

1 材料与方法
1． 1 材料
1． 1． 1 实验动物与瘤株昆明种小白鼠，体质量18 ～22 g，雌雄各半，山
东中医药大学实验动物中心提供，SPF 级实验室喂养; 腹水型小鼠肝癌H22细
胞株购自山东省医学科学院药物研究所。

1． 1． 2 实验药物与试剂西黄丸，北京同仁堂科技发展股份有限公司制药厂，批号: Z110201X3; 西黄丸滴丸( 自制) ; 环磷酰胺( CTX) ，江苏恒瑞医药股
份有限公司，批号: 100231-201X03。

TNF-α、IL-1、IL-6、INF-γELISA 试剂盒购自上海研辉生物科技有限公司。

环磷酰胺是广泛应用的抗癌药物之一，治疗恶性淋巴瘤、多发性骨髓瘤、乳腺癌、小细胞肺癌、卵巢癌、神经母细胞瘤、视网膜母细胞瘤、尤文瘤、软组织肉瘤.
1． 2 方法
1． 2． 1 西黄丸滴丸的制备工艺条件为PEG8000∶PEG10000 = 1∶1 作为基质，药物与基质比为1∶1． 5，二甲基硅油100 作为冷却剂，冷却剂温度采用梯度冷却方式( 上部温度30 ℃，下部温度0 ～ 5 ℃) ，药液温度75 ℃，滴
速20 ～ 25 滴/min，滴距为4 cm。

称取一定量的基质，75 ℃熔融后加入采
用超临界CO2提取技术提取的乳香、没药中有效成分挥发油及超微粉碎技术制
得的牛黄麝香粉末，混匀后滴制。

1． 2． 2 移植瘤模型的建立无菌环境下，抽取H22腹水瘤小鼠的腹水，生理
盐水稀释，调整细胞浓度为( 2 ～3) × 107 /mL，测定细胞活力，活细胞率
≥95%。

每只小鼠右腋下接种0． 2 mL。

1． 2． 3 西黄丸及滴丸对H22荷瘤小鼠的抑瘤作用接种24 h 后，将小鼠随
机分为6 组: 模型组，西黄丸组( 2．2 g /kg) ，滴丸低、中、高剂量组
( 1．5、3． 0、6．0 g /kg) ，CTX 组( 20 mg /kg) ，每组10 只。

西黄丸
及滴丸各剂量组灌胃给药，模型组给予等容量生理盐水，每日1 次; CTX 组腹
腔注射，每 2 天 1 次。

给药10 d。

停药次日脱颈椎处死荷瘤小鼠，剥离瘤块，称瘤质量，计算抑瘤率。

抑瘤率( %) = ( 对照组平均瘤质量－治疗组平均瘤
质量) /对照组平均瘤
质量× 100%。

1． 2． 4 西黄丸及滴丸对小鼠免疫功能的影响按照上述方法制备荷瘤小鼠，
分5 组给药干预: 模型组，西黄丸组( 2． 2 g /kg ) ，滴丸低、中、高剂量
组( 1． 5、
3． 0、6． 0 g /kg) 。

西黄丸及滴丸各剂量组灌胃给药，模型组给予等容量
生理盐水，每日1 次，连续10 d，末次给药24 h 后摘眼球取血，静置4 h，3 000 r /min离心15 min，取血清置于－20 ℃保存。

采用ELISA法按照试剂盒操作说明书测定血清TNF-α、IL-1、IL-6、INF-γ含量。

分离脾脏和胸腺，电子天平精确称量脾脏和胸腺的质量，计算每克体质量的脾指数和胸腺指数。

[7]唐曦,胡娅,胡国清. 西黄丸与氟尿嘧啶联合应用的抗肿瘤作用[J]. 医药导报,201X,24(9):757-759.
[ 摘要]目的研究西黄丸与氟尿嘧啶( 5Fu)联合应用对小鼠移植性肿瘤S180肉瘤生长的抑制作用。

方法小鼠S180细胞接种于昆明种小鼠右前肢腋窝皮下,
建立S180实体瘤模型小鼠60只, 随机分为4组: 阴性对照组( 灌胃并腹腔注
射0.9%氯化钠注射液)、西黄丸组( 2.0g /kg1, ig )、5Fu组( 0. 02 g/ kg 1, ip) 、联合用药组( 西黄丸, 2.0 g/ kg 1,ig; 5Fu, 0. 02 g/kg1, ip)。

小鼠接种后开始给药, 每天1次, 连续7 d。

观察各组小鼠移植瘤生长情况及体重
变化。

停药后第2天处死小鼠, 称瘤重, 计算瘤重抑制百分率。

结果西黄丸组
抑瘤率28.1%, 5Fu组抑瘤率35.3%, 联合用药组抑瘤率55. 4%,与阴性对照组
比较,差异均有显著性(P < 0. 05); 联合用药组抑瘤率高于单用西黄丸或5Fu
组(均P <0. 05)。

结论西黄丸和5Fu联合应用对小鼠移植性肿瘤S180有明显
抑制作用, 两者有协同作用。

1 材料与方法
1. 1 材料动物: 昆明种小白鼠, 雌性, 体重18 ~ 22g, 由华中科技大学同济
医学院实验动物中心提供。

试剂: 西黄丸(北京同仁堂科技发展股份有限公司制药厂, 批号: 3030472), 5Fu(天津金耀氨基酸有限公司,批号: 0403312)。

移植性肿瘤: 肉瘤S180, 华中科技大学同济医学院药学院肿瘤研究室提供, 昆明种
小鼠腹腔传代。

1. 2 方法
1. 2. 1 小鼠荷S180肉瘤模型的建立??择接种后10d、一般状况较好的瘤种动物, 仰卧固定, 消毒皮肤, 抽取腹腔积液, 以0. 9% 氯化钠注射液稀释, 计数, 调整细胞浓度至2. 0 107 mL 1, 于小鼠右前肢腋窝皮下接种S180细胞悬液0.
2 mL。

1. 2. 2 实验动物分组与给药方法昆明种雌性小鼠60只, 称重后随机分为4组, 每组15只。

从接种次日开始给药, 3个药物组分别按以下3种方式给药,
西黄丸组: 按2.0 g/kg 1剂量灌胃给药; 5Fu 组: 按0. 02 g/kg 1剂量腹腔
注射给药; 联合用药组: 灌服西黄丸2. 0 g/kg 1, 同时腹腔注射5Fu 0.02
g/kg
1。

阴性对照组每天灌服并腹腔注射等体积的无菌0. 9%氯化钠注射液。

每天给药1次, 连续7 d, 每天记录体重, 停药后第2天将各组动物称重并断髓处死, 钝性剥离瘤组织, 电子天平称重。

1. 2. 3 检测指标动物体重、瘤重, 计算肿瘤抑制率。

瘤重抑制率(% ) = (阴性对照组平均瘤重- 药物组平均瘤重) / 阴性对照组平均瘤重100%
1. 2. 4??效评价阴性对照组小鼠肿瘤平均重量<1 g或> 20% 小鼠瘤重< 400 mg 表示肿瘤生长不良。

在治疗期间给药组小鼠死亡> 20%, 或平均体重(去瘤后)下降> 15%, 表明该药物有毒性反应。

如所试药品肿瘤抑制率> 30% , 并经
篇三：实验设计
目前研究认为,活化的巨噬细胞是可以执行不同功能的复杂群体。

其中,替代性活化的巨噬细胞(aaMphi)参与了细胞生长、血管生成、免疫抑制、组织修复和间质形成等过程。

肺腺癌间质中有大量肿瘤相关巨噬细胞(TAM)浸润,且与其进展和转移密切相关,而经淋巴道转移是肺腺癌播散的主要途径之一。

但是,肺腺癌间质中TAM是否存在替代性活化表型、该活化表型在淋巴管生成中有否作用
及其机制尚不明确。

本课题拟首先寻找人肺腺癌间质TAM呈替代性活化的证据;进而通过建立小鼠Lewis肺癌(LLC)移植瘤模型等实验明确aaMphi在小鼠肺腺癌淋巴管生成中的作用;最后,探讨aaMphi促进小鼠肺腺癌淋巴管生成的作用机制。

本课题旨在为阐明肺腺癌的转移机制提供新的证据,为拮抗肺腺癌淋巴管生成提供新靶点。

目的鉴定肺腺癌TAM的活化表型,探讨aaMphi促进小鼠肺腺癌淋巴管生成的机制。

方法1、免疫组织化学 SP法检测人肺腺癌组织中CD68、血管内皮生长因子(VEGF)-C和血管内皮生长因子受体(VEGFR)-3表达,并计数CD68阳性TAM、VEGF-C阳性指数和VEGFR-3阳性微淋巴管密度(LMVD),分析其
相关性及与临床病理特征之间的关系。

2、以CD68阳性作为TAM之标记,以
CD68和巨噬细胞甘露糖受体(MMR)双阳性作为aaMphi之标记,以CD68和诱导型一氧化氮合酶(iNOS)双阳性作为经典活化的巨噬细胞(caMphi)之标记,采用双标免疫荧光染色和激光共聚焦显微镜鉴定人肺腺癌TAM的活化表型。

3、以IFN-
γ+LPS或IL-4处理小鼠RAW264.7巨噬细胞,分别建立caMphi或aaMphi模型;观察CpG+IL-10RA能否逆转aaMphi表型。

将aaMphi与LLC细胞混合注射至小鼠颈部背侧皮下,建立移植瘤模型;免疫组织化学SP法检测并计数移植瘤LYVE-1阳性LMVD,HE染色检测淋巴结和远处器官转移情况;另取小鼠随机分组计算生存率。

4、应用不完全弗氏佐剂(IFA)诱导小鼠腹腔淋巴管瘤形成,消化法分离获得LEC,置于自制鼠尾胶包被的培养瓶(板)中培养。

免疫荧光化学法检测LEC表达VEGFR-3和LYVE-1,3H-TdR掺入法检测LEC增殖活力,淋巴管形成实验判定LEC能否形成淋巴管样结构。

5、采用transwell系统共培养aaMphi和小鼠LEC,绘制LEC生长曲线,细胞迁移实验观察LEC迁移,基质胶实验观察LEC管样结构形成;实时定量RT-PCR分别检测共培养前后aaMphi表达VEGF-C和VEGF-D mRNA,以及LEC表达VEGFR-3和Prox1 mRNA。

之后,选择浓度为100ng/ml的VEGF-C建立aaMphi转分化系统;分别于第0、7、14和28天以实时定量RT-PCR 法检测aaMphi表达VEGFR-3、Prox1和Fizz1;连续28天观察管样结构形成情况。

最后,采用transwell系统共培养aaMphi和小鼠LLC细胞,免疫细胞化学检测LLC细胞表达VEGF-C,3H-TdR掺入法和transwell侵袭模型分别观察aaMphi
对LLC细胞增殖和侵袭的影响。

结果1、人肺腺癌TAM计数(103.36±15.31)、VEGF-C阳性指数(20.60±11.96)均明显高于肺良性病变
(32.15±5.48,3.82±3.21)(P<0.01);人肺腺癌VEGFR-3阳性率(54.7%)和肺良
性病变VEGFR-3阳性率(50.0%)之间无统计学差异(P>0.05),但前者VEGFR-3阳
性LMVD(11.56±10.73)明显高于后者(4.29±4.18)(P<0.01)。

人肺腺癌TAM计数、VEGF-C阳性指数均与淋巴结转移、P-TNM分期密切相关,VEGFR-3阳性LMVD 只与淋巴结转移密切相关。

人肺腺癌TAM计数和VEGF-C阳性指数、VEGFR-3阳
性LMVD之间均呈正相关(r=0.338,P<0.05;r=0.410,P<0.01);VEGF-C阳性指数
和VEGFR-3阳性LMVD之间也呈正相关(r=0.653,P<0.01)。

2、40例人肺腺癌组
织中TAM均同时表达CD68和MMR,MMR阳性巨噬细胞占全部TAM的74.7~98.2%;
其中,有3例肺腺癌TAM同时表达CD68和iNOS,但iNOS阳性巨噬细胞占全部TAM的比例仅为2.4~12.7%。

在10例肺良性病变中,8例同时表
达CD68和iNOS,2例仅表达CD68;未见有同时表达CD68和MMR的病例。

3、成
功地建立了小鼠caMphi和aaMphi模型,且CpG+IL-10RA能逆转aaMphi为caMphi。

与空白对照组比较,aaMphi组和RAW264.7组移植瘤LMVD增高
(14.80±3.64,10.50±3.17),淋巴结转移数较多
(10.80±1.32,7.30±0.95)(P<0.01),双肺转移结节数增多
(32.50±4.91,29.30±4.42)(P<0.01),荷瘤小鼠生存率降低(P<0.01);其
中,aaMphi组LMVD和淋巴结转移数明显高于RAW264.7组(P<0.05),但双肺转移
结节数和荷瘤小鼠生存率之间无统计学差异(P>0.05)。

caMphi组和
aaMphi+CpG+IL-10RA组移植瘤未见LYVE-1表达和淋巴结转移,双肺转移结节数
较少(5.80±1.15,5.17±1.28) (P<0.01),荷瘤小鼠生存率提高(P<0.01)。

4、IFA能诱导小鼠腹腔淋巴管瘤形成,所获LEC活细胞数大于98%,并高表达
VEGFR-3和LYVE-1。

在自制鼠尾胶包被的培养瓶(板)中,LEC生长状况良好,3H-TdR掺入率明显增加;在鼠尾胶凝胶中,LEC能形成淋巴管样结构。

5、与aaMphi
共培养后,小鼠LEC增殖、迁移和管样结构形成能力均明显高于空白对照组、caMphi组和RAW264.7细胞组。

与共培养前比较,aaMphi表达VEGF-C明显增加(P<0.01),但表达VEGF-D无明显变化(P>0.05);LEC表达VEGFR-3和Prox1均明
显增加(P<0.05~0.01)。

建立转分化系统之后,小鼠aaMphi表达VEGFR-3和
Prox1逐渐增加,而表达Fizz1逐渐下降,至第14天分别达到最高值和最低值;
第28天和第14天的情况无明显差别。

随着时间推移,aaMphi在基质胶中逐渐
形成明显的管样结构。

在4个共培养组中,aaMphi组小鼠LLC细胞表达VEGF-C
最强,增殖速度最快,侵袭能力最强,RAW264.7组次之;而与空白对照组相
比,caMphi组LLC细胞表达VEGF-C无明显变化,增殖和侵袭则受到抑制。

结论1、TAM与人肺腺癌组织VEGF-C表达和淋巴管生成呈正相关,可能促进了肺腺癌淋
巴结转移。

2、人肺腺癌组织中TAM呈现出替代性活化的表型特征。

3、aaMphi
能促进小鼠LLC移植瘤淋巴管生成、淋巴结和肺转移,并降低荷瘤小鼠生存率。

在形成移植瘤的过程中,未经处理的巨噬细胞可以朝着aaMphi的方向极化。

CpG+IL-10RA能通过逆转aaMphi表型并最终拮抗小鼠肺腺癌淋巴管生成。

4、以自制鼠尾胶为贴黏剂的体系是一种简便、廉价和稳定的小鼠LEC体外培养体系。

5、aaMphi能够通过促进LEC增殖、迁移和管样结构形成,直接转分化为LEC和上调LLC细胞表达VEGF-C等三种方式促进小鼠肺腺癌淋巴管生成。

更
多
篇四：6分钟步行实验
六分钟步行试验
六分钟步行试验是一种对中、重度心肺疾病患者功能状态的运动试验。

名称：六分钟步行试验
别名：6MWT
适应证
六分钟步行试验（6MWT）主要用于评价中、重度心肺疾病患者对治疗干预的疗效，测量患者的功能状态，可作为临床试验的终点观察指标之一，也是患者生存率的预测指标之一。

禁忌证
1.绝对禁忌证近1个月内出现的不稳定性心绞痛或心肌梗死；
2.相对禁忌证静息心率>120/min，收缩压>180mmHg和舒张压>100mmHg。

实验准备
1.向患者及家属说明检查的必要性及注意事项。

2.试验前应复习患者近6个月的静息心电图。

3.有症状的患者应准备好相关抢救药物以便随时应用。

4.试验场地准备
（1）室内封闭走廊（气候适宜可在户外），应少有人走动。

（2）地面平直坚硬，路长应达50m，若无条件可用20或30m，过短会降低步行距离。

（3）折返处置锥形标记，起始的地板上有鲜艳的彩带，标记每圈的起始。

5.设备准备
（1）计时器和圈数计数器；
（2）氧气源（如需要）；
（3）血压计；
（4）除颤器；。