发酵工程实验讲解

发酵工程实验
目录
实验一发酵罐的结构系统及使用方法
实验二微生物的诱变育种
实验三乳酸菌的分离及乳酸饮料制作
实验四大肠杆菌生长曲线的测定
实验五摇床培养枯草芽孢杆菌发酵条件的优化
实验一发酵罐的结构系统及使用方法
一、实验目的：
1．了解发酵罐（气升式、搅拌式）的几大系统组成，即空气系统、
蒸汽系统、补料系统、进出料系统、温度系统、在线控制系统。

2．掌握发酵罐空消的具体方法及步骤
3．掌握发酵罐进料及实消的具体方法及步骤
4．掌握发酵罐各系统的控制操作方法
二、实验原理：
1．蒸汽系统：
三路进汽——空气管路、补料管路、罐体
2．温度系统：
(1) 夹套升温：蒸汽通入夹套。

(2) 夹套降温：冷水通入夹套，下进水，上出水。

3．空气系统：
取气口→空压机：往复式油泵获得高脉冲的压缩空气
粗过滤器：由沙布包裹棉花压实成块状叠加制得，作用是去除部分细菌及大部分灰尘（贮气罐）：空压机压缩使气体温度升高，经贮气使气体保温杀菌；压缩空气中有油污、水滴，且压力不稳，有一定的脉冲作用，会冲翻后面的过滤介质，贮气后可使油滴重力沉降，减小脉冲。

（冷却塔）：有降温并稳定作用，同时经旋风分离器进行气液分离
(丝网分离器)：通过附着作用，逐步累积沉降而分离5微米以上的微粒
其作用介质为铜丝网
(加温器)：对压缩空气升温，除湿，使湿度达50%-60%
总过滤器：纱布包裹棉花加活性炭颗粒，逐层压紧而成。

分过滤器：平板式纤维，中间为玻璃纤维或丝棉，下面放水阀应适时打开放出油、水，再用压缩空气控干。

种子罐或发酵罐
4．补料系统：补培养基、消泡剂、酸碱等。

5．在线控制系统：热电偶（温度探关）、溶氧探头、pH探头（后二者实消时才安装，为不可再生探头，有限定使用次数，pH探头使用前要先校准）、控制柜、数据采集系统。

6、进出料系统：进料口(接种口)、出料口(取样口)。

7．蒸汽过滤器：在蒸汽进入空气系统时应用，以免蒸汽中携带的杂质颗粒堵塞分过滤器微孔。

三、方法与步骤：
(一)原则：
1．通蒸汽前先关闭所有阀门。

2．粗过滤器不空消也不实消，要定期处理，所以必须关闭通向粗过滤器的阀门。

3．活蒸汽，灭过头，即尾汽不能关死，要保证有活蒸汽放出，但不能太大，以免分压。

4．罐体排汽口排汽，并保持罐内正压。

5．空气过滤系统只空消，不实消，以免罐中物料冲入过滤器内。

但空消一结束，即要通入无菌空气吹干管路并保压，避免染菌。

6．进蒸汽时顺着蒸汽管路开阀门，结束时逆着进路关阀门，先开尾阀后开主阀，结束时先关主阀后关尾阀。

8．蒸汽一停，即由无菌空气充入保持罐内正压。

（二）空消：
先开启蒸汽发生器，自有蒸汽产生并排掉管路中冷凝水后，按以下步骤进行：
1．先关闭所有阀门，检查处是否关紧密封，打开罐上方排气口。

2．蒸汽先进空气系统，蒸汽→蒸汽过滤器→分过滤器，无论蒸汽走到哪一路得先放尾阀，放出冷凝水，排掉冷空气，待有蒸汽冲出后调小，打开主阀。

3．再进罐体：由主路进罐，然后通入取料管路，再入补料系统（两边）。

4．罐压升至0.12Mpa(此时控制系统中温度读数约为120℃左右)时开始计时，保温保压，30分钟。

保压方式：（1）调节主汽路进汽阀门控制进汽量；（2）调节排气口排气量大小或尾阀放汽量。

5．结束空消：（1）逆着蒸汽进路关，先关近罐阀。

（2）同时准备好压缩空气确保蒸汽一停即充入无菌压缩空气以维持空气系统及罐内的正压。

近罐空气阀的尾阀要一直微开启。

注意：空消前应检查夹套中是否残留了冷水，若有，影响罐体升温，须自夹套出水口将水放出。

（三）进料及升温
1、调大排气口排气量，至罐压掉零，开启进料口，加料。

装上溶氧探头及pH探头。

2．夹套升温：
蒸汽由夹套蒸汽管路进入夹套进行升温（有表压可读出进入夹套的气压），温度可由控制面板上读出，升至90℃，关闭夹套蒸汽。

*升温目的：冷的物料和罐体中直接冲入蒸汽，极易产生大量冷凝水而使培养基中水分过大；另外，对淀粉质的物料，则直接通入蒸汽很容易使物料结球不溶，表面糊化结团，影响灭菌效果；升温还可以利于淀粉质原料液化。

*说明：(1)培养基配制时，考虑实消时会产生水分，因此，若考虑用7升的装液量(10升罐)，则加液量应为6升左右，其余物料按7升需量称量。

装料系数一般为70%。

（2）通蒸汽对夹套升温时，必须排空夹套内水(可用蒸汽冲出)，但可微开启出水口阀门适当减压，避免夹套内压力过大。

(四) 实消：
1．关闭气路入罐阀，主汽路进汽→补料口进汽（方法同空消）→罐压升至0.12Mpa （121℃），保压、保温30分钟→实消结束。

（五）冷却接种：
蒸汽关闭的同时，即通入压缩空气（罐压表头掉至0.05MPa时接入无菌空气）→夹套通入自来水冷却（下进水，上出水阀门，送水排水）→冷却至约32℃→接种（放大排气口出气量，至表头掉零，开启接种口，火圈接种）→接种后拧紧接种口，将排气阀调小，接上玻璃转子流量计，使流量计读数在8.0左右，同时保持罐压0.06Mpa→在控制系统中设定好发酵温度→保温保压发酵24hr
（六）数据采集、取样、放罐
数据采集：系统自动采集，每2分钟采集一组数据并存贮，包括：温度、溶氧、pH、等，系统可自动给出有关曲线。

同时由值班者每20分钟记录一次，准确填表，获取数据制作过程曲线。

中间取样：每取样前，将取样口蒸汽灭菌半小时→弃去始放出的样液约10毫升，再用无菌空容器取样约100毫升→无菌封存→取样口再灭菌30分钟→样液冷藏待测。

(具体步骤见电脑桌面文件)
放罐：调节无菌空气量放罐，方法同取样。

(七) 罐体清洗
放罐后，加大排气，使表压掉零，取出各探头，加盖，由进料口加入净水关好，罐内升压，放罐，如此重复两次。

*
实验二紫外线诱变育种
一．目的要求
通过实验，观察紫外线对枯草芽孢杆菌的诱变效应，学习微生物诱变育种的基本方法。

二．基本原理
由于微生物自发突变率一般很低，为了提高突变频率，可采用物理或化学的因素进行诱发突变，紫外线是目前使用最方便且十分有效的物理诱变剂之一。

紫外线对微生物有诱变作用，主要引起是DNA的分子结构发生改变（同链DNA的相邻嘧啶间形成共价结合的胸腺嘧啶二聚体），从而引起菌体遗传性变异。

三．菌种与仪器
菌种：枯草芽孢杆菌；
培养基：
仪器：血球计数板，显微镜，紫外线灯（15W），电磁搅拌器，离心机、培养皿、三角瓶、涂布棒等
四．操作步骤
（1）菌悬液的制备
（a）取培养48小时的枯草芽孢杆菌的斜面4—5支，用无菌生理盐水将菌苔洗下，并倒入盛有玻璃珠的小三角烧瓶中，振荡30分钟，以打碎菌块。

（b）将上述菌液离心（3000r/min，离心15分钟），弃去上清液，将菌体用无菌生理盐水洗涤2—3次，最后制成菌悬液。

（c）用显微镜直接计数法计数，调整细胞浓度为每毫升108个。

（2）平板制作将淀粉琼脂培养基溶化后，冷至55℃左右时倒平板，凝固后待用。

（3）紫外线处理
（a）将紫外线灯开关打开预热约20分钟。

（b）取直径6cm无菌平皿2套，分别加入上述菌悬液5ml，并放入无菌搅拌棒于平皿中。

（c）将盛有菌悬液的2平皿置于磁力搅拌器上，在距离为30cm，功率为15W的紫外线灯下分别搅拌照射1分钟及3分钟。

(4) 稀释在红灯下，将上述经诱变处理的菌悬液以10倍稀释法稀释成10-1-10-6（具体可按估计的存活率进行稀释）。

(5)涂平板取10-4、10-5、10-6三个稀释度涂平板，每个稀释度涂平板3只，每只平板加稀释菌液0.1ml，用无菌玻璃刮棒涂匀。

以同样操作，取未经紫外线处理的菌稀释液涂平板作对照。

(6)培养
将上述涂匀的平板，用黑布（或黑纸）包好，置37℃培养48小时。

注意每个平皿背面要标明处理时间和稀释度。

(7)计数将培养48小时后的平板取出进行细菌计数，根据对照平板上菌落数，计算出每毫升菌液中的活菌数。

同样计算出紫外线处理1分钟、3分钟后的存活细胞数及其致死率。

(8)观察诱变效应
将细胞计数后的平板，分别向菌落数在5—6个左右的平板内加碘液数滴，在菌落周围将出现透明圈。

分别测量透明圈直径与菌落直径并计算其比值（HC值）。

与对照平板进行比较，根据结果，说明诱变效应。

并选取HC比值大的菌落移接到试管斜面上培养。

此斜面可作复筛用。

五．实验结果
1．结果
将实验结果填入下表。

实验三乳酸菌的分离及乳酸饮料的制作
一、实验目的
掌握从新鲜酸乳中进行乳酸菌的分离纯化的方法和制作乳酸菌饮料技术，了解乳酸发酵的条件及乳酸菌的生长特性。

二、实验材料和用具
嗜热乳酸链球菌（Streptococcus thermophilus）、保加利亚乳酸杆菌（Lactobacillus casei），乳酸菌种也可以从市场销售的各种新鲜酸乳或酸乳饮料中分离。

BCG牛乳培养基、乳酸菌培养基（MRS）、脱脂乳粉、蔗糖、高压蒸汽灭菌锅、超净工作台、培养箱、酸乳瓶（200 - 280mL）、培养皿、试管、300mL三角瓶、恒温水溶锅、酸度计、涂布棒等。

BCG牛乳培养基
（A）溶液：脱脂乳粉100g，水500Ml，加入1.6%溴甲酚绿乙醇溶液1mL，80℃
灭菌20min。

（B）溶液：酵母膏10g，水500mL，琼脂20g，pH 6.8，121℃湿热灭菌20min。

以无菌操作趁热将（A)、（B）溶液混合均匀后倒平板。

三、实验步骤
（一）乳酸菌的分离纯化
1、流程
倒平板→制备梯度稀释液→涂布（或划线法）→培养→挑单菌落→保存。

2、步骤：稀释涂布平板法
（1）制作MRS培养基
乳酸菌培养基（MRS）配方：
蛋白胨5g；牛肉膏5 g ；酵母浸膏2.5 g ；葡萄糖10g；土温80 0.5ml；磷酸氢二钾1g ；乙酸钠2.5g ；柠檬酸氢二铵1g ；七水硫酸镁0.29g；四水硫酸锰0.125g；琼脂条9g；
加入500ml蒸馏水中加热溶解，调pH值为6.8（6.2~6.6），115℃，灭菌15分钟。

（2) 倒平板
将MRS培养基分离乳酸菌加热溶化待冷至55～60℃时，混合均匀后分别倒平板，每种培养基倒三皿。

倒平板的方法：右手持盛培养基的试管或三角瓶置火焰旁边，用左手将试管塞或瓶塞轻轻地拨出，试管或瓶口保持对着火焰；然后左手拿培养皿并将皿盖在火焰附近打开一缝，迅速倒人培养基约15ml，加盖后轻轻摇动培养皿，使培养基均匀分布在培养皿底部，
然后平置于桌面上，待凝后即为平板。

（3）制备酸乳稀释液（最好在无菌操作台上进行）
取市售新鲜酸乳反复摇匀，用无菌吸管吸取1ml，放入盛9ml无菌水的试管中，振摇约20min，使充分混合，将细胞分散。

用一支lml无菌吸管从中吸取1ml悬液加入盛有9ml 无菌水的大试管中充分混匀，然后用无菌吸管从此试管中吸取lml加入另一盛有9ml无菌水的试管中，混合均匀，以此类推制成10-1、10-2、10-3、10-4不同稀释度的乳酸溶液，注意：操作时管尖不能接触液面，每一个稀释度换一支试管。

（4）涂布培养
乳酸稀释液涂布：将上述牛肉膏蛋白胨培养基三个平板底面分别用记号笔写上10-3和10-4两种稀度，然后用无菌吸管分别由10-3、10-4两管乳酸饮料稀释液中各吸取0.1或0.2ml，小心地滴在对应平板培养基上，用无菌涂布器依次涂布，右手拿无菌涂棒平放在平板培养基表面上，将菌悬液先沿同心圆方向轻轻地向外扩展，使之分布均匀。

；或者直接用接种环蘸取原液平板划线分离，每稀释液做两个平板，置40℃培养48h，如出现圆形稍扁平的黄色菌落及其周围培养基变为黄色者初步定为乳酸菌。

（5）鉴别：选取乳酸菌典型菌落转至脱脂乳（脱脂乳粉与5%蔗糖水为1：10的比例配制，装量以试管的1/3为宜，115℃灭菌20min ）试管中，40℃培养8-24h，若牛乳出现凝固，无气泡，呈酸性，涂片镜检细胞杆状或链球状（两种形状的菌种均分别选入），革兰氏染色呈阳性，则可将其连续传代4-6次，最终选择出在3-6h能凝固的牛乳管，作菌种待用。

(三)乳酸菌饮料的制作
1、乳酸菌培养基的制作
将脱脂乳和水以1:7 (W/V)的比例，同时加入6%蔗糖，充分混合，于80～85℃灭菌10～5min，然后冷却至35～40℃，作为制作饮料的培养基质。

即脱脂乳14.3g，无菌水100ml，蔗糖6g。

2、接种
将市售鲜酸乳作为发酵剂，以2%～5%的接种量分别接入以上培养基质中即为饮料发酵液。

接种后摇匀，分装到已灭菌的酸乳瓶中，每一种菌的饮料发酵液重复分装3～5瓶，随后将瓶盖拧紧密封。

3．发酵
把接种后的酸乳瓶置于40--42℃恒温箱中培养3～4h。

培养时注意观察，在出现凝乳后停止培养。

然后转入4～5℃的低温下冷藏24h以上。

经此后熟阶段，达到酸乳酸度适中(pH4～4.5)，凝块均匀致密，无乳清析出，无气泡，获得较好的口感和特有风味。

4．以品尝为标准评定酸乳质量品尝时若出现异味，表明酸乳污染了杂菌。

四、注意事项
1. 采用BCG牛乳培养基琼脂平板筛选乳酸菌时，注意挑取典型特征的
黄色菌落，结合镜检观察，有利高效分离筛选乳酸菌。

2．制作乳酸菌饮料，应选用优良的乳酸菌，采用乳酸球菌与乳酸杆菌等量混合发酵，使其具有独特风味和良好口感。

3．牛乳的消毒应掌握适宜温度和时间，防止长时间采用过高温度消毒而破坏酸乳风味。

4．作为卫生合格标准还应按卫生部规定进行检测，如大肠菌群检测等。

经品尝和检验，合格的酸乳应在4℃条件下冷藏，可保存6～7d。

五、实验结果记录
大肠杆菌生长曲线的测定
(一)目的要求
1．通过细菌数量的测量了解大肠杆菌的生物特征和规律，绘制生长线。

2．复习光电比浊法测量细菌数量的方法。

(二)器材
1．菌种大肠杆菌
2．培养基LB液体培养基70ml，分装2支大试管(5ml/支)，剩余60ml 装入250ml的三角瓶。

3．仪器或其他用具722型分光光度计，水浴振荡摇床，无菌试管，无菌吸管等。

(三)操作步骤
1．标记
取11支无菌大试管，用记号笔分别标明培养时间，即0、1.5、3、4、6、8、10、12、14、16和20h。

2．接种
分别用5ml无菌吸管吸取2.5ml大肠杆菌过夜培养液(培养10~12h)转入盛有
50ml LB液的三角瓶内，混合均匀后分别取5ml混合液放入上述标记的11支无菌大试管中。

3．培养
将已接种的试管置摇床37℃振荡培养(振荡频率250r/min)，分别培养0、1.5、3、4、6、8、10、12、14、16和20h，将标有相应时间的试管取出，立即放冰箱中贮存，最后一同比浊测定其光密度值。

4．比浊测定
用未接种的LB液体培养基作空白对照，选用600nm波长进行光电比浊测定。

从早取出的培养液开始依次测定，对细胞密度大的培养液用LB液体培养基适当稀释后测定，使其光密度值在0.1~0.65之内(测定OD值前，将待测定的培养液振荡，使细胞均匀分布)。

(四)实验报告
1．结果
(1)将测定的OD600值填入下表：
(2)绘制大肠杆菌的生长曲线
实验三摇床培养枯草芽孢杆菌发酵条件的优化
一．实验目的：
掌握微生物斜面培养基、种子培养基及发酵培养基确定方法，学会对已确定菌种确定实验室发酵工艺。

二．实验原理
生物量的测定方法有比浊法和直接称重法等。

由于枯草芽孢杆菌在液体深层通气发酵过程中是以均一混浊液的状态存在的，所以可以采用直接比色法进行测定。

三．仪器与试剂
1．仪器设备
全恒温振荡培养箱，分光光度计、电热恒温水浴槽、天平、电炉。

2．试剂
（1）葡萄糖标准溶液：
准确称取100 ml分析纯葡萄糖（预先在105℃烘至恒重），置于小烧杯中，用少量蒸馏水溶解后，定量转移到100 ml的容量瓶中，以蒸馏水定容，冰箱中保存备用。

（2）3, 5－二硝基水杨酸试剂（DNS试剂）：
甲液：溶解6.9 g苯酚于15.2 ml 10％氢氧化钠中，并稀释至69 ml，在此溶液中加入6.9 g亚硫酸氢钠。

乙液：称取22.5 g酒石酸钾钠，加到300 ml 10％氢氧化钠溶液中，再加入880 ml1％的3、5－二硝基水杨酸溶液。

将甲液与乙液相混合即得黄色试剂，贮于棕色试剂瓶中，放置7－10天以后使用。

（3）37％甲醛溶液
（4）0.05 mol/L氢氧化钠溶液：称取2 g氢氧化钠，溶于水并稀释至1000 ml。

四．实验方法
（1）培养基的配制(见表1,2)
表1 正交表试验设计
因素水平葡萄糖蔗糖酵母膏KH2PO4
1 1.0 0.0 0.5 0.5
2 2.0 1.0 1.0 1.0
3 3.0 2.0 2.0 2.0
表2 正交表实验方案
编号葡萄糖
(A) 蔗糖
(B)
酵母膏
(C)
KH2PO4
（D）
生物量（OD）
0h 12h 24h 36h 48h 60h
1 (1) (1) (1) (1)
2 (1) (2) (2) (2)
3 (1) (3) (3) (3)
4 (2) (1) (2) (3)
5 (2) (2) (3) (1)
6 (2) (3) (1) (2)
7 (3) (1) (3) (2)
8 (3) (2) (1) (3)
9 (3) (3) (2) (1)
（2）将上述培养基配制好以后，每250 ml三角瓶装入培养基100 ml，于121℃下灭菌30 min，冷却。

（3）冷却后接种（接种量为5％），置于28℃培养箱进行培养。

（4）测0D值：将接种0 h、12 h、24 h、36 h、48 h、60 h不同时间的菌悬液摇均匀后于560nm波长、1cm比色皿中测定0D值。

比色测定时，用以未接种的培养基作空白对照，并将0D值填入表中，最终确定最佳培养基的组成及发酵时间。

综合性实验1小型发酵罐的使用与微生物发酵过程及其条件控制
（一）实验类型：综合型
（二）实验类别：基础实验
（三）实验学时数：24
（四）实验目的
1. 了解小型发酵罐的基本结构。

2. 掌握发酵罐的使用及其在实验室内大规模培养微生物的方法。

（五）实验内容
1、微生物的种子培养
2、发酵罐各种配件的安装
3、培养基的消毒处理
4、发酵工艺的调控
5、发酵产物的分离
（六）实验要求
1、学生在实验操作过程中自己动手独立完成，10人1组。

2、完成综合性实验报告：
（1）小型发酵罐的操作记录；
（2）发酵参数的记录，绘制参数的动态曲线；
（3）分离方法的参数记录，产物含量的记录。

（七）实验设备
生物显微镜、发酵罐、灭菌炉等。

（八）实验课承担单位：生命科学学院微生物学实验室
综合性实验2固态发酵试验――米曲霉培养及蛋白酶的分析
（一）实验类型：综合型
（二）实验类别：基础实验
（三）实验学时数：8
（四）实验目的
通过固态三角瓶培养米曲霉，使学生掌握固态培养微生物的原理及技术，并掌握蛋白酶活性的分析方法。

（五）实验内容
米曲霉菌种的纯化（单菌落分离），制成斜面，将斜面菌种接入250mL三角瓶培养成种曲，再将种曲扩大培养（500mL）三角瓶。

米曲霉培养物经水溶物萃取，制得粗酶剂，取粗酶制剂进行蛋白酶活力的测定。

（六）实验要求
1、学生在实验操作过程中自己动手独立完成，4人1组。

2、完成综合性实验报告：
（1）固体操作记录；
（2）发酵参数的记录，绘制参数的动态曲线；
（3）酶活性测定。

（七）实验设备
生物显微镜、三角瓶、灭菌炉等。