生姜泻心汤在治疗难辨梭菌感染所致腹泻的应用[发明专利]

(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201810338166.2
(22)申请日 2018.04.16
(71)申请人 中国中医科学院中药研究所
地址 100700 北京市东城区东直门内南小
街16号
(72)发明人 黄璐琦　苏建荣　李慧　杨洪军　
马致洁　吕治　林龙飞　
(74)专利代理机构 北京路浩知识产权代理有限
公司 11002
代理人 王文君　王璐
(51)Int.Cl.
A61K 36/9068(2006.01)
A61K 38/14(2006.01)
A61P 1/00(2006.01)
A61P 1/04(2006.01)
A61P 1/12(2006.01)A61P 37/02(2006.01)
(54)发明名称
生姜泻心汤在治疗难辨梭菌感染所致腹泻
的应用
(57)摘要
本发明属于医药技术领域，具体涉及生姜泻
心汤在治疗难辨梭菌感染所致腹泻的应用。

本发明在生姜泻心汤现有药理活性的基础之上，通过
大量实验深入研究筛选其新的临床功效，实验结
果表明：生姜泻心汤具有治疗难辨梭菌感染所致
腹泻的用途。

权利要求书1页 说明书9页 附图9页CN 108478757 A 2018.09.04
C N 108478757
A
1.生姜泻心汤在制备用于治疗难辨梭菌感染所致相关性腹泻的药物方面的应用。

2.生姜泻心汤在制备用于免疫调节作用的药物方面的应用。

3.生姜泻心汤在制备用于改善肠道菌群的药物方面的应用。

4.生姜泻心汤在改善肠道菌群方面的应用，该应用排除疾病相关的治疗方法。

5.一种药物组合物，包括生姜泻心汤和万古霉素。

6.权利要求5所述的药物组合物在制备用于治疗难辨梭菌感染所致相关性腹泻的药物方面的应用，或在制备用于免疫调节作用的药物方面的应用，或在制备抑制主要炎症因子的表达的药物方面的应用，或在制备用于改善肠道菌群的药物方面的应用，或在改善肠道菌群方面的应用。

7.根据权利要求1-4、6任一项所述的应用，其特征在于，所述生姜泻心汤的处方由半夏、干姜、黄连、黄芩、人参、大枣、甘草、生姜组成；
优选地，所述生姜泻心汤的处方由半夏5-45g、干姜3-15g、黄连3-15g、黄芩5-45g、人参5-45g、大枣5-45g、甘草5-45g、生姜5-60g组成；
进一步优选地，所述生姜泻心汤的处方由半夏9g、干姜3g、黄连3g、黄芩9g、人参9g、大枣9g、甘草9g、生姜12g组成。

8.根据权利要求5所述的药物组合物，其特征在于，所述生姜泻心汤的处方由半夏、干姜、黄连、黄芩、人参、大枣、甘草、生姜组成；
优选地，所述生姜泻心汤的处方由半夏5-45g、干姜3-15g、黄连3-15g、黄芩5-45g、人参5-45g、大枣5-45g、甘草5-45g、生姜5-60g组成；
进一步优选地，所述生姜泻心汤的处方由半夏9g、干姜3g、黄连3g、黄芩9g、人参9g、大枣9g、甘草9g、生姜12g组成。

权　利　要　求　书1/1页CN 108478757 A
生姜泻心汤在治疗难辨梭菌感染所致腹泻的应用
技术领域
[0001]本发明属于医药技术领域，具体涉及生姜泻心汤在治疗难辨梭菌感染所致腹泻的应用。

背景技术
[0002]难辨梭菌(clostridium difficile，CD)是一种革兰氏阳性厌氧芽胞杆菌，通过粪-口途径在人群中传播。

随着广谱抗菌药物的广泛使用甚至滥用，患者肠道菌群失调，容易诱发难辨梭菌感染(Clostridium difficile infection，CDI)，进而出现腹泻、肠炎等一系列疾病。

难辨梭菌感染已成为全球性的流行病学问题(C l i n c a l I n f e c t i o n Diseases.2007,45(3):302–307.)。

据估计，35％左右的住院患者粪便中可发现难辨梭菌，长期住院的患者中难辨梭菌感染患病率可能高达50％，并且约3％的健康成年人粪便中也会培养出难辨梭菌(British Medical Journal.2010,340:c1296.)。

目前对于难辨梭菌感染的标准治疗有两种方法，分别为万古霉素和甲硝唑。

经甲硝唑与万古霉素治疗难辨梭菌感染有效性的Meta分析结果显示，甲硝唑与万古霉素相比，两者治疗轻度难辨梭菌感染的效果相当，但是万古霉素治疗重度难辨梭菌感染更有效(李锐.甲硝唑与万古霉素治疗艰难梭菌感染的安全性与有效性的Meta分析[D].重庆医科大学,2016.)。

[0003]万古霉素和甲硝唑治疗存在以下问题：①破坏肠道有益菌群；②部分难辨梭菌临床分离株对万古霉素和甲硝唑敏感性下降、耐药率升高；③症状复发率高达15％-35％等问题。

经甲硝唑与万古霉素治疗难辨梭菌感染安全性的Meta分析结果显示，两药联合治疗的不良反应发生率是单一治疗的4倍多。

因此，寻找治疗难辨梭菌感染的替代药物和治疗方案已成为当今研究的重要课题。

发明内容
[0004]本发明的目的在于提供经典名方生姜泻心汤的一种临床应用；本发明的另一目的在于进一步提供经典明方生姜泻心汤在治疗难辨梭菌感染所致相关性腹泻方面的应用。

[0005]具体地，本发明包括生姜泻心汤在制备用于治疗难辨梭菌感染所致相关性腹泻的药物等方面的应用。

[0006]本发明还包括生姜泻心汤在改善肠道菌群方面的应用，该应用排除疾病相关的治疗方法。

[0007]本发明还包括生姜泻心汤在制备用于改善肠道菌群的药物等方面的应用。

[0008]本发明还提供一种药物组合物，包括生姜泻心汤和万古霉素。

该药物组合物可用于治疗难辨梭菌感染所致相关性腹泻。

[0009]本发明所述生姜泻心汤的处方由半夏、干姜、黄连、黄芩、人参、大枣、甘草、生姜组成。

[0010]进一步地，本发明所述生姜泻心汤的处方由半夏5-45g、干姜3-15g、黄连3-15g、黄芩5-45g、人参5-45g、大枣5-45g、甘草5-45g、生姜5-60g组成。

[0011]较佳地，本发明所述生姜泻心汤的处方由半夏9g、干姜3g、黄连3g、黄芩9g、人参9g、大枣9g、甘草9g、生姜12g组成。

[0012]本发明所述生姜泻心汤可用本领域常规方法制备。

药材也可采用本领域常规方法或经典文献记载的净制品或炮制品。

[0013]中医对感染的认识主要从细菌与患者两方面进行认识，强调患者自身正气的强弱与疾病的关系，认为“正气存内则邪不可干”，内因是根本，不是单纯的抗菌。

中药资源丰富，研究表明，多数抗菌中药具有广谱抗菌作用，从传统中药中寻求对抗细菌的有效药物及研究中西药联合使用以降低细菌的耐药性都是可行性途径。

[0014]中药复方生姜泻心汤出自中医经典古籍《伤寒论》“治伤寒汗出后，胃中不和，心下痞硬，噫气臭，胁下有水气，腹中雷鸣不利者。

”该方由半夏、干姜、黄连、黄芩、人参、大枣、甘草、生姜组成。

临床研究证实，生姜泻心汤能有效预防伊立替康所致迟发性腹泻(邓超.生姜泻心汤预防伊立替康所致迟发性腹泻的机理研究[D].北京中医药大学,2017.)。

生姜泻心汤对感染后肠易激综合征也具有治疗作用。

生姜泻心汤可减轻燥热之性，化散水气之功，止泻同时又不致便秘，是预防和辅助治疗难辨梭菌感染的可行药物。

借助网络药理学、计算机化学技术方法、查阅中医经典古籍并结合临床专家的实践经验，经多次专家论证达成共识，认为生姜泻心汤可作为治疗难辨梭菌的候选方剂。

[0015]采用C57BL/6小鼠难辨梭菌感染模型，进行生姜泻心汤对难辨梭菌感染的动物药效学评价预实验，研究发现：(1)生姜泻心汤单独使用不及万古霉素的抑菌能力强，但仍表现出了一定的治疗作用；(2)生姜泻心汤中剂量组联合万古霉素组使用，不仅有直接抑菌作用，还可降低停药后万古霉素的死亡率；(3)生姜泻心汤的治疗起效较慢，但治疗作用稳定，且无复发迹象，体现了中药的作用特点和优势。

预实验存在问题：(1)本次模型未出现较明显的腹泻和大量的死亡，可能由菌的浓度或质量所致；(2)生姜泻心汤单独使用，未做出剂量依赖关系，且生姜泻心汤高剂量组出现了相反的作用；以确证生姜泻心汤的量效关系；
(3)预实验动物只数较少，对观察死亡率的差异不利；(4)预实验仅有体重、状态、死亡率及A/B毒素等药效学指标，缺少免疫学等揭示作用机制的数据。

[0016]本发明的关键点
[0017] 1.生姜泻心汤可减轻燥热之性，化散水气之功，止泻同时又不致便秘，是预防和辅助治疗难辨梭菌感染的可行药物。

[0018] 2.借助网络药理学、计算机化学技术方法、查阅中医经典古籍并结合临床专家的实践经验，经多次专家论证达成共识，认为生姜泻心汤可作为治疗难辨梭菌的候选方剂。

[0019] 3.本发明在生姜泻心汤现有药理活性的基础之上，通过大量实验深入研究筛选其新的临床功效，实验结果表明：生姜泻心汤具有治疗难辨梭菌感染所致腹泻的用途。

[0020]本发明的效果
[0021]生姜泻心汤是经典名方，出自东汉张仲景所著的经典著作《伤寒论》,研究发现该复方具有治疗效果稳定、恢复肠道菌群平衡、调节免疫和肠道代谢的作用，对于治疗难辨梭菌感染的患者效果尤佳。

[0022]生姜泻心汤在治疗难辨梭菌感染所致腹泻方面的优点，具体如下：
[0023] 1.生姜泻心汤总体体现了一定的治疗效果，其特点体现在：早期效果不佳，远远不及万古霉素治疗效果显著；治疗起效时间较万古霉素长，但其效果较万古霉素稳定，且不易
出现复发现象，体现了中医药多成分、多靶点的治疗优势，为难辨梭菌感染提供一种可能的治疗策略；
[0024] 2.生姜泻心汤对肠道菌群的调节作用：万古霉素可有效抑制难辨梭菌的生长，但同时对有益菌群的数量和比例破坏较大，而生姜泻心汤在恢复菌群的平衡方面具有较明显的优势；
[0025] 3.生姜泻心汤对肠道代谢的影响：从肠道代谢物水平看，使用万古霉素对肠道代谢影响较大，短期内较难恢复至正常水平；而单独使用生姜泻心汤对肠道代谢影响较温和，且有逐渐向正常恢复的趋势。

附图说明
[0026]图1万古霉素+生姜泻心汤治疗组小肠组织病理变化图。

[0027]图2生姜泻心汤中剂量治疗组小肠组织病理变化图。

[0028]图3生姜泻心汤低剂量治疗组小肠组织病理变化图。

[0029]图4生姜泻心汤极低剂量治疗组小肠组织病理变化图。

[0030]图5不同时间点小鼠体重变化情况图；图5中，A:正常对照组；B:模型组；C:万古霉素治疗组；D:万古霉素+生姜泻心汤低剂量组；E:生姜泻心汤中剂量组；F:生姜泻心汤低剂量组；G:生姜泻心汤极低剂量组。

M1:各种抗生素干预前；M2：各种抗生素干预后；M3：艰难梭菌感染后；
[0031]T1：治疗1天后；T2：治疗3天后；T3：治疗5天后；O1：停药观察第3天。

[0032]图6(M1)各种抗生素干预前A&B毒素检测结果图。

[0033]图7(M2)抗生素干预后A&B毒素检测结果图。

[0034]图8(M3)艰难梭菌感染后A&B毒素检测结果图；vs空白(A)组，**p＜0.01。

[0035]图9(T1)治疗1天后A&B毒素检测结果图；vs模型(B)组，**p＜0.01。

[0036]图10(T2)治疗3天后A&B毒素检测结果图；vs模型(B)组，*p＜0.05，**p＜0.01。

[0037]图11(T3)治疗5天后A&B毒素检测结果图；vs模型(B)组，*p＜0.05。

[0038]图12(O1)停药后观察第3天A&B毒素检测结果图；vs模型(B)组，*p＜0.05。

[0039]图6至图12中，A:正常对照组；B:模型组；C:万古霉素治疗组；D:万古霉素+生姜泻心汤低剂量组；E:生姜泻心汤中剂量组；F:生姜泻心汤低剂量组；G:生姜泻心汤极低剂量组。

[0040]图13不同时间点模型组和万古霉素治疗组A&B毒素水平的变化趋势图；图13中，B:模型组；C:万古霉素治疗组；M1:各种抗生素干预前；M2：各种抗生素干预后；M3：艰难梭菌感染后。

[0041]T1：治疗1天后；T2：治疗3天后；T3：治疗5天后；O1：停药观察第3天
[0042]图14不同时间点万古霉素及生姜泻心汤治疗组A&B毒素变化情况图。

图14中，C:万古霉素治疗组；D:万古霉素+生姜泻心汤低剂量组；E:生姜泻心汤中剂量组；F:生姜泻心汤低剂量组；G:生姜泻心汤极低剂量组；M1:各种抗生素干预前；M2：各种抗生素干预后；M3：艰难梭菌感染后；T1：治疗1天后；T2：治疗3天后；T3：治疗5天后；O1：停药观察第3天。

[0043]图15Alpha多样性分析图；图15中，Nor：正常对照组；Pretre：预处理组；Mode：造模组；Van5：万古霉素治疗组5天；Comb5：万古+中药联合治疗5天；Chinz5：中药中剂量5天；
Chind5：中药低剂量5天；Chindd5：中药极低剂量5天。

[0044]图16组间差异检验图；注：此图展示所选两组样本间的显著性差异情况，并对有显著性差异的两组做好标记(0.01<p<＝0.05标记为*，0.001<p<＝0.01标记为**，p<＝0.001标记为***)。

横坐标为分组名，纵坐标为每组的指数平均值。

[0045]图17群落组成分析Bar图(分类水平：门)；注：正常对照，CDI造模，万古治疗，中药中剂量，中药低剂量五组比较。

脱铁杆菌门(D e f e r r i b a c t e r e s)，疣微菌门(Verrucomicrobia)，变形菌门(Proteobacteria)，拟杆菌门(Bacteroidetes)，厚壁菌门(Firmicutes)。

[0046]图18群落组成分析Bar图(分类水平：纲)；注：正常对照，抗菌处理，CDI造模，万古治疗，中药中剂量，五组比较；其中，ε-变形菌纲Epsilonproteobacteria，δ-变形菌纲Deltaproteobacteria，脱铁杆菌纲Deferribacteres，Erysipelotrichaceae纲(暂无中文名称)，芽孢杆菌纲B a c i l l i，疣微菌纲V e r r u c o m i c r o b i a e，β-变形菌纲Betaproteobacteria，γ-变形菌纲Gammaproteobacteria，梭菌纲Clostridia，拟杆菌纲Bacteroidetes。

[0047]图19PCoA分析图。

具体实施方式
[0048]以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。

所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购买得到的常规产品。

[0049]实验例
[0050] 1.材料
[0051] 1.1药品
[0052]万古霉素给药剂量：50mg/kg；生姜泻心汤中剂量：16.4g/kg，生姜泻心汤低剂量：8.2g/kg，生姜泻心汤极低剂量：4.1g/kg。

[0053](说明：生姜泻心汤给药剂量以生药材的质量计，其中低剂量组相当于人用剂量的等效剂量，给药方式：灌胃)。

[0054] 1.2动物
[0055]4-5周龄C57BL/6小鼠，体重18±2g。

[0056] 2.方法与结果
[0057]生姜泻心汤的处方为：半夏9g、干姜3g、黄连3g、黄芩9g、人参9g、大枣9g(擘)、炙甘草9g、生姜12g，其制备方法为半夏加沸水清洗数遍后与其它7味药材合并煎煮，药液过滤浓缩至一定体积即得。

[0058] 2.1动物分组与给药及取材
[0059]取小鼠140只，正常饲养3-5天以适应环境。

随后，记录体重，随机分成7组，每组20只，即：正常对照组(A)，模型组(B)，万古霉素治疗组(C)，万古霉素+生姜泻心汤低剂量组(D)，生姜泻心汤中剂量组(E)，生姜泻心汤低剂量组(F)，生姜泻心汤极低剂量组(G)。

[0060] 2.1.1动物造模
[0061]分组后，除正常组外，对其他6组小鼠进行造模。

造模方法：抗生素混合液代替饮水
3天；3天后，更换正常饮水，持续2天，并与正常饮水第2天称体重、取粪便检测难辨梭菌A/B 毒素；次日，给予小鼠灌胃难辨梭菌悬液，给菌后随时观察记录小鼠状态，包括：活动情况、粪便形状、死亡情况等；24小时后，取粪便检测A/B毒素，综合评价模型复制情况。

[0062] 2.1.2治疗期给药
[0063]造模成功后，连续给药5天，正常组每天给予相同体积的生理盐水。

在给药治疗期间随时观察记录小鼠状态，包括：活动情况、粪便形状、死亡情况等；称取体重，并取小鼠粪便检测A/B毒素水平；综合评价治疗效果。

[0064]末次给药后，每组随机选取6只小鼠，眼眶取血，IL-1，TNF-α，IL-6等炎症因子的变化情况；解剖取结肠，病理染色，观察各组小鼠病理改变情况；取小鼠回盲部液体，比较不同干预组肠道菌群的改变情况。

[0065] 2.1.3停药后观察
[0066]给药结束后，随时观察记录小鼠状态，包括：活动情况、粪便形状、死亡情况等；每天称取体重，隔日取粪便检测A/B毒素水平，观察持续2-3周，根据后期观察期小鼠状态及A/ B毒素水平情况；解剖取结肠，病理染色，观察各组小鼠病理改变情况；取小鼠回盲部液体，比较不同干预组肠道菌群的改变情况。

[0067] 2.2实验结果
[0068] 2.2.1治疗结束后各组小肠组织病理改变情况
[0069]万古霉素联合生姜泻心汤治疗组(图1)肠粘膜上皮结构完整，部分上皮细胞深染，少量细胞坏死；粘膜下层疏松水肿，毛细血管扩张。

表明造模后给予万古霉素联合生姜泻心汤治疗，可一定程度改善难辨梭菌对小鼠小肠组织的损伤。

[0070]生姜泻心汤中剂量治疗组(图2)肠粘膜层结构完整，未见溃疡及炎性细胞浸润，少量粘膜上皮细胞核固缩、深染；肠腺上皮细胞可见点状坏死。

表明造模后给予中剂量生姜泻心汤治疗，可以改善难辨梭菌感染导致的炎症情况。

[0071]生姜泻心汤低剂量治疗组(图3)肠粘膜层结构完整，粘膜上皮细胞固缩、深染，；部分肠腺上皮细胞深染。

说明在造模后，给予低剂量生姜泻心汤治疗，可以改善难辨梭菌感染导致的小鼠小肠组织的完整性。

[0072]生姜泻心汤极低剂量治疗组(图4)肠粘膜层结构完整，粘膜上皮细胞可见核固缩，少量细胞坏死；粘膜层可见坏死。

说明在造模后，给予极低剂量生姜泻心汤治疗，可以改善难辨梭菌感染导致的小鼠小肠组织的完整性，但仍有少量细胞坏死及粘膜层的坏死。

[0073] 2.2.2停药后观察1周后，各组小鼠小肠组织病理改变情况
[0074] 2.2.3小鼠体重变化情况
[0075]从图5可以看出小鼠体重变化情况，整个实验过程中各组小鼠体重总体呈增长趋势，其中给予难辨梭菌后至第二天药物治疗期间，各组小鼠体重明显下降，说明难辨梭菌感染后对小鼠体重影响较大，但随着时间的延长及给予药物治疗后各组小鼠(包括模型组)体重逐步缓慢恢复并不断增长，各组之间并未看出明显差异。

[0076] 2.2.4难辨梭菌毒素A&B变化情况
[0077]难辨梭菌毒素A/B是该细菌的主要致病物质，小鼠粪便标本中A/B毒素水平可有效反映肠道中致病菌繁殖的数量和发展状况。

[0078]从图6结果可以看出，在给予各种抗生素干预前，除空白组外，各组小鼠难辨梭菌
毒素检测结果均为阴性(<0.13)，且无统计学差异；
[0079]从图7结果可以看出，造模期间给予各种抗生素干预后，有部分小鼠的A&B毒素水平有呈现灰区(0.13—0.37)，说明在模拟人类服用各种抗生素时，小鼠可能出现肠道菌群的变化，但各组均未有感染难辨梭菌毒素A&B阳性；
[0080]从图8结果可以看出，除空白组，其他各组给予难辨梭菌24h后，A&B毒素水平显著升高，都在阳性(＞0.37)区间，且毒素水平较高，说明小鼠体内难辨梭菌感染较严重，从A&B 毒素水平看，难辨梭菌感染小鼠模型成功，为后续药物评价提供支持；
[0081]从图9结果可以看出，模型成功后，给予不同药物治疗1天，万古霉素标准治疗组(C)及万古霉素联合中药生姜泻心汤治疗组(D)A&B毒素水平显著显著降低(＜0.37)，与模型组(B)与极显著的差异(p＜0.05)，表现出较好治疗效果；而在治疗1天后，生姜泻心汤单独治疗组(E、F、G)的A&B毒素水平较高，与模型组相比未见明显差异，说明在治疗前期中药生姜泻心汤未显示治疗效果；
[0082]从图10结果可以看出，给予不同药物治疗3天后，万古霉素标准治疗组(C)的A&B毒素水平显著降低(＜0.37)，与模型组(B)与极显著的差异(p＜0.05)，仍表现出较好了治疗效果；万古霉素联合中药生姜泻心汤治疗组(D)较治疗1天后的水平有上升趋势，但与模型组(B)相比仍具有显著差异(p＜0.01)，表现出一定的治疗效果；而在治疗3天后，生姜泻心汤单独治疗组(E、F、G)的A&B毒素水平较治疗第一天有较明显的下降趋势，且与模型组相比有显著差异(p＜0.05或p＜0.01)，说明在治疗3天后中药生姜泻心汤显示出一定的治疗效果，但此时效果仍不及万古霉素；
[0083]从图11结果可以看出，给予不同药物治疗5天后，万古霉素标准治疗组(C)及万古霉素联合中药生姜泻心汤治疗组仍表现出较好的治疗作用，与模型组(B)比有显著的差异(p＜0.05)；生姜泻心汤单独治疗组(E、F)与模型组相比也有显著差异(p＜0.05)，说明在治疗5天后中药生姜泻心汤(E、F)显示出一定的治疗效果，而此时与万古霉素治疗效果相当；[0084]从图12结果可以看出，停药后第3天，模型组(B)的毒素水平已基本恢复至正常水平，而单独给予万古霉素标准治疗组(D)出现较明显的反弹现象，其毒素水平可高达4左右，远远高于阳性界限(大于0.37)，小鼠可能此时出现了临床常见的复发现象，而万古霉素联合中药泻心汤组(D)以及单独给予中药泻心汤不同剂量组(E、F、G)的毒素水平仍保持在阳性界限以下，治疗比较稳定；
[0085]从图13结果可以看出，模型组(B)及万古霉素治疗组(C)在造模期给予艰难梭菌前(M1，M2)，其A&B毒素水平均处于较正常水平；在灌服难辨梭菌24h后(M3)，两组A&B毒素水平显著升高，远远高于阳性界限(＞0.37)，在治疗过程中，万古霉素组毒素水平显著下降，但模型组未给予任何药物治疗，其毒素水平也有缓慢下降趋势，说明模型组小鼠存在自我恢复现象；停药后模型组小鼠的毒素水平仍继续呈下降趋势，而万古霉素治疗组毒素水平则突然显著升高，可能出现了临床常见的复发情况；
[0086]从图14结果可以看出，万古霉素治疗组(C)及中药各治疗组(D、E、F、G)在造模期给予难辨梭菌前(M1，M2)，其A&B毒素水平均处于较正常水平；在灌服难辨梭菌24h后(M3)，各组A&B毒素水平显著升高，远远高于阳性界限(＞0.37)，在治疗前期(T1：1天后)，万古霉素组(C)及万古霉素联合中药生姜泻心汤组(D)毒素水平显著下降，而此时中药生姜泻心汤各治疗组(E、F、G)毒素水平仍较高，未显示出治疗作用；治疗中期(T2：3天后)，各组(C、D、E、F、
G)毒素水平均较低，显示出不同程度的治疗作用，但此时，万古霉素治疗组(C)及万古霉素联合中药生姜泻心汤治疗组(E)治疗效果较单独使用中药生姜泻心汤各组(E、F、G)；治疗后期(T3：5天后)，各组(C、D、E、F、G)毒素水平均较低，显示出不同程度的治疗作用，此时，各组治疗效果相当；停药结束观察，万古霉素治疗组(D)毒素水平显著升高，可能出现复发现象，而万古霉素联合中药生姜泻心汤组(D)及各中药生姜泻心汤治疗组(E、F、G)均未出现复发现象，其治疗作用较稳定。

[0087] 2.2.5肠道菌群的改变情况
[0088]测序数据优化序列信息表
[0089]
[0090]
[0091](1)Alpha多样性分析图15结果表明：
[0092]正常对照组菌群多样性丰度值最高，抗菌药物处理组、万古霉素治疗组，联合治疗组的多样性丰度均较低，中药的使用促进了菌群恢复多样性。

[0093](2)组间差异检验图16结果表明：
[0094]左图CDI造模使正常菌群丰度明显下降，中图万古霉素治疗杀灭难辨梭菌的同时进一步使菌群丰度下降，右图中药对菌群丰度的改善明显优于万古霉素。

[0095](3)群落组成分析Bar图17(分类水平：门)结果表明：
[0096]AW1\AL1\AR1(正常对照组小鼠)肠道菌群构成：厚壁菌门Firmucutes(革兰阳性菌)占45-55％，拟杆菌门Bacteroidetes(革兰阴性厌氧菌有益菌)占55-65％，多形菌门Proteobacteria不足5％，与文献报道一致；
[0097]B1\B2\B3(造模组小鼠)：在抗生素预处理和难辨梭菌灌胃后，拟杆菌门消失，多形菌门和厚壁菌门显著增加；
[0098]C1/C2/C3(万古霉素治疗组)：万古霉素抑制厚壁菌门但对多形菌门没有作用；[0099]E1/2/3和F1/2/3(中药中低剂量组)：中药治疗后，厚壁菌门和多形菌门均受到抑制，拟杆菌门占比例恢复，中药中剂量组优于低剂量组。

E组中药中剂量组治疗5天后，其菌群构成已接近A组正常对照组。

[0100](4)群落组成分析Bar图18(分类水平：纲)结果表明：
[0101]抗菌药物混合溶液(卡那，庆大，多粘，万古，甲硝唑)和克林霉素处理后，难辨梭菌灌胃前取材，B41,C42,D43小鼠菌群构成显示：在抗生素的作用下，小鼠肠道中拟杆菌纲和梭菌纲的比例显著下降，变形菌纲中的γ-变形菌纲(肠杆菌目，假单胞菌目)由于易产生耐药性或天然耐药成为优势菌。

[0102](5)PCoA分析图19结果表明：
[0103]PCoA分析，即主坐标分析(principal co-ordinates analysis)对不同样本的相似性和差异进行分析。

主成分1(PC1)和主成分2(PC2)是造成样品分组的两个最大差异特征，贡献率分别为39.05％和17.83％。

万古霉素使用与否是造成样本分组的主要原因：图中右侧四组均在未使用万古霉素治疗时取材，而左侧均在使用万古霉素治疗时取材。

说明万古霉素对肠道菌群构成的影响较难辨梭菌更大。

中药中剂量组与正常对照组的菌群构成最接近。

[0104] 3.结论。