2015酶工程第5章 酶的非水相催化

Kcat / K m L K LD Kcat / K m D
– Km —— 米氏常数 – Kcat—— 酶的转换数 立体选择系数越偏离 1，酶催化的对映体选择性越强。
• 酶在水溶液中催化的对映体选择性较强，而在疏水性强 的有机介质中对映体选择性较差（为什么？）
N-乙酰丙氨酸氯乙酯
–可能因底物的两种对映体与酶分子结合方式不同，把 水分子从酶分子疏水结合位点臵换出来的能力不同。
有机溶剂介质体系类型： (1) 微水-有机溶剂单相体系 (2) 水-有机溶剂单相体系
(3) 水-有机溶剂双相体系
(4) 正胶束体系
(5) 反胶束体系
不管采用何种有机介质反应体系，酶催化反应的介质中都含 有机溶剂和一定量的水。它们都对催化反应有显著的影响。
(1) 微水-有机溶剂单相体系
又称微水介质体系、非极性有机溶剂-酶悬浮体系 有机溶剂(98%)： 烃、醚、芳香族、卤代烃 水(<2%)： 酶分子的结合水，维持酶催化活性 酶： 悬浮状态；不溶的固相酶，结晶/冻干 /沉淀状态；或吸附在固体载体表面 特征： 酶稳定性好，分散性差，催化效率低 适用于： 水解类酶，减少含水量利于合成反应
栗树精胺
Contents of chapter 5
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5.1、非水相酶催化的介质体系 5.2、有机介质中的酶催化 5.3、酶非水相催化的应用
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5.1 非水相酶催化的介质体系
非水相酶催化的介质体系
5.1.1 有机溶剂介质体系（重点） 5.1.2 气相介质体系
5.1.3 超临界流体介质体系
5.1.4 离子液体介质体系
Enzyme Organic solvent Water
(4)正胶束体系
水为主体，表面活性剂的极 性端朝外，非极性端朝内， 酶在液相主体中，反应在胶 束两相界面进行。
(5) 反胶束体系
有机溶剂为主体，表面活性 剂极性端朝内，非极性端朝 外，酶在反胶束内部主体， 反应在胶束两相界面进行。
常用表面活性剂：丁二酸2-乙基酯磺酸钠(ATO)、十六 烷基三甲基溴化铵(CTAB)、卵磷脂和Tween。 常用有机溶剂：正辛烷或异辛烷 多数酶包埋在反胶束中，能保持高活性和稳定性，表现 “超活性”，模拟体内环境，研究酶结构和动力学性质。
• 增加体系的水含量能提高酶的对映体选择性，而在疏水 性溶剂中酶的立体选择性较差。
–酶在有机介质中的催化特性 —— 区域选择性
5.1.1 有机溶剂介质体系：
a. 酶在含有一定量水的有机溶剂中进行催化反应的介质体系； b. 底物、产物两者或其中之一为疏水性物质； c. 酶在有机介质中能够基本保持其完整的结构和活性中心的 空间构象，发挥其催化功能； d. 酶的底物特异性、立体选择性、区域选择性、键选择性和 热稳定性等都有所改变。
作用力因素
酶分子“紧密”状态主要取决于蛋白质分子内氢键， 而溶液中水分子与蛋白质分子间形成的氢键一定程度破坏 蛋白质分子内氢键，蛋白结构变得松散，呈“开启”状态。
蛋白质分子内与分子间氢键的动态平衡Zaks et al, 1988
酶分子紧密和开启状态处于动态平衡，表现一定的柔性。
有机介质中的酶催化
• 底物特异性
• 立体选择性 • 区域选择性 • 键选择性 • 热稳定性 有机相中酶能够催化新的反应， 生成新产物
• pH特性
–酶在有机介质中的催化特性 —— 底物特异性
• 有机介质中的酶活性中心结合部位与底物的结合状态 改变，致使酶的底物特异性改变。
N-乙酰-L-苯丙氨酸乙酯
N-乙酰-L-丝氨酸乙酯
离子液体介质中的酶催化 —— 反应实例
催化剂 离子液体种类 反应类型 对硝基苯酚磷酸酯水解 蛋白质复性 1,3-二氰基苯的生物转化 Aspartame（甜味剂） 合成 酮的还原 烯醇的动力学拆分 辅酶 NADH 再生 在超临界 CO2 中酯化 1辛醇 手性有机磷化合物拆分 发表 年份 1984 2000 2000 2000 2001 2001 2002 2002 2002 2002
固态酶：以固体形式存在于有机相中，包括冷冻干燥的酶 粉、固定化酶、结晶酶 可溶解酶：水溶性大分子共价修饰酶、非共价修饰的高分 子/酶复合物、表面活性剂/酶复合物、微乳液中的酶
为什么酶在有机介质中具有催化活力?
结构因素
有机相中酶能够保持其整体结构的完整性，至少 酶活性部位与水溶液中的结构是相同的。 X-ray FT-IR ESEM EPR NMR 不同介质中酶活性中心的完整性相差不大，但酶 活力却相差4个数量级，因此认为酶分子结构的动态 变化很可能是主要因素。
离子液体介质中的酶催化 —— 反应实例
脂肪酶催化 1-苯乙醇（1-phenylethanol）外消旋体的拆分
在离子液体中 获得的产物 e.e. 值高于在 有机溶剂中的 值，但产率偏 低。
离子液体介质中的酶催化—— 期刊论文
离子液体介质中的酶催化 —— 期刊论文
5.2 有机介质中的酶催化
酶在有机溶剂中的存在形式
5.1.3 超临界流体介质体系：
a. 超临界流体（supercritical fluid, SCF）是指温度和压力 超过某物质临界点所形成的可压缩性高密度流体，介于气 液之间，如CO2, SO2, C2H4，CO2最常用，廉价无毒。 b. 具有高扩散系数、低黏度和低表面张力,使底物向酶的传 质速度加快，提高反应速度; c. 可以改变酶的特性，如底物专一性、区域选择性和对映体 选择性，增强酶的稳定性。 例：超临界 CO2 中南极假丝酵母脂肪酶催化葡萄糖酰化反应
--阴离子：
无机阴离子：BF4-、PF6-、SbF6-、NO3- 等 有机阴离子：CF3SO3-、(CF3SO3)2N-、ArSO3-、CF3CO2- 等
c. 挥发性低、稳定性好，不可燃，不氧化，低毒，环境友好 的绿色溶剂； d. 对无机/有机/高聚物的溶解性好，疏水、亲水性等溶剂特 性可调节； e. 酶在离子液体中具有良好稳定性、区域选择性、立体选择 性、化学键选择性等特点。
解释：疏水性的相对强弱
• 不同的有机介质，酶的底物专一性也不一样
极性较弱
极性较强
N-乙酰-L-苯丙氨酸乙酯
N-乙酰-L-丝氨酸乙酯
• 极性较强的有机溶剂中，疏水性较强的底物易反应 • 极性较弱的有机溶剂中，疏水性较弱的底物易反应
– 酶在有机介质中的催化特性 —— 对映体选择性
• 对映体选择性（enantioselectivity）是酶在对称的外消 旋化合物中识别一种异构体的能力大小的指标。 • 立体选择系数（KLD）
E. coli 碱性磷酸酯酶 [H3NEt][NO3] 鸡蛋清溶菌酶 红球菌 R312 完整细 胞 嗜热蛋白酶 面包酵母完整细胞 脂肪酶 [H3NEt][NO3] [BMIM][PF6] / buffer [BMIM][PF6] [BMIM][PF6] / buffer [BMIM][(CF3SO2)2N] [4-MBPy][BF4] [BMIM][(CF3SO2)2N] [BMIM][PF6]
补充：
最常见的是超临界二氧化碳， 其临界温度为31.06℃，临界压力 为7.38Mpa；超临界水的临界点为 374℃，22Mpa；超临界甲醇为 239℃，8.1MPa。 超临界二氧化碳可轻易穿过 细菌的细胞壁，在其内部引起剧 烈的氧化反应，杀死细菌。可用 于清洗各种精密仪器，亦可代替 干洗所用的氯氟碳化合物，以及 处理被污染的土壤。
5.2.1 酶在有机介质中的催化特性 5.2.2 有机介质中酶催化反应的类型
5.2.3 水对酶催化反应的影响
5.2.4 有机溶剂对酶催化反应的影响 5.2.5 有机介质中酶催化反应的条件及其控制
5.2.1 酶在有机介质中的催化特性
有机溶剂影响酶的表面结构、活性中心结合部位、底 物的存在状态（亲水/疏水），从而影响酶催化特性。
不同类型的酶在反胶束中的排布模型：
5.1.2 气相介质体系：
a. 某些酶在液相中受到一定限制，如酶和辅酶操作不稳定、 底物和产物溶解性差、产物抑制，在气相中得以克服； b. 适用于易于挥发底物或能转化为气体的物质的酶催化反应；
c. 气体密度低，易扩散，气相中酶催化作用与液相明显不同。
例：Hwang 等人研究醇氧化酶在气相中催化的反应
非水酶学 non-aqueous enzymology
非水酶学能做什么？
a. 研究非水介质中的酶结构与功能、酶作 用机制、酶作用动力学等； b. 研究酶催化的介质，开发非水介质和新 的酶促反应体系，发展出介质工程 （medium engineering）； c. 拓宽酶催化反应的应用范围，使酶法合 成与化学法合成相互补充。
非水相酶催化的优势
a. 易于分离纯化，以及酶的回收与再利用； b. 增加某些底物的溶解度，加速反应； c. 改变反应平衡：在有机介质中，由于水的含量极微，导 致酶促水解反应逆向进行； 例：蛋白酶水相催化肽链水解，有机相中催化肽链合成 d. 改变或提高酶的选择性，减少副反应； 例：无水吡啶中枯草杆菌蛋白酶选择性酰化栗树精胺
– X 射线晶体衍射结果证明，有机溶剂中酶的结构至 少是酶活性部位的结构与水溶液中的结构相同
– 电子顺磁共振（EPR）研究表明，固定化乙醇脱 氢酶在有机溶剂中保持其三维构象，酶在有机介 质中维持其天然构象并非必须固定化
– 固态 15N-NMR 技术探测到酶活性部位氢键网络的 存在，说明酶活性部位（His 残基）的微环境在水 中与在有机溶剂中相同 – 环境扫描电子显微镜（ESEM）直接观察不同环境 下枯草溶菌素的微观形态，发现酶活性部位不与 溶剂发生直接作用，不因溶剂的改变而发生明显 变化
Chapter 5 Enzyme Molecules Enzymatic catalysis in Non-aqueous system
酶的非水相催化
酶只在水溶液中发挥活性
有机溶剂是酶的变性剂
？
1966，Dostoli & Siegel
胰凝乳蛋白酶和辣根过氧化物 酶在有机溶剂中具有催化活性 1977， Klibanov 水/氯仿中脂肪酶催化N-乙酰-L-色氨酸酯 化，两相体系达100%，但水中收率极低 1984， Klibanov & Zaks，Science，224: 1249 微水介质下酶促合成酯、肽、手性醇等；酶不仅 在有机溶剂中保持稳定，且具有高催化转酯活性
Enzyme Water+Solvent
源自文库
(3) 水-有机溶剂双相体系
又称与水不溶性有机溶剂组成的双相体系 有机溶剂(10~20%，有时50~70%)： 低/非极性，酯、烷烃、醚、氯代烷等 水：水与非极性有机溶剂不混溶 酶：溶于水相 底物、产物： 依据亲疏水性溶于相应相 特征： 反应一般发生在水相或两相的界面上， 需振荡和搅拌加快反应； 酶不易失活；产物抑制效应降低。 适用于： 强疏水性底物（如甾体、酯类、烯烃 类）生物转化
-半乳糖苷酶
甲酸脱氢酶 南极假丝酵母脂肪酶 荧光假单孢菌脂肪酶
[MMIM][MeSO4] / buffer N-乙酰氨基乳糖合成
离子液体介质中的酶催化 —— 反应实例
脂肪酶催化 1-苯乙醇（1-phenylethanol）外消旋体的拆分
ee (对映体过量,enantiomeric excess)表示一个对映体 对另一个对映体的过量，通常用百分数表示。 ee=([R]-[S]/[R]+[S])*100%
Enzyme+water
Organic solvent
(2) 水-有机溶剂单相体系
又称与水溶性有机溶剂组成的均一体系 有机溶剂(10~20%，有时50~70%)： 强极性， DMSO、DMF、THF、 二噁烷、丙酮和低级醇等 水：水与极性有机溶剂可混溶 酶、底物、产物： 溶解于体系 特征： 易传质、反应效率高，对酶毒性大， 除枯草芽孢杆菌蛋白酶和某些脂肪酶 适用于： 水中溶解度低，反应慢的亲脂性底物 降低系统冰点，进行低温酶促反应
5.1.4 离子液体介质体系：
a. 离子液体（ionic liquids）是由有机阳离子与有机（无机） 阴离子构成的，在室温条件下呈液态的低熔点盐类；
b. 离子液体熔点低的原因：其结构中某些取代基的不对称性 使离子不能规则地堆积成晶体所致；
--阳离子：有机杂环或铵盐、鏻盐
咪唑类
吡啶类
季铵盐类
季磷盐类