2015酶工程第5章 酶的非水相催化

不同类型的酶在反胶束中的排布模型：
5.1.2 气相介质体系：
a. 某些酶在液相中受到一定限制，如酶和辅酶操作不稳定、 底物和产物溶解性差、产物抑制，在气相中得以克服； b. 适用于易于挥发底物或能转化为气体的物质的酶催化反应；
c. 气体密度低，易扩散，气相中酶催化作用与液相明显不同。
例：Hwang 等人研究醇氧化酶在气相中催化的反应
• 底物特异性
• 立体选择性 • 区域选择性 • 键选择性 • 热稳定性 有机相中酶能够催化新的反应， 生成新产物
• pH特性
–酶在有机介质中的催化特性 —— 底物特异性
• 有机介质中的酶活性中心结合部位与底物的结合状态 改变，致使酶的底物特异性改变。
N-乙酰-L-苯丙氨酸乙酯
N-乙酰-L-丝氨酸乙酯
有机溶剂介质体系类型： (1) 微水-有机溶剂单相体系 (2) 水-有机溶剂单相体系
(3) 水-有机溶剂双相体系
(4) 正胶束体系
(5) 反胶束体系
不管采用何种有机介质反应体系，酶催化反应的介质中都含 有机溶剂和一定量的水。它们都对催化反应有显著的影响。
(1) 微水-有机溶剂单相体系
又称微水介质体系、非极性有机溶剂-酶悬浮体系 有机溶剂(98%)： 烃、醚、芳香族、卤代烃 水(<2%)： 酶分子的结合水，维持酶催化活性 酶： 悬浮状态；不溶的固相酶，结晶/冻干 /沉淀状态；或吸附在固体载体表面 特征： 酶稳定性好，分散性差，催化效率低 适用于： 水解类酶，减少含水量利于合成反应
5.1.3 超临界流体介质体系：
a. 超临界流体（supercritical fluid, SCF）是指温度和压力 超过某物质临界点所形成的可压缩性高密度流体，介于气 液之间，如CO2, SO2, C2H4，CO2最常用，廉价无毒。 b. 具有高扩散系数、低黏度和低表面张力,使底物向酶的传 质速度加快，提高反应速度; c. 可以改变酶的特性，如底物专一性、区域选择性和对映体 选择性，增强酶的稳定性。 例：超临界 CO2 中南极假丝酵母脂肪酶催化葡萄糖酰化反应
离子液体介质中的酶催化 —— 反应实例
脂肪酶催化 1-苯乙醇（1-phenylethanol）外消旋体的拆分
在离子液体中 获得的产物 e.e. 值高于在 有机溶剂中的 值，但产率偏 低。
离子液体介质中的酶催化—— 期刊论文
离子液体介质中的酶催化 —— 期刊论文
5.2 有机介质中的酶催化
酶在有机溶剂中的存在形式
– X 射线晶体衍射结果证明，有机溶剂中酶的结构至 少是酶活性部位的结构与水溶液中的结构相同
– 电子顺磁共振（EPR）研究表明，固定化乙醇脱 氢酶在有机溶剂中保持其三维构象，酶在有机介 质中维持其天然构象并非必须固定化
– 固态 15N-NMR 技术探测到酶活性部位氢键网络的 存在，说明酶活性部位（His 残基）的微环境在水 中与在有机溶剂中相同 – 环境扫描电子显微镜（ESEM）直接观察不同环境 下枯草溶菌素的微观形态，发现酶活性部位不与 溶剂发生直接作用，不因溶剂的改变而发生明显 变化
Chapter 5 Enzyme Molecules Enzymatic catalysis in Non-aqueous system
酶的非水相催化
酶只在水溶液中发挥活性
有机溶剂是酶的变性剂
？
1966，Dostoli & Siegel
胰凝乳蛋白酶和辣根过氧化物 酶在有机溶剂中具有催化活性 1977， Klibanov 水/氯仿中脂肪酶催化N-乙酰-L-色氨酸酯 化，两相体系达100%，但水中收率极低 1984， Klibanov & Zaks，Science，224: 1249 微水介质下酶促合成酯、肽、手性醇等；酶不仅 在有机溶剂中保持稳定，且具有高催化转酯活性
离子液体介质中的酶催化 —— 反应实例
催化剂 离子液体种类 反应类型 对硝基苯酚磷酸酯水解 蛋白质复性 1,3-二氰基苯的生物转化 Aspartame（甜味剂） 合成 酮的还原 烯醇的动力学拆分 辅酶 NADH 再生 在超临界 CO2 中酯化 1辛醇 手性有机磷化合物拆分 发表 年份 1984 2000 2000 2000 2001 2001 2002 2002 2002 2002
5.2.1 酶在有机介质中的催化特性 5.2.2 有机介质中酶催化反应的类型
5.2.3 水对酶催化反应的影响
5.2.4 有机溶剂对酶催化反应的影响 5.2.5 有机介质中酶催化反应的条件及其控制
5.2.1 酶在有机介质中的催化特性
有机溶剂影响酶的表面结构、活性中心结合部位、底 物的存在状态（亲水/疏水），从而影响酶催化特性。
非水酶学 non-aqueous enzymology
非水酶学能做什么？
a. 研究非水介质中的酶结构与功能、酶作 用机制、酶作用动力学等； b. 研究酶催化的介质，开发非水介质和新 的酶促反应体系，发展出介质工程 （medium engineering）； c. 拓宽酶催化反应的应用范围，使酶法合 成与化学法合成相互补充。
补充：
最常见的是超临界二氧化碳， 其临界温度为31.06℃，临界压力 为7.38Mpa；超临界水的临界点为 374℃，22Mpa；超临界甲醇为 239℃，8.1MPa。 超临界二氧化碳可轻易穿过 细菌的细胞壁，在其内部引起剧 烈的氧化反应，杀死细菌。可用 于清洗各种精密仪器，亦可代替 干洗所用的氯氟碳化合物，以及 处理被污染的土壤。
作用力因素
酶分子“紧密”状态主要取决于蛋白质分子内氢键， 而溶液中水分子与蛋白质分子间形成的氢键一定程度破坏 蛋白质分子内氢键，蛋白结构变得松散，呈“开启”状态。
蛋白质分子内与分子间氢键的动态平衡Zaks et al, 1988
酶分子紧密和开启状态处于动态平衡，表现一定的柔性。
有机介质中的酶催化
5.1.1 有机溶剂介质体系：
a. 酶在含有一定量水的有机溶剂中进行催化反应的介质体系； b. 底物、产物两者或其中之一为疏水性物质； c. 酶在有机介质中能够基本保持其完整的结构和活性中心的 空间构象，发挥其催化功能； d. 酶的底物特异性、立体选择性、区域选择性、键选择性和 热稳定性等都有所改变。
固态酶：以固体形式存在于有机相中，包括冷冻干燥的酶 粉、固定化酶、结晶酶 可溶解酶：水溶性大分子共价修饰酶、非共价修饰的高分 子/酶复合物、表面活性剂/酶复合物、微乳液中的酶
为什结构的完整性，至少 酶活性部位与水溶液中的结构是相同的。 X-ray FT-IR ESEM EPR NMR 不同介质中酶活性中心的完整性相差不大，但酶 活力却相差4个数量级，因此认为酶分子结构的动态 变化很可能是主要因素。
Enzyme+water
Organic solvent
(2) 水-有机溶剂单相体系
又称与水溶性有机溶剂组成的均一体系 有机溶剂(10~20%，有时50~70%)： 强极性， DMSO、DMF、THF、 二噁烷、丙酮和低级醇等 水：水与极性有机溶剂可混溶 酶、底物、产物： 溶解于体系 特征： 易传质、反应效率高，对酶毒性大， 除枯草芽孢杆菌蛋白酶和某些脂肪酶 适用于： 水中溶解度低，反应慢的亲脂性底物 降低系统冰点，进行低温酶促反应
E. coli 碱性磷酸酯酶 [H3NEt][NO3] 鸡蛋清溶菌酶 红球菌 R312 完整细 胞 嗜热蛋白酶 面包酵母完整细胞 脂肪酶 [H3NEt][NO3] [BMIM][PF6] / buffer [BMIM][PF6] [BMIM][PF6] / buffer [BMIM][(CF3SO2)2N] [4-MBPy][BF4] [BMIM][(CF3SO2)2N] [BMIM][PF6]
--阴离子：
无机阴离子：BF4-、PF6-、SbF6-、NO3- 等 有机阴离子：CF3SO3-、(CF3SO3)2N-、ArSO3-、CF3CO2- 等
c. 挥发性低、稳定性好，不可燃，不氧化，低毒，环境友好 的绿色溶剂； d. 对无机/有机/高聚物的溶解性好，疏水、亲水性等溶剂特 性可调节； e. 酶在离子液体中具有良好稳定性、区域选择性、立体选择 性、化学键选择性等特点。
栗树精胺
Contents of chapter 5
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5.1、非水相酶催化的介质体系 5.2、有机介质中的酶催化 5.3、酶非水相催化的应用
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5.1 非水相酶催化的介质体系
非水相酶催化的介质体系
5.1.1 有机溶剂介质体系（重点） 5.1.2 气相介质体系
5.1.3 超临界流体介质体系
5.1.4 离子液体介质体系
解释：疏水性的相对强弱
• 不同的有机介质，酶的底物专一性也不一样
极性较弱
极性较强
N-乙酰-L-苯丙氨酸乙酯
N-乙酰-L-丝氨酸乙酯
• 极性较强的有机溶剂中，疏水性较强的底物易反应 • 极性较弱的有机溶剂中，疏水性较弱的底物易反应
– 酶在有机介质中的催化特性 —— 对映体选择性
• 对映体选择性（enantioselectivity）是酶在对称的外消 旋化合物中识别一种异构体的能力大小的指标。 • 立体选择系数（KLD）
Kcat / K m L K LD Kcat / K m D
– Km —— 米氏常数 – Kcat—— 酶的转换数 立体选择系数越偏离 1，酶催化的对映体选择性越强。
• 酶在水溶液中催化的对映体选择性较强，而在疏水性强 的有机介质中对映体选择性较差（为什么？）
N-乙酰丙氨酸氯乙酯
–可能因底物的两种对映体与酶分子结合方式不同，把 水分子从酶分子疏水结合位点臵换出来的能力不同。
5.1.4 离子液体介质体系：
a. 离子液体（ionic liquids）是由有机阳离子与有机（无机） 阴离子构成的，在室温条件下呈液态的低熔点盐类；
b. 离子液体熔点低的原因：其结构中某些取代基的不对称性 使离子不能规则地堆积成晶体所致；