基于“中药作用机理辅助解析系统”的四逆散抗抑郁作用机制研究

基于“中药作用机理辅助解析系统”的四逆散抗抑郁作用机制研究
四逆散作为调和肝脾的经典名方，临床上广泛用于治疗肝郁气滞引起的各种疾病，且疗效显著。

近年来发现四逆散在神经系统疾病治疗上有效，如抑郁症。

但是，目前四逆散抗抑郁症机制还不是很清楚，该文采用网络药理学方法和“中药作用机理辅助解析系统”研究四逆散方剂，探索其多成分多靶点抑郁症相互作用关系。

结果显示，四逆散的315个化学成分中有263个能够作用于抑郁症的19个靶点，通过调控第二信使G蛋白偶联受体转导通路、cAMP环核苷酸系统、神经系统及其递质、免疫炎症反应、神经内分泌、钙离子及其他离子转运等多途径、多靶点发挥抗抑郁作用。

这些结果为四逆散抗抑郁症的机制研究及探讨抑郁症治疗提供了有价值的线索。

标签：四逆散；网络药理学；实体语法系统；中药作用机理辅助解析系统；抗抑郁症
[Abstract]As regulating the function of the liver and spleen of the famous traditional formula，Sini San is widely used in the treatment of various diseases caused by liver depression and Qi stagnation，and its efficacy is significant clinically Recently it is discovered that Sini San is effective in the treatment of nervous system diseases such as depression Furthermore，there is a lot of literature about the effect of Sini San on the molecular mechanism of antidepressant However，the antidepression mechanism of Sini San is not very clear，in our present study，based on the auxiliary mechanism elucidation system for Chinese medicine and network pharmacology system to construct the chemical ingredients of the target interactions and diseaserelated protein of the interaction network Results show that there are 263 chemical ingredients and 19 corresponding targets of depression in Sini San network Sini San can antidepressant effect through Gprotein coupled receptor protein signaling pathway，cAMP system，neurological system process and neurotransmitter secretion，inflammatory response，neuroendocrine，metal ion transport and so on These studies provided valuable clues for the mechanism and treatment of antidepressant
[Key words]Sini San；network pharmacology；entity grammar system；auxiliary mechanism elucidation system for Chinese medicine；antidepressant
抑郁症（depression）是一种以行为上出现异常表现、显著而持久的心境低落为主要特征[1]的精神障碍性疾病，临床表现为情绪低落、兴趣减退、自我评价过低、对前途悲观失望、不愿主动与人交往等，已成为严重危害人类身心健康的一类疾病[2]。

随着生活节奏的加快，社会竞争激烈，其患抑郁症人数逐年攀升，据世界卫生组织统计，全球抑郁症的发生率约为31%。

在发达国家接近6%，目前已经成为世界第四大疾患，到2020年可能成为仅次于心脏病的第二大疾患[3]。

目前抑郁症患者的治疗以服用西药抗抑郁药物为主，但是药物起效慢，易产生毒副作用，而且易出现反复现象难以根本治愈等缺陷。

因此，考虑到中医药
自身的优点，通过研究中医药来开发出治疗抑郁症的药物将具有更广阔的市场。

四逆散作为传统经典名方，源于张仲景的《伤寒论》，始于主治阳郁厥逆证，后世在此方基础上加减将其应用于治疗肝郁气滞引起的各种疾病。

近年来，临床医师广泛以此方为基础加减后用于治疗抑郁症，并取得较好的临床疗效。

如党中勤等[4]用加味四逆散治疗功能性消化不良伴抑郁症40例，中药治疗组较对照组取得了明显的临床疗效，且能够有效降低汉密尔顿抑郁量表评分和治疗患者功能性消化不良，不良反应少，显示出中医药整体系统治疗疾病的优势。

为了弄清四逆散发挥药效的物质基础及治病机制，很多研究者尝试利用现代医学从分子、细胞、组织等不同层面的水平上阐释其作用机制，并对其进行了大量的药效学、药动学、药代学等实验，取得一系列成果。

吴丽丽等[5]研究加味四逆散对慢性心理应激抑郁症大鼠海马损伤的保护作用；李越兰等[6]研究柴胡白芍水煎剂对行为绝望抑郁模型小鼠的影响；畅洪昇等[7]研究四逆散有效部位对小鼠行为绝望和药物抑郁模型的作用；四逆散含药血清体外对海马神经元发生的影响[8]等。

但是由于目前中医药研究领域较零散，缺乏系统，难以自成体系，导致人们无法将它们系统地整合在一起以较为全面地理解中药治病的作用机制。

因此，如何有机地组织整合目前已有的中药研究中的海量数据，整体系统地阐释中药的作用机制，已成为制约中药发展的瓶颈。

近年来，随着现代医学的快速发展，系统生物学、多向药理学、网络分析等兴起，随之网络药理学（network pharmacology）概念应运而生。

鉴于中药或方剂多成分、多靶点、多途径治疗多种疾病的特点和网络药理学具有的整体性、系统性特点，有不少研究报道将网络药理学方法应用于中药研究中。

吴磊宏等[9]以常用中药附子为例，预测其化学成分的作用靶点及网络药理学研究；李健等[10]提出应用网络药理学的技术方法研究类风湿关节炎寒、热证相关疾病网络特点及寒性、热性方剂作用原理的策略；有研究者采用网络药理学方法来预测加减后的四妙丸活性成分及阐释其组方的合理性[11]等。

在大量研究的基础上，本研究采用“中药作用机理辅助解析系统”研究四逆散抗抑郁的作用机制，以期为进一步挖掘四逆散深层次药用价值和开发抗抑郁药物提供一定的研究基础。

1数据与方法
1.1四逆散化学成分及其化学成分潜在靶点以“中药作用机理辅助解析系统”中中药化学成分及其作用靶点数据为基础，整理四逆散相关数据。

其中，柴胡含有88个化学成分，白芍45个化学成分，枳实25个化学成分，甘草163个化学成分。

柴胡中88个化学成分得到相关靶点840个；白芍中45个化学成分得到430个靶点；枳实中25个化学成分得到210个靶点；甘草中163个化学成分得到1 420个靶点。

1.2抑郁症疾病相关靶点抑郁症疾病相关靶点来源于TTD[Therapeutic Targets Database（疾病治疗靶点数据库），http：//xincz3nusedusg/group/cjttd/ttdasp]数据库，共35个相关靶点。

1.3基于中药语法系统（directed TCM grammar systems，dTGS）的靶点关系网络构建实体语法系统（entity grammar systems，EGS）是针对生物复杂系统建
模所建立的一种形式语法系统[12]。

考虑到其处理复杂问题的优势，并有相关文献报道用于中药复方机制的阐释[13]。

本研究也将采用实体语法系统推理规则构建中药方剂化学成分靶点疾病关系网络。

EGS用G表示，由5个基本元素组成，G=（VN，VT，F，P，S），其中VN∪VT=V，VN表示非末端字符集，VT表示末端字符集，VN∩VT=Φ，F表示基本元素之间的结构关系，P代表由已知实体产生新实体的推理规则，S表示系统初始状态，即推理的起点。

在本研究中集合V包括不同的节点类型（化学成分、化学成分对应靶点、蛋白、疾病相关靶点等），集合F包含网络中不同的节点关系类型，集合P包含的规则用于节点间关系的推断。

具体推理规则详见参见文献[1415]。

其中在背景网络用到的人体蛋白质蛋白质相互作用关系数据来源于string数据库（http：//stringdborg），把数据整理成合适的形式。

将所得的结果用Cytoscape 可视化和分析。

Cytoscape（http：//wwwcytoscapeorg/）是一个免费开源软件，已广泛用于复杂网络可视化、网络分析等。

2结果与分析
2.1四逆散复方化学成分与抑郁症相关靶点作用关系的分子网络依据中药化学成分及其靶点数据库，生物学蛋白相互作用通路数据库，和目前已明确发现或治疗抑郁症靶点数据，利用网络药理学和中药实体语法系统方法，构建了四逆散复方主要化学成分靶点疾病相互作用关系网络，结果见图1。

图1中不同的形状表示不同的节点类型，其中平行四边形节点代表柴胡、白芍、枳实、甘草4种中药，内层圆形节点代表化学成分，外层圆形节点代表细胞信号转导通路中的蛋白，三角形节点代表化学成分的靶点，菱形节点代表疾病作用的靶点，正方形代表疾病。

其中紫色边代表正向调节作用，黄色的边代表负向调节作用，第3种颜色的边代表作用方向不确定。

图1中含有263个化学成分，370个蛋白。

其中化学成分作用的靶点66个，相关蛋白295个，疾病作用的靶点19个。

图1中不涉及蛋白相关的细胞信号转导通路。

2.2四逆散复方作用于抑郁症网络中的化学成分本文辨识出四逆散复方中4味中药中263个化学成分，这些成分直接或间接地作用于抑郁症疾病相关靶点，进而发挥对抑郁症的改善作用。

这263个化学成分中柴胡有81个，白芍有32个，枳实有18个，甘草有137个，其中有5个化学成分是重复的。

在四逆散复方4种中药所含主要化学成分315个，识别出263个与抑郁症相关的化合物。

这在一定程度上说明四逆散复方治疗抑郁症的内在物质基础，其结果为提取分离四逆散复方中具有抗抑郁作用的有效化学成分提供了有价值的线索。

2.3四逆散抗抑郁症的作用途径分析由图1可知，识别出19个抑郁症疾病靶点，具体见表1。

其中263个化学成分的66个靶点中有10个靶点也是抑郁症的直接靶点，分别是β2肾上腺素能受体（beta2 adrenergic receptor）、5羟色胺受体1A（5hydroxytryptamine receptor 1A）、5羟色胺受体2A（5hydroxytryptamine receptor 2A）、5羟色胺受体2C（5hydroxytryptamine receptor 2C）、多巴胺受体D2（dopamine D2 receptor）、组胺H1受体（histamine H1 receptor）、物质P受体
（substanceP receptor）、γ氨基丁酸受体α1亚型（gammaaminobutyric acid receptor subunit alpha1）、钠依赖性去甲肾上腺素转运（sodiumdependent noradrenaline transporter）、钠依赖性5羟色胺转运体（sodiumdependent serotonin transporter），这也说明某些化学成分可以通过这些靶点对抑郁症疾病进行直接干预治疗。

另外，其余化学成分靶点是通过多条蛋白（295个蛋白）作用于19个抑郁症靶点，表明四逆散是通过多种化学成分经过多种途径作用于抑郁症靶点。

为了较全面解析网络中四逆散复方抗抑郁症的作用途径，对结果进一步进行分类分析。

结果表明，四逆散多靶点、多途径治疗抑郁症，主要体现为5个方面。

介导第二信使的信号转导作用：G蛋白偶联受体（GRM5，MCHR1，MAPK3，CXCR4，GRM3，ADRB1，ADRB2，HRH1，GABRA1，HTR1A，GRM2，ADORA2A，DRD2，TACR1，HTR2C，HTR2A等）蛋白信号转导通路，通过G蛋白偶联受体蛋白（GRM5，HRH1，DRD2，TACR1，HTR2C，HTR2A）信号通路耦合到第二信使IP3激活磷脂酶C（phospholipase C）活性，通过G蛋白（MCHR1，DRB2，HTR1A，ADORA2A，DRD2）信号转导激活、抑制腺苷酸环化酶（adenylate cyclase，AC）活性，进一步产生第二信使cAMP核苷酸和环核苷酸。

研究表明G蛋白与抑郁症的病理有密切关系[16]。

G蛋白是在细胞内信号传导途径中起着重要作用的GTP结合蛋白，刺激性G蛋白（Gs）和抑制性G蛋白（Gi）分别激活、抑制腺苷酸环化酶（AC），通过“受体（如ADRB2）G蛋白AC环磷酸腺苷（cAMP）”途径转导信号，在cAMP系统中起作用[1718]；此外认为cAMP系统功能减退导致抑郁，反之则躁狂。

结果表明MCHR1，ADRB2，GRM3，GRM2，HTR1A，ADORA2A，DRD2等蛋白能调节腺苷酸环化酶（AC）、环化酶、环核苷酸、核苷酸等活性，调控cAMP生物合成、代谢过程，环状核苷酸和cAMP 介导通路等途径，而GRM5，HRH1，DRD2，TACR1，HTR2C，HTR2A等蛋白能调节磷脂酶（phospholipase，PLC，DUSP1，PTP1B）、蛋白激酶（PKC，MAPK3，SGK，PIM1，ERBB2，AMPK2，SRC，MTOR）、脂肪酶（LPL）、裂解酶、水解酶（lactasephlorizin hydrolase，C9orf115）、磷脂酰肌醇（phosphatidylinositol，PTEN）介导的信号转导等途径。

Gp，Go分别促进、抑制磷脂酰肌醇（PT）的水解，经“受体G蛋白磷酸脂肪酶C（PLC）蛋白激酶C（PKC）（或离子通道）”途径转导信号，在PT系统中发挥作用[17]。

大量研究表明cAMP通路系统在情绪调节中起重要作用，研究清楚的一个通路是AC活化催化ATP生成cAMPPKA 激活CREB磷酸化调节基因转录发挥生物学效[17]。

严灿等[19]实验观察到，加味四逆散（JWSNS）可明显降低慢性心理应激反应大鼠下丘脑cAMP，cGMP含量，说明，JWSNS可通过影响环核苷酸系统参与对慢性心理应激反应的调控。

调节神经系统、突触传递，神经冲动的传递、神经递质分泌及转运，调节γ氨基丁酸（GABA）及GABA受体（GABRE，GABRA1，GABRA2，GABRA3，GABRA4，GABRA5，GABRA6，GABRB1，GABRB2，GABRB3等），动物实验表明抑郁大鼠海马GABA受体表达量下降，而GABA受体的激动或拮抗剂往往可能成为神经、精神类治疗药物[2021]；调节谷氨酸（Glu）和其受体NMDAR （GluR1，GluR2，GluN2B，GluN3A，mGluR2，mGluR3，mGluR5）及EAA3；调节乙酰胆碱（ACh）及其受体（CHRNA2，CHRNA7，CHRM1，CHRM2，CHRM3，CHRM4）、5羟色胺及其受体（HTR1A，HTR1B，HTR2A，HTR2C）、多巴胺及其受体（DRD2，DRD4）；影响脑皮层及海马内的脑源性神经生长因子（BDNF）
及酪氨酸激酶B（TrkB）、神经生长因子（NGF）、胶质原纤维酸性蛋白（GFAP）、成纤维细胞生长因子（FGF）的表达，进一步保护受损神经元，从而达到改善神经损伤和抗抑郁的作用。

现脑内已经发现约50余种类似神经递质的化合物，其中，与抑郁症相关的神经递质有乙酰胆碱（Ach），去甲肾上腺素（NE），肾上腺素（A），多巴胺（DA），5羟色胺（5HT），谷氨酸（Glu），γ氨基丁酸（GABA）等[22]。

NMDAR（谷氨酸受体）拮抗剂CGP（一种竞争性的NMDAR受体拮抗剂）可以减少大鼠游泳不动时间，产生抗抑郁作用[23]。

加味四逆散能降低海马NMDA受体通道开放概率，对抗此受体介导的高浓度Glu兴奋性毒性引起海马损伤的作用[24]。

四逆散可提高慢性应激抑郁模型大鼠下丘脑中神经递质（NE，5HT，DA）的含量[25]。

也有研究表明5HT受体功能不平衡会导致抑郁症的发生。

四逆散活性成分能显著升高慢性应激所造成的抑郁症模型大鼠海马5HT1A 受体mRNA表达数量，对皮层的5HT1A受体mRNA表达数量也有升高[26]。

脑影像学和尸检研究的资料表明，抑郁症患者边缘系统部分脑区结构改变、功能受损，临床和动物研究，抑郁症与脑内神经元的萎缩和神经细胞的缺失有关，尤其是海马以及前额叶皮质中的神经元。

文献报道[27]，抑郁症的一个重要的变化就是神经营养因子NTF[包括神经生长因子（NGF）、脑源性神经营养因子（BDNF）、神经营养素3（NT3）等]表达减少以及其活性降低，使用抗抑郁药物逆转这一变化将会对抑郁症的症状起到缓解的作用。

大量实验表明，四逆散具有多途径保护海马神经元的作用。

四逆散高、低剂量组可以显著增加大鼠海马BDNF及其TrKB 阳性神经元面密度值，推测四逆散可能是影响海马BDNF，TrKB的表达，实现改善抑郁模型大鼠的抑郁状态[28]。

对免疫炎症反应的调控，激活白细胞，进而影响IL（IL1A，IL1B，IL2，IL3，IL4，IL6，IL5，IL8，IL10，IL15，IL18等），IFN（IFNG，IRF1），TNF（TNFSF2，TNFSF11，TNFRSF5，TNFRSF6，TNFRSF13C）等细胞因子分泌，间接地调节机体的免疫力。

从心理神经免疫学角度来看，慢性应激是导致抑郁症的主要原因，精神活动能调节免疫功能，而免疫功能紊乱又会导致机体疾病、心理、行为、性格改变，抑郁症患者存在广泛的免疫异常[27]。

尸检报告显示，未经治疗的抑郁症患者前额叶脑组织ILl，IL2，IL3，IL5，IL8，IL9，IL12A，IL13，IL15，IL18，IL10，IFNγ和TNFα表达增加[29]。

研究发现应激大鼠血清ILlβ水平显著升高，经四逆散给药后，急性心理应激后大鼠血清ILlβ降低[30]。

调控细胞内钙离子稳态，包括对钙浓度、转运的调节，并影响钙蛋白（CDH1，FAT2，CALM1）的表达及其他金属离子稳态、转运、离子的跨膜转运蛋白的调控；而钙离子的大量内流与Glu的大量释放有关，最终造成神经元的变性、死亡[31]。

影响中枢促肾上腺皮质素释放激素（corticotropinreleasing hormone，CRH）、促肾上腺皮质激素（adrenocorticotropic hormone，ACTH）的分泌、释放，进一步影响皮质醇（CORT）含量，作用于α肾上腺素能受体和β肾上腺素能受体，影响去甲肾上腺素和肾上腺素分泌、释放，从而调节下丘脑垂体肾上腺轴（HPA axis）的功能。

神经生物学研究结果表明，下丘脑垂体肾上腺皮质轴（HPA）的失调是抑郁症患者最突出的病理之一，并发现糖皮质激素受体调节的负反馈受到阻碍、肾上腺对循环的ACTH具有高反应性、促肾上腺皮质素释放因子的分泌过多、垂体中释放ACTH对下丘脑会起到活化作用[32]。

抑郁症患者HPA轴功能处于激活状态，表现为促肾上腺皮质激素释放激素（CRH）、促肾上腺皮质激
素（ACTH）以及皮质醇（CORT）的大量合成和分泌。

梁尚华等[33]研究表明四逆散能改善慢性应激大鼠行为表现，降低大鼠血浆ACTH，下丘脑CRH，血浆CORT的含量以及下丘脑CRH mRNA和垂体ACTH mRNA的过度表达，最终逆转HPA轴回复正常。

实验表明[28]四逆散高、低剂量组可以显著降低抑郁症模型大鼠血浆ACTH，CORT下丘脑的CRH含量。

此外，作用于糖皮质激素（glucocorticoid）受体、盐皮质激素受体，对糖皮质激素、生长激素释放素（somatoliberin）、甲状旁腺激素（parathyroid hormone）、甲状腺激素（thyroid hormone）等相关激素分泌的调控，这些还有待进一步研究。

总之，四逆散可通过调节神经内分泌来改善抑郁症。

此外，还有其他一些途径，如调控其他细胞信号转导（信号传导因子SOCS1，SOCS2，SOCS3，SOCS6，STAT3，STAT1，STAT5A）、离子跨膜转运及转运蛋白活性、细胞死亡、生长因子（TGFB1，EGR1，CTGF，TGFA，TGFBI，EGF，EGFR，IGF1，HGF）、各种酶，对外部刺激反应和防御反应、摄食、运动、行为的调节作用，从而使抑郁症的病理状态恢复正常。

3讨论
四逆散在临床应用历史悠久，本研究基于“中药作用机理辅助解析系统”对四逆散抗抑郁作用机制进行了较为全面的研究。

由上述结果可知，四逆散可通过调节第二信使尤其是cAMP环核苷酸系统、神经系统及其递质、免疫炎症反应、神经内分泌、钙离子及其他离子转运等途径来发挥抗抑郁作用。

在四逆散复方中的315个主要化学成分中，识别出263个与抑郁症相关的化合物。

大多数成分都出现在此网络中，说明四逆散作用于抑郁症靶点的物质基础广泛。

对于这些化学成分，本文并未进行活性成分筛选。

但为后续做进一步的四逆散抗抑郁症的活性成分研究，有效成分的提取分离，抗抑郁药物的发现提供了有价值的线索。

目前关于抑郁症发病机制普遍被接受的有神经递质假说、受体假说、免疫功能紊乱、兴奋性氨基酸及内分泌激素假说、神经元损伤假说、细胞分子机制假说等[22，34]。

很多中医药研究者针对上述抑郁症发病机制，研究中药方剂抗抑郁的作用机制。

尽管有不少文献报道四逆散抗抑郁机制，但是这些研究大多数是基于传统方法，即是针对某些靶点进行研究，停留在某一或某些层次、靶点、环节。

而本研究利用网络药理学方法和实体语法系统方法，在已有的数据基础上，构建了四逆散“化学成分靶点生物过程疾病”网络，不但包含了四逆散直接作用的蛋白，还研究了四逆散通过生物效应传递对抑郁症可能产生的治疗作用。

通过与相关文献结合论证，一定程度上说明本文网络构建的合理性。

本研究实现了在大量的研究、实验数据的基础上，方便快速、全面有效地解析中药复方治疗疾病的分子作用机制。

但是，由于受数据库收录数据的差异性、全面性限制，使得对有些途径、靶点如生长因子、各种酶的调节、细胞信号传导通路等的解析还不是很清楚，还有待进一步实验证实。

但是，随着未来相关研究的深入发展，相关数据库的完善，那么对中药复方机制阐述将更加全面系统。

4小结
由于抑郁症疾病的病理和发病机制的复杂性，目前并没有很好的治疗抑郁症的药物。

于是人们把焦点集中于中药研究，希望寻找到治疗抑郁症的中药。

临床实践证实四逆散治疗抑郁症有效。

本文利用网络药理学和实体语法系统方法，在现有大量实验研究数据的基础上较全面阐述了四逆散复方治疗抑郁症的分子作用机制，为四逆散抗抑郁作用机制研究，及延伸到其他抗抑郁症的中药方剂研究提供了依据。

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