裙带菜多糖的碱提取工艺研究

收稿日期：2020-04-27
基金项目：通化师范学院基金项目（201847）.
作者简介：车环宇，吉林通化人，通化师范学院医药学院讲师；郝鑫龙，通化师范学院医药学院（吉林通化134002）.
2020年第12期
第41卷总第309
期
学报
裙带菜多糖的碱提取工艺研究
车环宇，郝鑫龙
摘要：论文主要运用紫外可见分光光度法，以裙带菜中有效成分褐藻胶含量为指标，对提取温
度、提取时间和料液比三个不同因素进行考察，确定裙带菜多糖的最佳提取工艺.根据极差分析R 值可知，各因素影响多糖得率效果的主次顺序为提取温度＞提取时间＞料液比，通过方差分析验证提取温度为显著性因素.故确定裙带菜多糖的最佳提取工艺条件为提取时间8h ，提取温度70℃，料液比1∶60.通过方法学考察可知，本实验所采用的裙带菜多糖含量测定方法稳定可靠，具有较好的精确度、稳定性、重现性和准确性，可用于裙带菜多糖提取的含量测定.
关键词：裙带菜；褐藻胶；正交试验；含量测定中图分类号：R284
文献标志码：A
文章编号：1008-7974（2020）12-0052-05
DOI ：10.13877/22-1284.2020.12.011
裙带菜（Undaria pinnatifida ，Wakame ），褐藻门、褐子纲、海带目、翅藻科、裙带菜属［1］.近年的研究表明，裙带菜多糖在抗肿瘤、抗病毒、抗凝血、促进免疫等方面显示出独特的生物活性，其研究越来越受到人们的关注［2］.常用的裙带菜多糖提取方法有复合酶解法、热水浸提法、超声波提取法和碱提取法［3］.本实验采用碱提取法提取裙带菜多糖，并利用紫外可见分光光度法进行定性定量分析，这种方法简便，易于操作，且回收方便，回收率较高，在普通的实验室就可进行.测定结果可靠稳定.本实验以裙带菜为原料，对碱提取法的
工艺进行了研究，为今后深入研究奠定了初步的基础.
1
仪器与试药
1.1
仪器
紫外-可见分光光度计：UV-2102C 型，上
海尤尼柯仪器有限责任公司；电子天平：AY120型，日本岛津公司；电子恒温水浴锅：HH-2型，天津市泰斯特仪器有限公司；循环水式多用真空泵：SHB-B95型，郑州长城科工贸有限公司；电热鼓风干燥箱：101-1AB 型，天津市泰斯特仪器有限公司；量筒、试管、烧杯、
车环宇，等：裙带菜多糖的碱提取工艺研究
漏斗、滤纸、玻璃棒、布氏漏斗、容量瓶、移液管、铁架台（铁环和铁夹）、胶头滴管、滤纸. 1.2试药
裙带菜干粉购自大连；无水葡萄糖（天津市天达净化材料精细化工厂）；无水碳酸钠（上海化学试剂有限公司）；95%乙醇（天津化学试剂有限公司）；苯酚（中国上海试剂总厂）；浓硫酸（哈尔滨市化工试剂厂）；稀盐酸（哈尔滨新春化工产品有限公司）；蒸馏水.
2实验方法
2.1碱提取裙带菜中多糖的工艺研究
（1）碱提取工艺.取裙带菜干粉，按一定料液比加入1%Na2CO3溶液，恒温水浴提取，3000r/min离心10min，取上清液，加稀盐酸
搅拌至pH2.0，析出凝胶，用95%乙醇洗涤脱水，得棕色粉末，干燥至恒重，精密称重，计算得率.
（2）单因素试验和正交试验.温度选用50℃、60℃、70℃、80℃、90℃五个水平；提取时间选用2h、4h、6h、8h、10h五个水平；料液比选用1∶30、1∶40、1∶50、1∶60、1∶70五个水平.根据单因素试验结果，采用L9（34）设计正交试验，筛选最佳提取工艺.
（3）多糖含量测定.①制备标准曲线.精密称取约105℃干燥至恒重的无水葡萄糖100.0mg，置于100mL容量瓶中加蒸馏水溶解并定容，摇匀，获得对照品溶液备用.分别吸取上述溶液1mL、2mL、3mL、4mL、5mL、6mL，置于100mL容量瓶加蒸馏水定容，得0.01mg/mL、0.02mg/mL、0.03mg/mL、0.04mg/mL、0.05mg/mL、0.06mg/mL的6个不同浓度的对照品溶液.精密吸取上述溶液各1mL置于10mL的试管中，用蒸馏水分别补至2mL，加入苯酚1mL混匀，再迅速滴加5mL浓硫酸，混匀，置于50℃水浴中30min，取出放置室温，以蒸馏水同法操作为空白，在489nm处测定吸收度.②样品溶液的制备.取粗多糖干品100.0mg，用蒸馏水定容于100mL容量瓶，从中吸取10mL于50mL的容量瓶中定容.③裙带菜多糖得率测定.吸取1mL裙带菜多糖水溶液于试管中，按标准曲线制备步骤操作，测其吸光度，以标准曲线计算多糖含量.
2.2实验结果计算
多糖含量计算公式为：w=cFV/m×100%，式中：w为多糖样品含量，%；c为溶液浓度，μg/mL；F为溶液的稀释倍数；V为溶液体积，mL；m为称取的样品质量，mg.
（1）标准曲线的制备.以吸光度（A）为纵坐标，标准品浓度（C）为横坐标，得标准曲线.经回归处理的线性回归方程：Y=2.7858X+ 0.1262，R2=0.9947，X为在Y吸光度下根据回归方程计算所得的值.结果见图
1.
图1标准曲线
（2）单因素试验.①提取温度对多糖提取率的影响.保持提取时间2h，料液比1∶60，Na2CO3溶液浓度1%，提取温度分别为50℃、60℃、70℃、80℃、90℃条件下提取裙带菜多糖.②提取时间对多糖提取率的影响.保持提取温度60℃，料液比1∶60，Na2CO3溶液浓度1%，提取时间分别为2h、4h、6h、8h、10h条件下提取裙带菜多糖.③料液比对多糖提取率的影响.保持提取温度60℃，提取时间2h，Na2CO3溶液浓度1%，料液比分别为1∶30、1∶40、
2020年
第12
期
学报
1∶50、1∶60、1∶70条件下提取裙带菜多糖.
（3）碱提取裙带菜多糖的正交试验.根据
单因素实验，用L9（34）正交实验考察提取时间、提取温度和料液比对褐藻酸提取率的影响.2.3
实验方法学考察
（1）精密度试验.精密称取适量裙带菜多糖，用蒸馏水定容，按照操作步骤测定5次.
（2）稳定性试验.取样品溶液，分别在0h 、0.5h 、1h 、1.5h 、2h 内对其吸光度进行测定.（3）重复性试验.取相同质量裙带菜粉末
5份，按样品含量测定方法进行测定.
（4）回收率试验.精密称取裙带菜多糖样
品，共5份，每份1mg ，分别加入无水葡萄糖1mg ，按样品的含量测定方法进行测定.
3
实验结果
3.1
单因素试验
（1）提取温度对多糖提取率的影响.保持
提取时间2h ，料液比1∶60，Na 2CO 3溶液浓度1%，提取温度分别为50℃、60℃、70℃、80℃、
90℃条件下提取裙带菜多糖，结果见表1.
表1
提取温度对多糖提取率的影响
提取温度/℃提取率/%
50
5.7160
6.9670
7.3280
6.4390
6.07
从表1可以看出，当提取温度达到70℃时得率达到最高值，超过70℃提取率下降.因此选择温度60℃、70℃、80℃三个水平进行正交试验.
（2）提取时间对多糖提取率的影响.保持提取温度60℃，料液比1∶60，Na 2CO 3溶液浓度1%，提取时间分别为2h 、4h 、6h 、8h 、10h
条件下提取裙带菜多糖，结果见表2.
表2
提取时间对多糖提取率的影响
提取时间/h 提取率/%
2
4.454
5.896
7.148
8.2210
7.86
从表2可以看出，提取时间为8h 时，多糖得率最高，此后下降.因此选择提取时间6h 、8h 、10h 三个水平进行正交试验.
（3）料液比对多糖提取率的影响.保持提
取温度60℃，提取时间2h ，Na 2CO 3溶液浓度1%，料液比分别为1∶30、1∶40、1∶50、1∶60、1∶70
条件下提取裙带菜多糖，结果见表3.
表3
料液比对多糖提取率的影响料液比提取率/%
1∶303.55
1∶406.43
1∶506.78
1∶605.89
1∶705.68
由表3可以看出，随着提取溶剂的增加，裙带菜多糖提取率先升后降，料液比为1∶50时得率最高.因此，选择料液比1∶40、1∶50、1∶60三个水平进行正交试验.3.2
碱提取裙带菜多糖的正交试验
根据单因素实验，用L9（34）正交实验考察提取时间、提取温度和料液比对褐藻酸提取率的影响.因素水平设置见表4，正交实验结果见表5，方差分析见表6.
表4
因素水平表编号123
提取时间A/h
68
10
提取温度B/℃
607080
料液比C 1∶401∶501∶60
表5
正交试验结果
编号123456789
K1
K2K3R
A 11122233331.6635.3532.553.69
B 123123123
35.9736.1327.468.67C 123312231
33.4432.6533.470.82多糖得率/%10.7311.359.58
12.8013.698.8612.4411.099.02
车环宇，等：裙带菜多糖的碱提取工艺研究表6方差分析表
方差来源A B C 误差离差平方和
2.472
16.402
0.144
3.238
自由度
2
2
2
2
均方
1.236
8.201
0.072
1.619
F值
0.763
5.065
0.045
显著性
不显著
不显著
不显著
由正交试验表可知，A2B2C3为提取裙带菜多糖的最佳工艺组合，即提取温度70℃，提取时间8h，料液比1∶60.极差分析R值表明，各因素影响裙带菜多糖得率效果的主次顺序为提取温度＞提取时间＞料液比，提取温度对多糖得率的影响最大.
3.3实验方法学考察
（1）精密度试验.精密称取适量裙带菜多糖，用蒸馏水定容，按照操作步骤测定5次，测定结果的RSD为0.20%，说明该方法的精密度较高.结果见表7.
表7精密度试验考察结果
编号1 2 3 4 5吸光度
0.202
0.204
0.203
0.201
0.202
样品含量/%
13.60
13.96
13.78
13.43
13.60
平均含量/%
13.67
RSD/%
0.20
（2）稳定性试验.取样品溶液，分别在0h、0.5h、1h、1.5h、2h内对其吸光度进行测定，测定结果的RSD达到0.45%，表明裙带菜多糖的水溶液至少在2h内稳定.结果见表8.
表8稳定性试验考察结果
放置时间/h 0 0.5 1 1.5 2吸光度
0.203
0.203
0.202
0.200
0.197
样品含量/%
13.78
13.78
13.60
13.25
12.71
RSD/%
0.45
（3）重复性试验.取相同质量的裙带菜粉末5份，按样品含量测定方法进行测定，测定结果的RSD达到0.50%，表明实验的重复性较好.结果见表9.
表9重复性试验考察结果
编号
1
2
3
4
5
吸光度
0.201
0.199
0.203
0.204
0.206
样品含量/%
13.43
13.01
13.78
13.96
14.32
RSD/%
0.50
（4）回收率试验.精密称取裙带菜多糖样品5份，每份1mg，分别加入无水葡萄糖1mg，按样品的含量测定方法进行测定，平均回收率为99.2%.结果见表10.
表10回收率试验考察结果
编号
1
2
3
4
5
样品量
/mg
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
标准品量
/mg
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
测得量
/mg
2.03
2.06
1.97
2.01
1.89
平均回
收率/%
99.2
RSD/%
0.07
4讨论与结论
4.1讨论
本实验所用的仪器、试验方法以及结果和以往裙带菜多糖的提取相比较，能节省时间，有效提升提取率，实验过程顺利，测定结果可靠稳定，为今后深入研究奠定了基础.但是在对提取物进行离心时发现，由于裙带菜经过水浴加热后过于粘稠，无法顺利得到上清液，沉淀部分仍有可分离的提取溶液，容易造成浪费.因此，在以后的相关实验中，应考虑采用何种方法能够降低裙带菜多糖提取溶液的粘度，以便在大规模工业化生产中能够最大限度地利用裙带菜原料提取多糖.在制备标准品溶液和样品含量测定时，需用到苯酚溶液和浓硫酸溶液.由于苯酚极易被氧化，
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因此需现配现用.如果苯酚晶体已接触空气，须重蒸苯酚，得到182℃的馏分，再配成6%的溶液.苯酚-硫酸法显色后要尽快测定，以免长时间放置，吸光度有所变化，影响实验结果.4.2
结论
本实验使用紫外分光光度法对裙带菜中褐藻胶进行定性定量分析，最大吸收波长为489nm.不同提取条件下提取出来的裙带菜多糖含量相差较大.本文探讨了与碱提取法作用相关的提取时间、提取温度和料液比因素对多糖提取率的影响，同时采用正交试验确立最佳条件.正交优化条件为：在提取时间为8h 、提取温度为70℃、料液比为1∶60的条件
下，所提取的裙带菜多糖含量最高.碱提取裙带菜多糖的方法简便，易于操作，是今后常用的裙带菜多糖提取方法之一.通过方法学考察可知，本实验所采用的方法稳定可靠，具有较好的精确度、稳定性、重现性和准确性，可用于裙带菜多糖提取的含量测定.
参考文献：
［1］李兴霞.裙带菜海绵蛋糕加工工艺研究［J ］.中国果蔬，2020（2）：16-21.
［2］毕秋芸.裙带菜多肽的制备及其抗氧化活性的研究［J ］.中国调味品，2019（5）：104-110.
［3］冯建岭，刘海燕，王丽丽，等.裙带菜蛋白的提取工艺研究［J ］.食品研究与开发，2016（19）：51-54.
（责任编辑：王海波）
Alkali Extraction Process of Undaria Pinnatifida Polysaccharide
CHE Huan-yu ，HAO Xin-long
（Tonghua Normal University ，Tonghua 134002，China ）
Abstract ：In this thesis ，the use of ultraviolet and visible spectrophotometry to the active ingredient in seaweed alginate content index ，extraction temperature ，extraction time and solid to liquid ratio of three different factors were investigated to determine the best seaweed polysaccharide extraction.Known under the range of Rvalues ，the factors affecting the yield of polysaccharide primary and secondary order effect of extraction temperature>extraction time>liquid ratio ，extraction temperature verified by analysis of vari⁃ance as a significant factor.Therefore ，to determine the best seaweed polysaccharide extraction conditions for the extraction time 8h ，extraction temperature 70℃，liquid ratio 1∶60.Through the research method⁃ology ，it is known that the determination method of seaweed polysaccharides used in this study is stable and reliable ，has good accuracy ，stability ，reproducibility and accuracy ，can be used for the wakame deter⁃mination of polysaccharides.
Keywords ：undaria ；alginate ；orthogonal experiment design ；content。