急性肺损伤对大鼠脾脏SOD 、MDA、一氧化氮及结构的影响

急性肺损伤对大鼠脾脏SOD 、MDA、一氧化氮及结构的影
响
李秀娟;张志强;克拉拉·阿巴斯;马琪;张建龙;王红梅
【摘要】目的:研究急性肺损伤(acute lung injury,ALI)对大鼠脾脏的丙二醛(malondialdehyde,MDA)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutases, SOD)、一氧化氮(nitrogen monoxidum,NO)及结构的影响.方法:16只Wister大鼠随机分
为对照组(C组)和油酸组(OA组),后者由尾静脉注射油酸法复制ALI模型2 h后,测定血气(pH、PaO2、MAP、PaCO2)、肺的湿/干重(W/D)及血浆和脾脏匀浆SOD、MDA、 NO.脾脏组织做光、电镜检查.结果:与C组相比,OA组PaO2、MAP降低(P＜0.01);血浆和脾脏的SOD活性降低(P＜0.01),MDA和NO含量增高(P＜0.01);光镜下OA组脾脏被膜增厚,鞘淋巴细胞增生,灶状中性白细胞浸润,生发中心异常和红髓吞噬含铁血红素细胞增多改变;电镜下细胞肿大, 核膜皱缩,核大畸形,线粒体水肿,空泡变和粗面内质网扩张改变,排列紊乱.结论:ALI可引起大鼠脾脏SOD 、MDA、NO及结构的改变, 氧化应激反应导致脂质过氧化损伤可能是ALI 时远隔器官受损
的原因之一.
【期刊名称】《新疆医科大学学报》
【年(卷),期】2007(030)009
【总页数】4页(P961-964)
【关键词】ALI;脾脏;大鼠;氧化应激;结构
【作者】李秀娟;张志强;克拉拉·阿巴斯;马琪;张建龙;王红梅
【作者单位】无
【正文语种】中文
【中图分类】R563;R-332;R33
当机体遭受强烈的侵袭时立即产生复杂的防御对抗，宿主免疫系统发生应激反应，免疫系统的内在和谐性被破坏，引发全身炎症反应综合征(Systemic inflammatory response syndrome，SIRS)。

急性肺损伤(Acute lung injury,ALI)不是一个独立的疾病，SIRS、ALI、ARDS(acute respiratory distess syndrome, ARDS)是严重损伤引起的全身炎症瀑布反应发展过程中的不同阶段。

肺脏是炎症反应首位受损的靶器官[1]。

ALI的实质是SIRS在肺部的体现。

脾脏作为机体最大的外周淋巴器官，既是免疫反应及产生免疫效应物质的重要基地，又是血液的过滤器。

在SIRS时，脾脏发挥其免疫和免疫调节作用调控疾病的发展方向，同时也是炎症反应的靶器官之一。

已证明氧化应激在ALI时肺外脏器的损伤中发挥重要作用。

本研究通过观察ALI大鼠血浆和脾脏的SOD 、MDA、 NO及其光、电镜结构改变以了解ALI对脾脏的影响，并为 ALI 导致远隔器官损伤进一步提供试验依据。

1 材料和方法
1.1 试剂与仪器微量输液泵(Graseby 3500)，BL-420生物信号采集系统 (成都泰盟科技),手动玻璃匀浆器，紫外分光光度计 (S22-PC，上海棱光仪器厂)，高速冷冻离心机(HITACHI20PR-52D)，Olympus BX50-32E01型光镜, JEM100CX-Ⅱ型透射电镜；油酸(上海清明化工厂生产)、丙二醛(MDA)、乳酸脱氢酶(LDH)、一氧化氮(NO)试剂盒(南京建成生物工程研究所)。

1.2 动物分组和模型复制健康Wistar大鼠16只，雌雄不拘，体重200～250 g,
由新疆医科大学实验动物中心提供。

实验前禁食12 h,自由进水。

称重后随机分为油酸组(OA组，n=8)和对照组(C组,n=8),所有大鼠以1%戊巴比妥钠7～8 ml/kg 腹腔麻醉后, OA组由大鼠尾静脉注射OA 200 μl/kg(2 min内)复制ALI模型，对照组从尾静脉注入同剂量的生理盐水。

1.3 血气、动脉血压和肺湿/干重(W/D)的检测大鼠麻醉固定后，行右侧颈总动脉
插管测定各观测时点平均动脉压(mean arterial blood pressure, MABP)，取颈动脉血，电极法测PaO2、PaCO2、pH。

处死大鼠，开胸取肺脏，迅速用棉线在气
管根部结扎，剪除气管及食管，肺组织用生理盐水冲洗，滤纸吸干肺表面水分和血液，称重后置于200℃烘干箱内烘干96 h至恒重，称重并计算W/D。

1.4 血浆、脾脏匀浆制备和指标测定取颈动脉血制备血浆(1 000 r/min，离心15 min，取上清)，大鼠处死后迅速剪开腹腔,剥离脾脏,部分留做光、电镜，余称重剪碎加入10倍匀浆液(10 mmol/L Tris-HCl，1 mmol/L EDTA，250 mmol/L蔗糖，pH7.4)，用手动玻璃匀浆器在冰浴中匀浆,取以上10%的组织匀浆,在低温高速离心机(4℃, 3 000 r/min)离心30 min,取上清液，以牛血清白蛋白为标准蛋白，用Lowry法测定蛋白浓度，分装待测。

严格按试剂盒说明书操作测定血浆和脾脏的
酶含量及活性。

采用硝酸还原酶法测定NO,在550 nm波长处测定吸光度A。

SOD活力采用亚硝酸盐显色法,在550 nm波长测定吸光度。

MDA含量测定采用
硫代巴比妥(TBA)法,在532 nm波长测定吸光度。

1.5 脾脏病理学检查取脾脏用10%甲醛固定，常规石蜡包埋，切片，HE染色，Olympus BX50-32E01型光镜观察形态学改变，另取脾脏用2%戊二醛+锇酸双
重固定，丙酮脱水，铅铀双重染色,EPON812双氧树脂包埋超薄斜面切片，
JEM100CX-Ⅱ型透射电镜观察其超微结构。

1.6 统计学处理用SPSS11.0统计软件对数据进行处理，所有数据以均数±标准差表示，各实验数据经方差齐性检验后采用单因素方差分析及LSD检验，检验水准
α=0.05。

2 结果
2.1 血气、MAP和W/D的变化与C组比较， OA组PaO2、pH明显降低
(P<0.01)，PaCO2升高(P<0.01)；OA组MAP较C组降低(P<0.01)，OA组
W/D高于C组(P<0.01),见表1。

表1 血气、MAP和W/D参数的变化组别pHPaO2 (kPa)PaCO2
(kPa)MAPW/DC组7.41±0.0412.15±0.744.63±0.4315.13±1.014.85±0.46OA 组7.11±0.06∗5.07±0.65∗6.13±0.52∗7.88±0.91∗6.76±0.59∗
注：与C组比较, *P<0.01
2.2 血浆 MDA SOD NO变化血浆SOD在OA组较C 组降低(P<0.01)，与C组比较，OA组MDA、NO有所升高(P<0.01),见表2。

表2 血浆SOD、MDA、NO参数的变化组别SOD(U/ml)MDA(nmol/ml)
NO(nmol/ml)C组49.87±2.792.19±0.1830.53±3.58OA组
38.83±3.68∗6.60±0.71∗76.16±4.53∗
注：与C组比较, *P<0.01
2.3 脾脏 MDA SOD NO变化和C组比较，OA组脾脏SOD活性降低(P<0.01)，MDA和NO含量明显升高(P<0.01),见表3。

表3 各组大鼠脾脏SOD、MDA、NO的变化组别SOD(U/mg)MDA(nmol/mg) NO(nmol/mg)C组88.62±8.091.59±0.142.56±0.22OA组
65.06±5.97∗2.78±0.19∗3.19±0.38∗
注：与C组比较, *P<0.01
2.4 脾脏形态学改变光镜下可见：C组脾脏被膜完整，鞘区、生发中心、边缘区和红白髓交界均未见异常(见图1、2)。

OA组有脾脏被膜增厚(见图3)，红髓充血明显，生发中心扩大(见图4)；鞘淋巴细胞增生改变(见图5), 并可见灶状中性白细胞
浸润，红白髓分界欠清晰，红髓吞噬含铁血红素细胞增多(见图6)。

电镜下观察：
脾脏组织中细胞呈不同生长状态，可见淋巴细胞核分裂现象。

C组细胞结构完整，细胞内各种细胞器正常(见图7)，淋巴细胞核膜清楚,内质网结构完整,线粒体丰富,
嵴清楚完整无断裂(见图9)，浆细胞粗面内质网丰富，结构完整无扩张。

OA组淋
巴细胞线粒体轻度水肿，线粒体空泡变(见图8)，OA组浆细胞：粗面内质网扩张，核周隙增宽及线粒体水肿和空泡变。

浆细胞的细胞膜结构不完整，并发现了异常浓缩的细胞核(见图10)。

图1 C组: 脾脏正常被膜(HE 染色×100)
图2 C组: 脾脏正常生发中心(HE 染色×100)
图3 OA组: 脾脏正常被膜(HE 染色×100)
图4 OA组: 脾脏扩大生发中心(HE 染色×100)
图5 OA组:鞘淋巴细胞增生 (HE 染色×100)
图6 OA组: 灶状中性白细胞浸润，吞噬含铁血红细胞素增多(HE 染色×100)
图7 C组: 脾脏淋巴细胞超微结构(×5 400)
图8 OA组: 淋巴细胞超微结构(×8 000)
图9 C组: 浆细胞超微结构(×9 400)
图10 OA: 组浆细胞超微结构(×6 000)
3 讨论
油酸复制ALI动物模型是国内外广泛采用的方法，接近于临床脂肪栓塞的ALI。

本实验中，通过一般情况观察到动物在注射油酸后出现呼吸频率加快，进行性呼吸困难，血气结果表现为PaO2进行性下降，符合ALI血气变化，肺W/D 增高，证明复制ALI模型成功。

人体在代谢过程中产生多种自由基，发挥解毒、清除病原微生物及参与生物合成等生理作用。

但在病理状况下，自由基产生和清除失衡，过量的自由基则作为致病因子损伤组织和细胞。

研究认为氧化应激损伤在ALI的发生发展中占重要地位[2,3]。

本研究观察了ALI早期抗氧化酶SOD、NO和脂质过氧化代谢产物MDA在血浆
和脾脏的变化。

结果发现OA组SOD较C组降低，分析其主要可能原因：(1)ALI 时，黄嘌呤/黄嘌呤氧化酶系统被激活，多形核中性白细胞(PMN)的“呼吸爆发”
通过膜上NADPH氧化酶等途径产生了过量的氧自由基，作为超氧阴离子的清除
剂以保护细胞免受自由基的损伤，SOD被过量生成的消耗。

(2)组织的缺血缺氧使SOD的合成障碍，从而使SOD活性下降。

SOD活性的降低将导致过多的不能被
清除而在体内蓄积，有研究认为OA型ALI大鼠肺内自由基种类可能主要是通过
多种机制造成肺脏以及包括脾脏在内的任何远隔器官的组织细胞损伤，包括：(1)
膜脂质过氧化，蛋白质、酶和DNA损伤。

(2) 激活更多的PMN，促进炎症介质和补体的释放，进一步参与组织损伤。

NO是一种气体自由基分子，由一氧化氮合酶(nitric oxide synthase，NOS)催化
L-精氨酸生成。

现认为NO在ALI时发挥重要作用[4]。

本实验发现，注射OA后NO含量在血浆和脾脏均升高。

其原因可能是诱导性NO合酶(Inducible NOS,
iNOS)被炎性介质和参加防御反应的细胞因子诱导释放大量NO。

有研究[5]认为TNF-ɑ、IL-1等刺激多种免疫活性细胞,使iNOS表达增高释放NO。

在ALI早
期,TNF-ɑ、IL-1作为最重要的前炎性因子显著增多。

脾脏具有丰富的血管内皮细
胞和巨噬细胞；ALI时PMN重新分配，本研究中电镜下可见脾脏有PMN浸润等因素可能是NO升高的原因。

Muzaffar等[6]发现，低氧可以使内皮源性NO合
成酶(endothelial NOS，eNOS)表达增加。

因此，血压降低，各种因素引起的组
织缺血缺氧等条件也可能是使eNOS上调而释放NO。

NO既是细胞毒性分子又
是信使分子，血浆和脾脏中NO含量升高直接或间接参与组织细胞局部损伤，影
响机体的免疫功能。

直接因素：(1)与产生毒性更强的过氧亚硝基化合物(ONOO-)；
(2)引起血管过度扩张、血压下降，引起血管通透性改变，使血流淤滞、组织利用
氧减少、促发组织缺氧；(3)使蛋白质巯基亚硝基化，影响蛋白质磷酸化以及膜离
子通道功能和酶的活性，导致能量代谢障碍。

间接因素体现在NO对炎性介质基
因表达调控方面，如NO可上调TNF-ɑ、IL-8。

过多的等氧自由基攻击生物膜磷脂中的多聚不饱和脂肪酸，引发脂质过氧化反应并产生脂质过氧化代谢产物MDA，脂质过氧化反应和脂质过氧化物的分解产物都能引起细胞膜结构受损、炎症介质大量释放。

MDA含量的多少反映脂质过氧化物程度，间接评价细胞、组织受损程度[7]。

本研究观察到OA组血浆和脾脏中MDA
含量升高证明了ALI时脾脏的组织细胞因遭受自由基的攻击而受损。

SOD活性下
降和NO含量升高是MDA含量升高的重要原因之一。

周其全等[8]研究发现，在失血性休克的早期脾脏功能和免疫细胞结构出现了明显
改变，而在ALI时，关于脾脏结构变化未见报道。

本研究对脾脏的形态进行观察
后发现：光镜下器官充血，鞘淋巴细胞增生，中性白细胞浸润和生发中心异常；电镜下可见内质网扩张，线粒体水肿和空泡样变，这些改变证明在ALI的早期脾脏
的结构发生了不同程度的损伤，氧化应激损伤可能是其原因之一。

参考文献:
【相关文献】
[1] Peruzzi WT, Franklin ML, Sgapiro BA, et al. New concepts and therapies of adult respiratory distress syndrome[J]. Cardiothorace Vasc Anesth, 1997,11(6): 771-786. [2] Christofidou-Solomidou M, Muzykantov VR. Antioxidant strategies in respiratory medicine[J]. Treat Respir Med,2006,5(1):47-78.
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[8] 周其全, 陈玉魁.失血性休克对脾脏免疫功能和超微结构的影响及脾脏在MOF中的可能作用[J]. 中国病理生理杂志,2001,17(11):1120.。