羟基蛋氨酸铁(铜、锰、锌)螯合率的测定长沙兴嘉生物工程有限

羟基蛋氨酸铁(铜、锰、锌)螯合率的测定
长沙兴嘉生物工程质检中心
氨基酸微量元素螯合物的生物利用率比无机离子的利用率高2~3倍，使用氨基酸微量元素螯合物是解决过量添加无机盐造成环境污染这一难题的有效方法，同时也防止了无机盐产生的不良妨碍及对维生素的拮抗作用。

但氨基酸微量元素螯合物在饲料生产中应用还对比滞后，其缘故除了价格因素外，缺乏适宜的质量检测方法，也是推广应用的一个重要障碍，目前在产品标签保证值中大多仅明示矿物元素和氨基酸的百分含量，用户无法客看地评价螯合物产品质量。

本研究旨在为羟基蛋氨基酸螯合物的质量检验提供一种简便有用的方法。

1原理
试样经加热溶解、离心不离，分成沉淀态螯合元素、可溶性螯合元素及游离态金属离子。

可溶性螯合元素及游离态金属离子通过凝胶色谱，在规定条件下洗脱，实现可溶性螯合态金属元素和游离态金属离子的不离，从而可分不测得螯合态金属元素和游离态金属离子的含量，分不用原子汲取光谱法测定沉淀态螯合元素、可溶性螯合元素及游离态金属离子的含量，即可计算出相应的氨基酸螯合物的螯合率。

2试剂和材料
实验用水应符合GB6682中三级用水的规格，使用试剂除特不规定外，均为分析纯。

克拉克—鲁布斯〔Clark—lubs〕缓冲溶液的配制
—鲁布斯〔Clark—lubs〕缓冲液的配制
分不量取 1.0mL氢氧化钠(0.1mol/L)溶液,12.5mL硼酸(0.4mol/L)溶液，12.5mL氯化钾(0.4mol/L)溶液，注进100mL容量瓶，稀释至刻度。

—鲁布斯〔Clark—lubs〕缓冲液
分不量取20.8mL氢氧化钠(0.1mol/L)溶液,12.5mL硼酸(0.4mol/L)溶液，12.5mL氯化钾(0.4mol/L)溶液，注进100mL容量瓶，稀释至刻度。

—鲁布斯〔Clark—lubs〕缓冲液
分不量取43.7mL氢氧化钠(0.1mol/L)溶液,12.5mL硼酸(0.4mol/L)溶液，12.5mL氯化钾(0.4mol/L)溶液，注进100mL容量瓶，稀释至刻度。

2.2乙二胺四乙酸二钠溶液[C(EDTA)=0.1mol/L]。

称取37.2g乙二胺四乙酸二钠加热溶于100mL水中。

2.3葡聚糖凝胶〔G-15〕
2.4盐酸〔1+10〕
3仪器
3.1恒温水浴锅30~80℃可调
3.2原子汲取分光光度计波长范围190~900nm
3.3离心机转速能到达3000r/min。

3.4色谱柱300×9mm
4测定步骤
4.1试样预处理
称取试样约0.5g，精确到0.0002g，置于25mL离心管中，参加15mL水，于60℃水浴中，加热30min，不时搅拌，使试样充分溶解，于2500r/min离心10min。

将上清液小心移进25mL容量瓶中，沉淀用4mL×3热水〔60℃〕洗涤，离心，上清液一并移进25mL容量瓶中，定容，得可溶性螯合态金属元素溶液，称为A液。

沉淀用10mL盐酸溶液〔2.4〕溶解，转进25mL容量瓶中，用水稀释至刻度，得沉淀态螯合态金属元素溶液，称为B液。

4.2凝胶色谱柱的制备
称取约10gG-15凝胶，配制成适当粘稠的悬浮液，静置3h，沿玻璃棒将排尽气泡的凝胶悬浮液一次倾进色谱柱内，待凝胶全部倾进柱内后，开启柱下面的出口开关，流出液体，使凝胶自然沉落。

操纵凝胶局部长度在15~20cm。

开启柱下部出口开关，用约50mLpH7.0的洗脱液洗涤凝胶色谱柱。

4.3上样
排出洗脱液至凝胶外表近于流干，关闭出口开关；用移液管移取0.2mL溶液A，吸管口离床外表约1mm，小心参加样品液，使之均匀渗进床外表；翻开出口开关，使样品流进凝胶床，用少量洗脱液小心洗涤柱壁四周及残留在床外表的样品；注进洗脱液，测定Cu、Fe、Zn的螯合物时，用pH9.0硼酸洗脱液；测定Mn的螯合物时，用pH10.0硼酸洗脱液。

4.4洗脱不离
用相应pH的洗脱液洗脱，流速为0.7mL/min，收集洗出组分约100mL，定容至100mL，得可溶性螯合金属元素溶液，称为C液。

可溶性螯合金属元素不离完成后，在凝胶柱顶端用吸管移进1mLEDTA(2.2)溶液，用pH7.0硼酸洗脱液接着洗脱，合并所有洗出组分，定容至100mL，得游离态金属离子溶液，称为D液。

5测定
将上述A液、B液、C液、D液稀释至一定浓度〔稀释倍数视含量而定〕，按GB/T13885上机测定，分不测定溶液中金属元素的含量。

6螯合率的计算
氨基酸螯合物螯合率按式(1)计算：
X=
(1)
式中：X—氨基酸螯合物螯合率%；
m a、m b、m c、m d—分不为A、B、C、D溶液中金属离子的含量(ug/mL)；
V a、V b、V c、V d—分不为A、B、C、D溶液的体积(mL)。

7、结果及讨论
选用的凝胶树脂应是惰性的、不与溶质分子发生反响，可反复使用不改变其凝胶性能；尽可能低的电荷，以免发生离子交换反响；足够高的机械强度。

因此，我们选用葡聚糖凝胶树脂。

本实验是进行组分不离，关于分配系数差异较大的物质的不离，通常选用交联度大的葡聚糖凝胶树脂。

依据被不离物的分子量，我们选用G15葡聚糖凝胶树脂。

7.2.1流淌相的选择
本实验中流淌相的作用是推动被不离物质通过色谱柱，如今各组分的通过色谱柱移动的速率因分子的大小不同而各异，因此，流淌相应选用不与被不离物质反响的惰性水溶液。

本实验选用克拉克—鲁布斯〔Clark—lubs〕缓冲溶液即硼酸-氢氧化钠-氯化钾组成的缓冲体系。

7.2.2洗脱液pH的选择
配制不同pH值的硼酸缓冲液作为洗脱液，吸取铁、铜、锰、锌标准溶液并调整其pH，分不过柱，洗脱、定容得C液。

参加EDTA溶液，用pH=7的缓冲液作为洗脱液，洗脱，得D液，分不测定C液、D液中金属离子浓度，测定过柱后的溶液回收率。

以确定不离可溶性螯合元素及游离态金属离子的最正确pH。

表1不同pH值时的不离效果〔以回收率表示%〕
ph值
项目
Fe C液0 0 0 0 D液
Cu C液0 0 0 0 D液
Mn C液0 0 D液
Zn
C液 3.9 0 0 0
D液
由表1可知，在适宜的酸度条件下，金属离子全然被凝胶柱吸附，游离金属离子不能通
过不离柱。

参加EDTA溶液后，金属离子可全部洗出。

7.3方法的适用性
测定不同生产厂家的产品，考察方法的适用性。

表2不同厂家的产品螯合率测定值〔n=3〕
试样名称测定平均值
羟基蛋氨酸铁2#
羟基蛋氨酸铜
羟基蛋氨酸铁1#
羟基蛋氨酸锰
羟基蛋氨酸锌
7.4周密度测定
分不取氨基酸鳌合物试样平行测定6次，结果如下：
表3氨基酸鳌合物螯合率周密度测定
试样测定值〔%〕平均值〔%〕标准差变异系数〔%〕
羟基蛋氨酸铁93.6,95.2, 90.5,92.6, 93.5,92.1,
羟基蛋氨酸铜99.9,99.8, 99.5,98.7, 99.2,99.4,
羟基蛋氨酸锰86.2,88.5,
87.9,87.5,
羟基蛋氨酸锌93.8,64.5, 93.3,64.7,
7.5方法正确度研究
在螯合率的样品中参加相应的金属离子溶液，测定其螯合率，以考察方法的准确度，每个梯度重复五次，测定结果见表4。

表4金属离子对氨基酸螯合物螯合率测定的妨碍〔n=5〕
项目理论螯合率(%) 实测螯合率〔%〕相对偏差〔%〕羟基蛋氨酸铁
羟基蛋氨酸锰
羟基蛋氨酸锌
由表4可知，测定值全然不受外加金属离子的妨碍。

7.6实验资料统计分析
本中心及另外二个质量操纵良好的实验室对相同的样品进行比对试验，测定结果见表5、6。

各实验室测定资料依据GB6379-1986进行统计分析，以确定测定方法的周密度。

表5羟基蛋氨酸螯合物各实验室测定资料统计
工程
羟基蛋氨酸铁羟基蛋氨酸铜羟基蛋氨酸锰羟基蛋氨酸锌
原始数据
(%)
平均
值(%)
方差
(%)
原始
数据(%)
平均
值(%)
方差
(%)
原始
数据(%)
平均
值(%)
方差
(%)
原始
数据(%)
平均
值(%)
方差
(%)
实验室1
实验室2
实验室3
7.6.1科克伦检验
各试样的科克伦检验统计量分不为：羟基蛋氨酸铁0.3427；羟基蛋氨酸铜0.5539；羟基蛋氨酸锰0.7157；羟基蛋氨酸锌0.02234；依据GB6379-1986可知，当p=3，n=2时，科克
伦检验临界值为0.993〔1%概率水平〕和0.967〔5%概率水平〕，因此在各水平的方差值中，
科克伦检验均未发觉异常值。

7.6.2格拉布斯检验
各试样的格拉布斯检验(Gn)分不为：羟基蛋氨酸铁：Gn=1.095；羟基收氨酸铜：Gn=1.156；
羟基蛋氨酸锰：Gn=1.131；羟基蛋氨酸锌：Gn=1.140。

依据GB6379-1986可知，当n=3时，格拉布斯临界值为1.155(5%概率水平和1%概率水平)，因此，在各水平均值中用格拉布期检验未发觉异常值。

7.6.3总平均值m，重视性r，再现性R的计算
依据GB6379-1986的规定，分不计算各试样的m、r、R，见表6。

表6羟基蛋氨酸螯合物试样的m、r、R
项目羟基蛋氨酸铁羟基蛋氨酸铜羟基蛋氨酸锰羟基蛋氨酸锌
P i 3 3 3 3
m j
r j
R j
7.6.3结论
本次试验重复性变异系数：羟基蛋氨酸铁1.2%；羟基蛋氨酸铜0.8%；羟基蛋氨酸锰2.5%；
羟基蛋氨酸锌1.2%；本次试验再现性变异系数：羟基蛋氨酸铁1.3%；羟基蛋氨酸铜0.8%；
羟基蛋氨酸锰2.6%；羟基蛋氨酸锌1.3%；
以上数据是在有不同实验室参加的非分割水平试验中得出的，未发觉异常值。

综上所述，本
研究方法数据正确可靠，重复性、再现性均能满足日常产品监督检验的要求。

本检测方法采纳中华人民共和国国家标准GB/T13080.2—2005?饲料添加剂蛋氨酸铁〔铜、
锰、锌〕螯合物的测定凝胶过滤色谱法
参考文献
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