生化实验SDS-PAGE

将凝胶后的玻璃板放进槽内
拔梳子
轻拔电泳梳子→用微量进样器点样→每孔约5μl。
4、电泳：
接通电源→稳压→调 节电压为50V（约 8V/cm） →当溴酚蓝 前沿进入分离胶后， 将电压调至120V→待 溴酚蓝下行到距胶末 1cm停止电泳。
电泳仪参数设定操作方法
稳定电压 首先将电压的准确数值输进去，其它电流或功率值要高于正
生物化学实验
生命科学与生物工程学院
主要内容
实验一 DNA的定量测定 实验二 蛋白质的定量测定 实验三 酵母蔗糖酶的提取及其性质的研究 实验四 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳检测蛋白质
生物化学实验
实验三 SDS聚丙烯酰胺凝胶 电泳检测蛋白质
实验目的
1．了解SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳的基本原 理
2．掌握电泳仪的使用方法及凝胶电泳测定 蛋白质相对分子量的操作技术
四、结果与计算
电泳迁移率的计算 标准曲线的制作 待测蛋白质样品相对分子质量的计算
蛋白质样品相对分子质量的计算
五、思考题
1. 在不连续体系SDS-PAGE中,当分离胶加完 后,需在其上加一层水,为什么?
2. 电极缓冲液中甘氨酸的作用? 3. 在不连续体系SDS-PAGE中,分离胶与浓缩
胶中均含有TEMED和AP,试述其作用? 4. 样品液为何在加样前需在沸水中加热几
试剂 用量
30％聚丙 烯酰胺贮 存液
ddH2O
0.5M TrisCl(pH 6.8)
10%SDS
10%AP
TEMED
用滤纸吸干水→倒入浓缩胶→插入梳子→聚合。
凝胶后插梳子
凝胶后插梳子
3、装槽、点样
取出胶板下端胶条→将胶板固定在电泳槽 上（凹板一侧向内）→上下槽装电极缓冲 液至内侧玻板上边约0.4cm →小心取出梳 子。
➢ 因此在电泳时，蛋白质分子的迁移速度则主 要取决于蛋白质分子大小。
实验原理
(3)聚丙烯胺凝胶的生成：
聚丙烯胺凝胶由丙烯酰胺单体（Acr）和N， N’-甲叉双丙烯酰胺（Bis）在催化剂作用下聚 合而成。在具有自由基时，Acr和Bis就会聚合。
引发产生自由基的方法有两种： ①化学法 ②光聚合法
实验原理
常工作值，否则电压不能恒定。 例如：恒定电压为200V 预设电流(100mA, 工作电流+30mA) 通常1V电压≈0.35mA工作电流，200V电压预计工作电流为
70mA，电流再向上加30mA=100mA 预设功率值（20W）：用电压值除以10倍 即 200V÷10≈20W 实际工作电功率=工作电压（V）×工作电流（A）
①化学聚合： 引发剂是过硫酸铵(AP)，催化剂N、N、N’、N’－四甲基 乙二胺（TEMED），它的碱基催化AP产生氧自由基， 激活单体形成自由基，发生聚合。化学聚合形成的凝 胶孔径较小，且重复性好，用来制备分离胶；
②光聚合：
催化剂是核黄素（VB2），在痕量氧存在下，核黄素光 解形成无色基，无色基再被氧氧化成自由基，激活单 体发生聚合。光聚合形成的凝胶孔径较大，且不稳定， 适于制备大孔径Байду номын сангаас浓缩胶。
实验原理
(1)定义
➢ 聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）：是以聚丙 烯胺凝胶作为载体的一种区带电泳。
➢ SDS-PAGE:是在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进
SDS（十二烷基磺酸钠）。
实验原理
(2)SDS的作用
➢ SDS是一种阴离子去垢剂，可与蛋白质结合， 形成SDS-蛋白质复合物。
➢ 由于SDS带有大量负电荷，好比蛋白质穿上 带负电的“外衣”，蛋白质本身带有的电荷 则被掩盖,即消除了蛋白质分子之间电荷差 异。
=200V×0.03A=6W
5、剥胶、染色、脱色：
➢ 将凝胶板取下，方位标记→切去浓缩胶 →剥胶→放入培养皿中→加入染色液，染 色0.5-1h。
➢ 染色完毕后，倒出染色液，并换脱色液23次，直至凝胶的蓝色背景褪尽，蛋白质 区带清晰为止。
剥胶
剥胶
切胶
将胶剥到染料中.用小刀沿着胶边切一小口,用 滴管沾着染料顺着切开小口滴染料.胶片自动从玻板 脱落.
实验原理
(4)SDS－聚丙烯酰胺凝胶的特点
第一、三个不连续性： ①凝胶孔径的不连续； ②缓冲液离子组成及各层凝胶pH的不连续； ③在电场中形成的电位梯度的不连续。 第二、三种物理效应： ①电荷效应； ②分子筛效应； ③浓缩效应。
三、操作步骤
1、蛋白样品的处理： 2、凝胶的制备：
2.1胶板的制备： 2.2分离胶的制备： 2.3浓缩胶的制备： 3、装槽、点样： 4、电泳： 5、剥胶、染色、脱色：
取蛋白样品0.5mg，加入0.01mol/L磷酸缓冲液 （pH7.0）1mL溶解。加入等体积的样品缓冲液，混匀， 在沸水浴中加热3min，待电泳时用于上样。
2.1 胶板的制备
将玻璃板装入、夹紧
将胶板固定在制胶器上，凹板一侧向内
将制胶器旋钮调置1.0、灌胶
将玻璃装入、夹紧、灌胶
2.2 分离胶的制备
1、蛋白样品的处理
（1）低相对分子质量标准蛋白质样品的制备 分装标准蛋白质样品，即每个包装加入200l去离
子水充分溶解，然后分装于200个小塑料离心管。分装 后每份体积10l，每种标准蛋白质的含量为2g, 20℃保存。用时加入等体积的样品缓冲液，混匀，在 沸水浴中加热3min，待电泳时用于上样。
（2）待测蛋白质样品的制备
按下表制备分离胶(T=10%,pH=8.8)
试剂 用量
30％聚丙 烯酰胺贮 存液
ddH2O
1.5M TrisCl(pH 8.8)
10%SDS
10%AP
TEMED
胶灌至距梳子齿下端2cm→灌毕→封上一层水加速聚合 →当胶与水出现清晰界限时表明聚合好。
2.2 浓缩胶的制备
按下表制备浓缩胶(T=5%,pH=6.8)
分钟?